Ćwiczenie 7 ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Ćwiczenie 7
ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Część doświadczalna obejmuje:
− wyznaczenie optimum pH dla reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę
− wyznaczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę
WPROWADZENIE
Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) – „enzym znacznikowy” lizosomów, głównego miejsca
trawienia wewnątrzkomórkowego
Fosfatazy to grupa enzymów należących do klasy hydrolaz (klasa 3 – obejmuje enzymy rozszczepiające wiązania z udziałem cząsteczki wody, Tabela 1), podklasy enzymów
hydrolizujących wiązania estrowe (esterazy), podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforanowych.
Tabela 1. Klasy enzymów (Koolman i Röhm 2005)
1
Fosfatazy katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców,
nukleotydów i wielu innych naturalnych estrów kwasu fosforowego według poniższej reakcji:
R-O-PO3H¯ + H2O
fosfataza
R-OH + H2PO4¯
Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiają także
estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan.
Fosfatazy działają w pH alkalicznym, z optymalnym pH w zakresie 9,0 – 11,0, jak
również w pH kwaśnym i obojętnym, w zakresie 4,5 – 7,0. Te ostatnie są typowe dla komórek
roślinnych, chociaż nie brakuje ich także w komórkach zwierzęcych, gdzie występują przede
wszystkim w lizosomach, niewielkich błonowych pęcherzykach będących głównym miejscem trawienia wewnątrzkomórkowego. Lizosomy zawierają specyficzny zestaw hydrolaz,
optymalnie aktywnych w środowisku kwaśnym, uczestniczących w rozkładzie organelli komórkowych i wszystkich rodzajów makrocząsteczek dostarczanych do komórki różnymi drogami. Wiodącym enzymem jest tu kwaśna fosfataza uznawana za tzw. „enzym znacznikowy” lizosomów. Kwaśne środowisko światła lizosomu (pH ~ 5) jest utrzymywane dzięki
działaniu błonowej H+-ATPazy, pompującej H+ z cytozolu do wnętrza lizosomu (Ryc. 1).
Ryc. 1. Schemat lizosomu (Alberts i wsp. 1999)
W obojętnym pH cytoplazmy (pH 7 – 7,3), hydrolityczne enzymy lizosomalne wykazują niską aktywność. Jest to przypuszczalnie mechanizm obronny przed samoistnym strawieniem
2
komórki, w przypadku, gdyby enzymy dostały się do cytoplazmy. W komórkach roślin i
grzybów rolę lizosomów pełni wakuola komórkowa. Kwaśny odczyn wnętrza wakuoli, istotny dla aktywności występujących tam enzymów hydrolitycznych, jest utrzymywany dzięki
działaniu dwóch pomp protonowych (H+-ATPazy i H+-PPazy) zlokalizowanych w błonie otaczającej wakuolę, tzw. tonoplaście.
Podstawy kinetyki enzymatycznej
Kinetyka enzymatyczna stanowi dział enzymologii zajmujący się zagadnieniami związanymi z szybkością reakcji katalizowanych enzymatycznie. Szybkość reakcji enzymatycznej (V), która jest miarą aktywności, czyli katalitycznego działania enzymu, mierzy się
podobnie jak szybkość reakcji chemicznych. Jest ona w pewnym zakresie proporcjonalna do
stężenia substancji reagujących; wyznacza ją przyrost stężenia produktu reakcji w czasie.
Miarą szybkości reakcji w danym momencie jest więc wzrost stężenia produktu, jaki następuje w jednostce czasu.
Aktywność enzymatyczną wyrażamy w dwóch standardowych jