Immobilizacja enzymów na nośnikach sposobem na ukierunkowaną

Immobilizacja enzymów na nośnikach sposobem na ukierunkowaną

Paulina Boliboka, Julita Gembalaa, Magdalena Wujaka, Katarzyna Roszeka, Artur P. Terzyka, Marek
Wiśniewskia, b,*
a
Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń; bInvest-Tech, Toruń
Enzyme immobilization on carriers as a way
of directed modification of biocatalysator properties
Immobilizacja enzymów na nośnikach
sposobem na ukierunkowaną modyfikację
właściwości biokatalizatorów
DOI: 10.15199/62.2016.11.22
A review, with 42 refs., of polymeric enzyme carriers and
nanocarriers (diamond, C tubes, graphene, graphene oxide) and practical uses of the immobilized enzymes.
Przedstawiono problemy i ograniczenia stosowania immobilizowanych enzymów w procesach katalitycznych. Omówiono proces
immobilizacji enzymów jako metodę poprawy
ich stabilności w warunkach przemysłowych
oraz wybrane techniki immobilizacji i nośniki
enzymów.
Ze względu na swoje unikatowe właściwości katalityczne i fizykochemiczne enzymy są wykorzystywane jako biokatalizatory w złożonych
procesach chemicznych. Białka enzymatyczne najwydajniej katalizują
reakcje w warunkach przypominających ich fizjologiczne środowisko.
Dlatego istnieje wiele ograniczeń stosowania enzymów na skalę przemysłową. Pożądany cel, którym najczęściej jest uzyskanie konkretnego
produktu, jest trudny do osiągnięcia, gdyż większość enzymów w postaci
natywnej nie jest przystosowana do funkcjonowania w ekstremalnych
warunkach przemysłowych. W ostatnich latach podjęto wiele prób
poprawy właściwości cennych przemysłowo enzymów. Jednym z nurtów przewodnich w dziedzinie technologii enzymatycznej stała się
immobilizacja enzymów. Sprzyja ona ekonomice procesu, umożliwia
wykorzystanie enzymów w procesach ciągłych, ułatwia ich odzyskiwanie,
wielokrotne użycie bez znaczącej utraty właściwości biochemicznych
oraz, co najważniejsze, poprawia ich stabilność wobec niesprzyjających
warunków środowiska (skrajne temperatury, pH, obecność rozpuszczalni-
Mgr Paulina BOLIBOK w roku 2016 ukończyła
studia na Wydziale Chemii Uniwersytetu Mikołaja
Kopernika w Toruniu. Obecnie jest uczestnikiem studiów drugiego stopnia na kierunku
chemia kosmetyczna na tym samym wydziale.
Specjalność – zastosowanie immobilizowanych
enzymów na nośnikach węglowych.
2254
ków organicznych). Duży wybór nośników (naturalne, syntetyczne, mieszane) i różnorodność technik (adsorpcja, inkluzja, mikrokapsułkowanie,
wiązanie kowalencyjne, sieciowanie) dają możliwości ukierunkowanej
modyfikacji katalitycznych i fizykochemicznych właściwości enzymów.
Najczęściej przytaczanymi w literaturze korzyściami modyfikacji właściwości enzymów są wzrost aktywności i powinowactwa do substratu,
zwiększona odporność na denaturację termiczną i stabilność w szerokim
zakresie pH, ukierunkowana enancjoselektywność oraz wydłużony okres
półtrwania enzymu. Immobilizowane biokatalizatory znajdują zastosowanie m.in. w przemyśle spożywczym (produkcja syropów glukozowo-fruktozowych), tekstylnym (wybielanie tkanin), farmaceutycznym (synteza
leków), w utylizacji odpadów (konwersja trujących pochodnych fenoli)
oraz medycynie (konstrukcja biosensorów).
Podstawy procesu immobilizacji enzymów
Enzymy to biokatalizatory, które przyspieszają reakcję chemiczną
poprzez obniżenie jej energii aktywacji, nie wpływając na jej stan
równowagi. Istotną właściwością enzymów jest wysoka specyficzność do substratu lub grupy podobnych strukturalnie substratów, co
decyduje o selektywności reakcji i ogranicza powstawanie produktów
ubocznych. Stosowanie enzymów na skalę przemysłową często wiąże
się z wysokimi kosztami ich wyodrębniania oraz problemem ich
niestabilności w warunkach innych niż naturalne. W ostatnich latach
immobilizacja nabrała nowego znaczenia w technologii enzymatycznej, bowiem zwrócono uwagę na możliwość modyfikacji właściwości
fizykochemicznych i kinetycznych biokatalizatorów poprzez ich unieruchomienie na odpowiednio zsyntetyzowanych i/lub sfunkcjonalizowanych podłożach1–4).
Julita GEMBALA w roku 2016 ukończyła studia pierwszego stopnia na Wydziale Biologii
i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Mikołaja
Kopernika w Toruniu. Obecnie w ramach studiów magisterskich kontynuuje naukę na kierunku biotechnologia na tym samym wydziale.
Specjalność – zagadnienia modyfikacji właściwości enzymów poprzez ich immobilizację.
95/11(2016)
W organizmach żywych enzymy mogą występować w formie
rozpuszczalnej lub być związane z białkowo-lipidowymi błonami
biologicznymi. Biokatalizatory immobilizowane na hydrofobowych
lub hydrofilowych podłożach nawiązują do układów przestrzennych
tworzonych przez białka zakotwiczone w błonie komórkowej. Taki
układ stabilizuje konformację i aktywność enzymu. Zatem immobilizacja enzymu pozwala na wytworzenie takich warunków, które
przypominają naturalne środowisko komórki2).
Termin „immobilizowany enzym” został wprowadzony w 1971 r.,
co wydaje się stosunkowo późno, zważywszy, że już w 1916 r. Nelson
i Griffith przeprowadzili immobilizację inwertazy z drożdży2, 5).
Istnieją również inne prace opisujące unieruchamianie enzymów,
jednak zostały one niedocenione i pominięte prawdopodobnie dlatego,
że były publikowane w czasopismach nie związanych z dziedziną
biotechnologii1). W latach sześćdziesiątych XX w. nastąpił znaczący
wzrost zainteresowania tematem immobilizacji enzymów. Pierwsze
badania w tamtym okresie dotyczyły wytwarzania L-aminokwasów,
np. L-asparaginianu z udziałem immobilizowanej aspartazy z E. coli,
a w późniejszych latach produkcji L-aminokwasów z ketokwasów
w reaktorach membranowych1, 2).
Obecnie jednym z głównych nurtów badań białek enzymatycznych
jest modyfikacja, doskonalenie i optymalizacja ich wydajności jako
komercyjnych biokatalizatorów3). Wielką zaletą enzymów jest ich
pozyskiwanie z odnawialnych, naturalnych źródeł oraz biodegradowalność. Z tego powodu procesy oparte na enzymach są ekonomiczne
i przyjazne środowisku, generują mniej odpadów oraz są bardziej
opłacalne w porównaniu z konwencjonalnymi metodami chemii
organicznej. Inną zaletą immobilizowanych enzymów jest możliwość
katalizy reakcji zarówno w łagodnych warunkach (fizjologiczne pH,
temperatura bliska temperaturze optymalnej enzymu), jak i w warunkach przemysłowych (skrajnie kwaśne lub zasadowe środowisko,
wysokie temperatury, środowisko bezwodne). Enzymy, w przeciwieństwie do odczynników chemicznych, są wysoce specyficzne
oraz selektywne pod względem katalizowanej reakcji i substratu.
W rezultacie biokataliza stała się ważną technologią w przemyśle
spożywczym (hydroliza laktozy, sterylizacja mleka, klarowanie soków,
produkcja win, przetwórstwo owoców, zmiękczanie mięsa, piekarnictwo), w medycynie (testy diagnostyczne, produkcja leków, witamin),
w przemyśle papierniczym (bielenie pulpy drzewnej) i tekstylnym
(zmiękczanie i utrwalanie tkanin) oraz w utylizacji toksycznych substancji, w tym konwersji pochodnych ropy naftowej3, 6).
Unieruchomienie enzymów niesie możliwość katalizy reakcji
prowadzonych w rozpuszczalnikach organicznych, wprowadzenia
korzystnych modyfikacji właściwości katalitycznych i fizykochemicznych oraz ich zastosowania w procesach ciągłych na skalę
przemysłową. Immobilizacja enzymów ma na celu uzyskanie jak
największej ilości produktu docelowego w krótkim czasie, ograniczając równocześnie syntezę produktów ubocznych. W przypadku stosowania immobilizowanych enzymów w procesach ciągłych,
otrzymany produkt końcowy może być z łatwością wyodrębniony
ze środowiska reakcyjnego, a immobilizowany enzym może zostać
powtórnie użyty w bioprocesie. Zmodyfikowane właściwości enzymu
i jego ponowne użycie prowadzą do wyższej wydajności katalitycznej,
która z kolei określa koszt pozyskania enzymu7).
Dr Magdalena WUJAK w roku 2010 ukończyła studia na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi
Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu.
W 2015 r. uzyskała stopień doktora nauk biologicznych na Wydziale Biologii i Ochrony
Środowiska UMK i obecnie pracuje jako asystent
w Zakładzie Biochemii tej uczelni. Specjalność
– immobilizacja enzymów na nowoczesnych
nośnikach nanostrukturalnych, poszukiwanie
nowych niskocząsteczkowych modyfikatorów
aktywności enzymatycznej kinazy adenylanowej
oraz wyjaśnienie roli tego enzymu w rozwoju
niektórych chorób układu oddechowego i sercowo-naczyniowego.
95/11(2016)
W ostatnich latach obserwuje się zainteresowanie metabolitami pochodzenia naturalnego, takimi jak alkaloidy indolowe (cytostatyki w terapiach
nowotworowych), lub kwas rozmarynowy (substancja przeciwbakteryjna,
przeciwwirusowa, przeciwutleniacz)2). Najnowsze badania skupiają się na
syntezie wybranych enancjomerów związków (kluczowych w syntezie
leków), regeneracji kosztownych kofaktorów (stanowiących ograniczenie
kosztów biokatalizy reakcji typu redoks) oraz wykorzystania enzymów
jako biosensorów w analizie biochemicznej6). Modelowym przykładem
enzymatycznego biosensora są komercyjnie dostępne paski testowe do
weryfikacji próbek biologicznych, jak mocz lub krew3). Enzymy używane
do badań analitycznych muszą spełniać wiele rygorystycznych wymagań,
takich jak duża czystość, stabilność, selektywność oraz odpowiednie właściwości powierzchniowe uniemożliwiające ich agregację. Zastosowanie
immobilizacji umożliwia optymalizację tych właściwości enzymów pod
kątem konkretnych zastosowań analitycznych3, 6).
Rodzaje nośników
Proces immobilizacji opiera się na utworzeniu nierozpuszczalnego
kompleksu i unieruchomieniu biokatalizatora na materiale nośnym.
Określenia „nośnik”, „matryca”, „podłoże” mogą być używane zamiennie1–3, 8). Wybór matrycy ma zasadnicze znaczenie w procesie immobilizacji, gdyż warunkuje wydajność reakcji, a także aktywność katalityczną
biokatalizatora2). Z biotechnologicznego punktu widzenia pożądane
cechy nośnika to mechaniczna wytrzymałość, biozgodność, możliwość
regeneracji, odporność na atak drobnoustrojów oraz dostępność przy jednocześnie niskich kosztach2, 3). Nośnik służy stabilizacji enzymu, a więc
powinien posiadać jak największą powierzchnię dostępną dla cząsteczek
biokatalizatora. Powierzchnia, objętość, forma, kształt, porowatość, wielkość porów, stabilność w warunkach reakcji oraz koszt nośnika wpływają
na jego szerokie wykorzystanie. Szczególnie ważna jest cena matrycy
w odniesieniu do ogólnych wydatków procesu. Znaczna oszczędność jest
możliwa, jeśli nośnik może być użyty wielokrotnie. Wyjątkiem może być
produkcja na małą skalę substancji o wysokiej jakości (np. do zastosowań
medycznych), gdzie dopuszcza się stosowanie drogich nośników2, 3).
Istotą unieruchomienia enzymu z użyciem nośnika jest oddziaływanie pomiędzy grupami funkcyjnymi biokatalizatora i matrycy2). Białko
enzymatyczne jest zbudowane z aminokwasów, które zawierają różne
grupy funkcyjne, takie jak np. aminowa w lizynie, tiolowa w cysteinie lub hydroksylowa w serynie. Podczas związania grupy czynnej
matrycy, np. aldehydowej z grupą aminową enzymu, powstaje silne
połączenie kowalencyjne3). Powinowactwo i rodzaj wiązań determinują trwałość, a także odwracalność układu. Układ odwracalnej adsorpcji,
z dominującymi słabymi wiązaniami fizycznymi, gwarantuje mniejszą
trwałość niż ten utworzony przez silne wiązania kowalencyjne1).
W niektórych przypadkach nie jest możliwe związanie enzymu bezpośrednio z nośnikiem. Ich połączenie wymaga dodatkowej substancji,
która musi posiadać minimum dwie grupy chemiczne, jedną uczestniczącą w wiązaniu nośnika, a drugą w wiązaniu enzymu (np. karbodiimid)6). Niektóre podłoża są wzbogacone w dodatkowe związki, takie
jak magnetyczny tlenek żelaza. Nośniki magnetyczne umożliwiają
odzyskanie immobilizowanego preparatu enzymatycznego z reaktora
poprzez zastosowanie pola magnetycznego bez konieczności dekantacji, wirowania lub filtracji7). Innym dodatkiem może być ditlenek
Dr Katarzyna ROSZEK w roku 1998 ukończyła studia na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi
Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu.
W 2006 r. uzyskała stopień doktora na tym
samym wydziale. Obecnie pracuje jako adiunkt
w Zakładzie Biochemii UMK. Specjalność – enzymologia, hodowle komórek in vitro, badania
cytotoksyczności.
2255
manganu, który usuwa wytwarzany przez oksydazy nadtlenek wodoru
lub ditlenek tytanu chroniący enzym przed oksydacyjną inaktywacją7).
Istnieje wiele kryteriów podziału matryc, takich jak podział ze
względu na strukturę (porowatość), sposób syntezy, potrzebę aktywacji, rodzaj grup reaktywnych na powierzchni matrycy lub powinowactwo do wody. Najczęściej stosowany jest podział ze względu na
pochodzenie związku. Matryce nieporowate są pozbawione ograniczeń
dyfuzyjnych, dlatego ich użycie jest szczególnie zalecane w przypadku
wielkocząsteczkowych substratów. Z kolei użycie porowatych nośników gwarantuje związanie enzymu na większej powierzchni (tzw.
pojemność sorpcyjna matrycy), ochronę przed wpływem warunków
środowiska oraz kontrolowany przepływ substancji dzięki możliwości
zmiany wielkości porów1). W celu efektywnego związania białka
i poprawy właściwości fizykochemicznych matryca może być poddana
aktywacji i modyfikacji. Pokrywając nośnik polimerami zwiększającymi jego ładunek powierzchniowy (stosowanymi szczególnie w warunkach dużej siły jonowej), można ograniczyć desorpcję enzymu2).
Ze względu na wielkość nośnika rozróżnia się nośniki polimerowe
(obejmujące polimery naturalne i syntetyczne) oraz nanonośniki1, 4).
Nośniki polimerowe
Polimery naturalne to głównie nierozpuszczalne w wodzie polisacharydy (celuloza, chitozan, karagenian, alginian, skrobia) i białka (kolagen,
albumina, żelatyna). Są one szeroko stosowane m.in. do produkcji
L-aminokwasów3, 9). Celuloza jest najtańszym polimerem używanym
jako nośnik do immobilizacji enzymów, w dodatku obficie występującym
w naturze. Grupy hydroksylowe glukozy mogą tworzyć liczne wiązania
kowalencyjne z aminokwasami na powierzchni enzymu4). Karagenian jest
polisacharydem izolowanym z czerwonych alg. Dzięki właściwościom
żelującym i dużej zdolności wiązania białek jest często stosowany
jako matryca10). Chitozan (pochodna chityny) jest materiałem o dużej
zgodności biologicznej, pochodzącym z grzybów, mięczaków i owadów.
Do procesu immobilizacji enzymów jest stosowany w postaci hydrożeli
przede wszystkim w metodach opartych na kowalencyjnym i jonowym
sieciowaniu enzymów. Wadą tego nośnika jest mała odporność na
uszkodzenia mechaniczne, które jednak można ograniczyć przez łączenie
go z kolagenem. Kolagen jako matryca doskonale mocuje komórki,
jednak jest drogi w eksploatacji4). Alginian jest powszechnie stosowanym
nośnikiem w formie żelu alginianu sodu lub wapnia. Jest otrzymywany
z glonów morskich, a swoją żelową formę zawdzięcza jonom dwu –
i trójwartościowym. Razem z agarozą jest powszechnie wykorzystywany
w kapsułkowaniu, a wielkość jego porów zależy od proporcji stężeń kwasu
glukuronowego do kwasu mannuronowego. Ze względu na możliwość
wielokrotnego użycia, oba związki są często stosowane w bioprocesach4).
Do polimerów syntetycznych zaliczane są m.in. silikony, polimery
winylowe (polistyren, poliakrylonitryl, kwas poliakrylowy), żywice (akrylowa, poliuretanowa, fenoloformaldehydowa), poliamidy (nylon) i ich
pochodne. Żywica akrylowa (np. Amberlite XAD-7) jest wykorzystywana
na skalę przemysłową w immobilizacji lipazy pochodzącej z grzyba
Candida antarctica (CaLB), znanej jako Novozym 435. Dodatkowo powleczona warstwą silikonu wykazuje większą trwałość i wytrzymałość2, 8).
Poli(chlorek winylu) zapobiega denaturacji cieplnej enzymu, a mikrocząstki żywicy poliuretanowej zwiększają pojemność matrycy i wydajność
enzymu11). Niewątpliwą zaletą polimerów syntetycznych jest możliwość
aaa
2256
Prof. dr hab. Artur P. TERZYK w roku 1991 ukończył studia na Wydziale Chemii Uniwersytetu
Mikołaja Kopernika w Toruniu. W 1995 r. uzyskał
stopień doktora, a w 2005 r. stopień doktora
habilitowanego na tym samym wydziale. Od
2007 r. jest profesorem UMK i pracuje w Katedrze
Chemii Materiałów, Adsorpcji i Katalizy Wydziału
Chemii. W 2012 r. uzyskał tytuł profesora nauk
chemicznych. Specjalność – adsorpcja i kinetyka adsorpcji substancji biologicznie czynnych
z fazy ciekłej na węglach aktywnych, adsorpcja
na nanorurkach węglowych.
ich doskonalenia jako nośników do immobilizacji, np. wprowadzenia
dodatkowych grup funkcyjnych lub modyfikacji już istniejących. Struktura
polimerów w zależności od zapotrzebowania może być sztywna lub elastyczna, a ich powierzchnia może być porowata lub gładka6).
Innowacją w immobilizacji enzymów stały się tzw. inteligentne polimery. Zmieniają one swoją konformację nie w wyniku działania na nie
określoną substancją, ale poprzez czynniki środowiskowe (pH, temperatura, siła jonowa). Modelowe przykłady to termowrażliwy poli(N-izopropyloakryloamid) oraz czuły na pH kwas poliakrylowy. Zaletą „inteligentnych
polimerów” jest możliwość precyzyjnej kontroli ich modyfikacji poprzez
bodziec termiczny lub zmianę pH12). Najczęściej stosowanymi polimerami
są te ulegające polimeryzacji poprzez bodziec termiczny. Jednakże wysoka
temperatura i warunki polimeryzacji mogą powodować denaturację
biokatalizatora. Innym przykładem jest aktywacja glikolu polietylenowego
przez promieniowanie ultrafioletowe UV, wykorzystywanego następnie
jako nośnik w procesach oczyszczania ścieków11).
Nanonośniki
Obserwowany w ciągu ostatnich dziesięcioleci gwałtowny rozwój nanotechnologii przyniósł opracowanie mnóstwa nowych
nośników. Nanomateriały definiuje się jako materiały, których
co najmniej jeden wymiar mieści się w przedziale 1–100 nm.
W porównaniu ze związkami o cząstkach w skali mikro lub makro,
nanocząstki odznaczają się dużą wytrzymałością mechaniczną,
a także wyjątkowymi właściwościami powierzchniowymi, które
umożliwiają bardziej efektywne interakcje z wieloma cząsteczkami
biologicznymi13). Ponadto na nanonośnikach można immobilizować
większe ilości enzymów niż na podłożach o większych cząstkach,
ponieważ charakteryzują się one dużą powierzchnią właściwą lub
porowatością powierzchni14, 15).
Ze względu na te właściwości nanomateriały są bardzo atrakcyjne
jeśli chodzi o wykorzystanie w biokatalizie. Łatwość kontroli kształtu
oraz rozmiaru, niskie ceny w porównaniu z cenami większości innych
surowców, a także stosunkowo dużą biozgodność zapewniają nanomateriały węglowe16, 17). Wśród nich warto wyróżnić nanocząstki diamentu18),
jedno- i wielościenne nanorurki węglowe (CNT)19), sadzę18), nanocząstki
węglowe20), grafen21, 22) oraz mezoporowate pianki węglowe23, 24).
Nanocząstki diamentu
Nanocząstki diamentu są interesującym materiałem ze względu
na potencjał do zastosowań biologicznych. Odznaczają się one dużą
stabilnością, odpornością chemiczną, brakiem toksycznego działania
na organizmy żywe oraz biozgodnością. W literaturze można znaleźć
doniesienia o sprzężeniu chemicznie zmodyfikowanej powierzchni
tych nanocząstek z cząsteczkami biologicznymi, takimi jak DNA25) czy
hormony26). Wei i współpr.18) unieruchomili na powierzchni nanocząstek diamentu trypsynę. Immobilizowane białko wykazywało lepsze
właściwości katalityczne, wyższą stabilność w czasie oraz odporność na działanie kwasów, zasad, a także etanolu. Unieruchomienie
β-galaktozydazy na materiale modyfikowanym aldehydem glutarowym
umożliwiło zachowanie 95-proc. aktywności względem aktywności
białka natywnego27). Według autorów jest to najwyższa wartość, jaką
udało się do tej pory osiągnąć, a niewielkie zmniejszenie właściwości
Dr Marek WIŚNIEWSKI w roku 1998 ukończył
studia na Wydziale Chemii Uniwersytetu Mikołaja
Kopernika w Toruniu. W 2002 r. uzyskał stopień
doktora na tym samym wydziale. Pracuje w Katedrze Chemii Materiałów, Adsorpcji i Katalizy
Wydziału Chemii. Specjalność – fizykochemia
materiałów węglowych.
* Autor do korespondencji:
Wydział Chemii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, ul. Gagarina
7, 87-100 Toruń, tel.: (56) 611-45-07, fax: (56) 654-24-77, email:
[email protected]
95/11(2016)
katalitycznych może wynikać z mniejszej dostępności centrów aktywnych dla substratu.
Ważnym czynnikiem wpływającym na możliwość zastosowania
enzymu na skalę przemysłową jest również jego stabilność w czasie
oraz w różnych warunkach (temperatura, pH). Ansari i współpr. 27)
wykazali, że β-galaktozydaza unieruchomiona na powierzchni nanocząstek diamentu charakteryzuje się stabilnością w szerokim spektrum
zmian zarówno pH, jak i temperatury. Ze względu na te właściwości
oraz możliwość łatwego oddzielenia enzymu od mieszaniny reakcyjnej
otrzymane połączenia są bardzo atrakcyjne do zastosowań na skalę
przemysłową. Jednak nanocząstki diamentu mają jedną, bardzo istotną
wadę, jaką jest koszt ich otrzymania.
Nanorurki węglowe (CNT)
Wśród wielu otrzymanych nanomateriałów węglowych CNT są bardzo obiecującym materiałem, ponieważ ich budowa umożliwia łatwe
odzyskanie nośnika z mieszaniny poprzez zwykłą filtrację15). Ponadto
CNT na tle innych nanocząstek odznaczają się dużą stabilnością środowiskową, łatwością otrzymywania, a przede wszystkim możliwością
przyjęcia większej ilości białka na powierzchnię14).
Z danych literaturowych wynika, że wśród otrzymanych do tej pory
nanomateriałów węglowych to CNT stanowią najbardziej popularny
materiał do immobilizacji takich enzymów, jak m.in. katalaza, lipaza, β-galaktozydaza lub oksydaza glukozy28–31). Zhang i współpr.30)
badali wpływ unieruchomienia katalazy, zarówno na jedno – jak i na
wielościennych CNT. Największe różnice można było zauważyć
w wydajności adsorpcji enzymu na nośniku. Materiałem, na którym
unieruchomiono najwięcej białka były utlenione jednościenne CNT.
Tłumaczy się to obecnością dużej ilości tlenowych grup funkcyjnych
(OH, COOH) na powierzchni nośnika. Najmniejszą ilość katalizatora
zaadsorbowano na powierzchni wielościennych CNT, co mogło być
spowodowane obecnością znacznej ilości mikroporów. Jednak, niezależnie od ilości immobilizowanej katalazy, każda z próbek charakteryzowała się niższą aktywnością niż enzym natywny. Z drugiej strony
powstałe kompleksy wykazywały większe powinowactwo (mniejsze
wartości Km) do substratu niż katalizator nieunieruchomiony. Tłumaczy
się to zmianami w strukturze białka, co zostało udowodnione za
pomocą analizy FTIR30). Z kolei Ansari i współpr.32) określili możliwości wykorzystania połączeń wielościennych CNT z β-galaktozydazą.
Otrzymany kompleks wykazywał mniejszą aktywność niż białko
natywne, w niewielkim stopniu obniżyła się również specyficzność badanego enzymu. Otrzymane kompleksy charakteryzowały się
większą stabilnością działania β-galaktozydazy w szerokim zakresie
pH i temperatury niż enzym natywny. Według autorów32) otrzymane
połączenia z powodzeniem mogą być wykorzystane w procesach
powadzonych na skalę przemysłową, jednak konieczne są dalsze
badania i analizy.
Grafen i tlenek grafenu
Grafen stanowi pojedynczą warstwę atomów węgla upakowanych
w gęstą sieć heksagonalną, podobną do plastra miodu. Oprócz
zastosowań w elektronice i przemyśle półprzewodników grafen,
dzięki dużej powierzchni właściwej, może być wykorzystany do
unieruchamiania molekuł biologicznych, m.in. enzymów i leków
antynowotworowych14). Znane też są prace, w których grafen wykorzystano do budowy biosensorów33). Jednak jest to jeszcze słabo
rozwinięta część nanomedycyny, co stawia wyzwanie przed naukowcami i lekarzami34).
Tlenek grafenu (GO), który może być prekursorem grafenu,
przyciąga duże zainteresowanie środowiska naukowego. Materiał ten
jest również idealnym nośnikiem dla białek i enzymów, ponieważ
charakteryzuje się dużą stabilnością w wodzie oraz dużą powierzchnią
właściwą, na której znajdują się tlenowe grupy funkcyjne. Dzięki temu
proces immobilizacji może być przeprowadzony bez wcześniejszej
modyfikacji powierzchni tego nośnika35–37). GO został użyty jako
95/11(2016)
matryca do unieruchamiania enzymów m.in. w biosensorach, ogniwach biopaliw oraz w systemach celowanego podawania leków38).
Pomimo ogromnego potencjału, jakim dysponuje GO, doniesienia
literaturowe dotyczące jego wpływu na właściwości katalityczne
immobilizowanych molekuł są wciąż nieliczne. Opublikowane wyniki
trudno porównywać między sobą, ponieważ albo dotyczą różnych
cząstek, albo materiał otrzymywano różnymi metodami. Badania nad
oksydazą bilirubiny unieruchomioną na arkuszach GO pozwoliły na
określenie wpływu chemicznej glikozylacji oraz immobilizacji na
właściwości katalityczne enzymu38). Wykazano, że proces glikozylacji
powoduje spadek właściwości katalitycznych enzymu przy jednoczesnym wzroście stabilności termicznej wskutek zmian konformacyjnych
katalizatora. Po unieruchomieniu glikozylowanego enzymu zmiany
te były jeszcze bardziej widoczne. Według autorów, ze względu na
wzrost stabilności, powstałe połączenia mogą znaleźć zastosowanie
w nanobiotechnologii38). Z kolei Zhou i współpr.37) wykazali, że unieruchomienie oksydazy glukozowej (GOD) negatywnie wpływa na jej
właściwości katalityczne. Uzyskane dla immobilizowanego enzymu
wartości Vmax były mniejsze niż wartości osiągane dla katalizatora
natywnego. Jednocześnie wyznaczona wartość Km­ była większa niż
w przypadku natywnej GOD, co wiązało się ze spadkiem powinowactwa do glukozy. W tym przypadku uzyskane wyniki również tłumaczy
się zmianami konformacyjnymi białka. Ponadto unieruchomiona
oksydaza wykazała większą stabilność w czasie niż jej natywny odpowiednik. Pozytywny wpływ immobilizacji enzymu na powierzchni
GO na stabilność jego właściwości katalitycznych wykazali także
Zhang i współpr.39). Udowodnili oni, że unieruchomiona peroksydaza
chrzanowa może zachować swoją aktywność w szerokim zakresie
pH. Dodatkowo wykazywała ona lepszą stabilność w czasie i większą
odporność na działanie podwyższonej temperatury niż enzym natywny.
W publikacji39) jednak brakuje informacji na temat wpływu immobilizacji na samą wartość parametrów kinetycznych. Wei i współpr.40)
skupili się na ukazaniu wpływu GO na konformację katalazy, a co
za tym idzie na jej aktywność. Z pracy wynika, że GO zmniejszył
ilość α-helis w strukturze enzymu, a jednocześnie zwiększył zawartość β-harmonijek, co spowodowało rozluźnienie szkieletu białka,
a w konsekwencji obniżenie zdolności katalitycznej katalazy. Zmiany
te są zależne od stężenia użytego nośnika oraz od czasu inkubacji.
Interesujące jest, że spadku aktywności białka nie należy przypisywać
tylko i wyłącznie zmianom konformacji. Jedną z możliwości, której nie
można wykluczyć jest sytuacja, w której GO atakuje centrum aktywne
enzymu, jednak mechanizm tego zjawiska nie jest znany.
Wybrane metody immobilizacji
Pomimo że pierwsze wzmianki o próbach immobilizacji enzymów
pojawiły się już w 1950 r., to ze względu na różnorodność biokatalizatorów oraz szerokie możliwości ich wykorzystania po unieruchomieniu
nadal nie istnieje jedna, optymalna metoda. Dokonanie jednoznacznej
klasyfikacji metod immobilizacji jest zadaniem bardzo trudnym.
Najprostszym sposobem podziału jest rozróżnienie immobilizacji
z wykorzystaniem rodzaju wiązania do podłoża, co zostało przedstawione w tabeli 1.
W celu związania enzymu z matrycą stosuje się metody chemiczne
wykorzystujące silne wiązania kowalencyjne albo metody fizyczne
polegające na wytworzeniu oddziaływań elektrostatycznych lub słabych wiązań, takich jak wiązanie van der Waalsa i oddziaływania
hydrofobowe2, 9). Należy zaznaczyć różnicę pomiędzy uwięzieniem
enzymu wewnątrz nośnika (inkluzja) a związaniem go z nośnikiem
(adsorpcja). Uwięzienie biokatalizatora zachodzi w trakcie syntezy
matrycy, np. tworzenia żelu. Z kolei związanie enzymu polega na
umiejscowieniu biokatalizatora po wewnętrznej lub zewnętrznej stronie już zsyntezowanej matrycy2, 9). Mikrokapsułkowanie i sieciowanie
to metody pozbawione nośnika. W metodzie mikrokapsułkowania
funkcję struktury odpowiedzialnej za stabilizację przestrzenną enzymu
pełni półprzepuszczalna błona, a sieciowanie polega na wzajemnym
połączeniu cząsteczek enzymu wiązaniami kowalencyjnymi1, 2).
2257
Table 1. Comparison of physical and chemical methods for immobilization of enzymes2, 3, 6, 41, 42)
Tabela 1. Porównanie fizycznych i chemicznych metod immobilizacji enzymów
2, 3, 6, 41, 42)
Metody fizyczne
Właściwości metody
adsorpcja
inkluzja
Mechanizm
związanie
zamknięcie
immobilizacji enzymu z nośnikiem w sieci polimeru
Metody chemiczne
mikrokapsułkowanie
otoczenie
membraną
sieciowanie
(cross-linking)
kowalencyjne
wiązanie
z nośnikiem
utworzenie sieci
związanie
wiązań bez nośnika z nośnikiem
kinetycznych właściwości enzymu
albo zastosowanie bardziej skomplikowanych układów enzymatycznych,
np. całych komórek.
Otrzymano: 23-06-2016
LITERATURA
[1] B.M. Brena, F. Batista-Viera, Meth.
Biotech. 2006, 22, 15.
[2] J. Fiedurek, Podstawy wybranych
słabe fizyczne
silne chemiczne
procesów
biotechnologicznych,
Charakter wiązań
(oddziaływania van der Waalsa, hydrofobowe,
(kowalencyjne)
UMCS, Lublin 2014.
wiązania jonowe i biospecyficzne)
[3] A.A. Homaei, R. Sariri, F. Vianello,
R. Stevanato, J. Chem. Biol. 2013, 6, 4.
Wpływ na strukturę
[4] I. Es, J.D.L. Vieira, A.C. Amaral,
nie
tak
natywną enzymu
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015,
99, 2065.
Odwracalność układu
tak
nie
[5] W. Hartmeier, Immobilized biocatalysts. An introduction, Springer Science
wielkowielko& Business Media, New York 2012.
i mało [6] J. Bryjdak, Wiad. Chem. 2004, 58, 9.
Substraty
małocząsteczkowe i małocząmałocząsteczkowe
cząstecz [7] P. Zucca, E. Sanjust, Molecules 2014,
steczkowe
kowe
19, 9.
[8] J. Synowiecki, S. Wołosowska,
Biotechnologia 2007, 2, 77.
W tabeli 2 zestawiono najpowszechniejsze, niekorzystne i korzyst [9] N. Miletić, A. Nastasović, K. Loos, Bioresource Technol. 2012, 115, 126.
ne, aspekty procesu immobilizacji enzymów w kontekście ich wyko[10] L. O’Sullivan, B. Murphy, P. McLoughlin, P. Duggan, P.G. Lawlor,
H. Hughes, G.E. Gardiner, Mar. Drugs 2010, 8, 7.
rzystania w procesach technologicznych.
[11] S. Datta, L.R. Christena, Y.R.S. Rajaram, 3 Biotech 2013, 3, 1.
[12] A. Utrata-Wesołek, B. Trzebicka, A. Dworak, Polimery 2008, 53, 10.
Podsumowanie
[13] K. Scida, P.W. Stege, G. Haby, G.A. Messina, C.D. García, Anal. Chim.
Acta 2011, 691, 6.
[14] E.P. Cipolatti, M.J.A. Silva, M. Klein, V. Feddern, M.M.C. Feltes,
Istnieje wiele problemów i ograniczeń stosowania układów kataJ.V. Oliveira, J.L. Ninow, D. de Oliveira, J. Mol. Catal. B-Enzym. 2014, 99, 56.
litycznych opartych na immobilizowanych enzymach, które osta[15] N.Z. Prlainović, D.I. Bezbradica, J.R. Rogan, P.S. Uskoković, D.Z. Mijin,
tecznie mogą zadecydować o niskiej wydajności katalizy i całego
A.D. Marinković, C. R. Chimie 2016, 19, 362.
[16] C. Bernal, S. Escobar, L. Wilson, A. Illanes, M. Mesa, Carbon 2014, 74, 96.
procesu technologicznego. Prowadzenie bioprocesów często wiąże
[17] A. de Poulpiquet, A. Ciaccafava, E. Lojou, Electrochim. Acta 2014, 126, 104.
się z wysokimi kosztami zakupu linii produkcyjnych i nośników.
[18] L. Wei, W. Zhang, H. Lu, P. Yang, Talanta 2010, 80, 3.
W wielu przypadkach pojawia się potrzeba zastosowania warunków
[19] T. Miyake, S. Yoshino, T. Yamada, K. Hata, M. Nishizawa, J. Am. Chem.
immobilizacji i bioprocesu, innych niż optymalne warunki dla
Soc. 2011, 133, 13.
[20] K. Szot, J.D. Watkins, S.D. Bull, F. Marken, M. Opallo, Electrochem.
zachowania aktywności i stabilności enzymu. Problem stanowią
Commun. 2010, 12, 6.
również matryce stosowane do unieruchomienia biokatalizatorów,
[21] B. Liang, L. Fang, G. Yang, Y. Hu, X. Guo, X. Ye, Biosens. Bioelectron.
które mogą ulec mikrobiologicznemu zanieczyszczeniu, mecha2013, 43, 131.
[22] W. Zheng, H.Y. Zhao, J.X. Zhang, H.M. Zhou, X.X. Xu, Y.F. Zheng, Y.B.
nicznemu uszkodzeniu lub blokować centrum aktywne enzymu,
Wang, Y. Cheng, B.Z. Jang, Electrochem. Commun. 2010, 12, 7.
hamując tym samym wiązanie substratów4). Rozwiązaniem tych
[23] K. Wang, H. Yang, L. Zhu, Z. Ma, S. Xing, Q. Lv, J. Liao, C. Liu, W. Xing,
problemów może być zmiana matrycy, metody i warunków immoElectrochim. Acta 2009, 54, 20.
bilizacji enzymu, wybranie takiej techniki immobilizacji, dzięki
[24] C.X. Guo, F.P. Hu, X.W. Lou, C.M. Li, J. Power Sources 2010, 195, 13.
[25] K. Ushizawa, Y. Sato, T. Mitsumori, T. Machinami, T. Ueda, T. Ando,
której nastąpi korzystna modyfikacja fizykochemicznych i/lub
Chem. Phys. Lett. 2002, 351, 1.
[26] C.-Y. Cheng, E. Perevedentseva, J.-S. Tu, P.-H. Chung, C.-L. Cheng,
K.-K. Liu, J.-I. Chao, P.-H. Chen, C.-C. Chang, Appl. Phys. Lett. 2007, 90, 16.
Table 2. Advantages and disadvantages of catalytic systems2, 3)
[27] S.A. Ansari, R. Satar, S.K. Zaidi, M.I. Naseer, S. Karima, M.H. Alqahtani,
Tabela 2. Wady i zalety systemów katalitycznych2, 3)
M. Rasool, Food Bioprod. Process. 2015, 95, 298.
[28] N.Z. Prlainovic , D.I. Bezbradica, J.R. Rogan, P.S. Uskokovic, D.Z. Mijin,
Zalety
Wady
A.D. Marinkovic, C. R. Chimie 2016, 19, 3.
[29] N.R. Mohamad, N.A. Buang, N.A. Mahat, J. Jamalis, F. Huyop,
Możliwość ponownego
H.Y. Aboul-Enein, R.A. Wahab, J. Ind. Eng. Chem. 2015, 32, 99.
wykorzystania biokatalizatora
[30] C. Zhang, S. Luo, W. Chen, Talanta 2013, 113, 142.
Zachowanie czystości
Wysokie koszty aparatury,
[31] A.T.E. Vilian, S.-M. Chen, B.-S. Lou, Biosens. Bioelectron. 2014, 61, 639.
[32] S.A. Ansari, R. Satar, S. Chibber, M.J. Khan, J. Mol. Catal. B-Enzym.
biokatalizatora
materiałów (nośniki, bioreaktory)
2013, 97, 258.
Trudności ze znalezieniem
Zmniejszenie ilości produktów
[33] T. Kuila, S. Bose, P. Khanra, A.K. Mishra, Nam H. Kim, J.H. Lee,
wykwalifikowanego personelu
ubocznych
Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 12.
[34] L. Feng, Z. Liu, Nanomedicine 2011, 6, 2.
Niekorzystny wpływ warunków
Większa wydajność procesu
[35] W. Li, H. Wen, Q. Shi, G. Zheng, Process Biochem. 2016, 51, 2.
Łatwa kontrola przebiegu
immobilizacji na funkcję
[36] J. Zhang, F. Zhang, H. Yang, X. Huang, H. Liu, J. Zhang, S. Guo,
i warunków procesu
biokatalizatora
Langmuir 2010, 26, 9.
(pH, temperatura, rozpuszczalnika
(automatyzacja)
[37] L. Zhou, Y. Jiang, J. Gao, X. Zhao, L. Ma, Q. Zhou, Biochem. Eng. J.
2012, 69, 28.
itp.)
Łatwa izolacja produktu
[38] G. Hernandez‑Cancel, D. Suazo‑Davila, A.J. Ojeda-Cruzado, D. GarciaMała odporność mechaniczna
i biokatalizatora
Torres, C.R. Cabrera, K. Griebenow, J. Nanobiotechnol. 2015, 13, 70.
i chemiczna matrycy
Korzystna zmiana
[39] F. Zhang, B. Zheng, J. Zhang, X. Huang, H. Liu, S. Guo, J. Zhang,
J. Phys. Chem. C 2010, 114, 18.
właściwości katalitycznych
„Wyciek” enzymu
[40] X.-L. Wei, Z.-Q. Ge, Carbon 2013, 60, 401.
i fizykochemicznych
Niekorzystne modyfikacje
[41] http://www.yourarticlelibrary.com/biology/enzyme/immobilization-ofwłaściwości katalitycznych
Zastosowanie w procesach
enzymes-methods-effects-on-enzymes-and-ribozymes/33689/, dostęp
ciągłych (reaktory przepływowe)
15 czerwca 2016 r.
[42] http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/immethod.html, dostęp 15 czerWiększa stabilność operacyjna
wca 2016 r.
2258
95/11(2016)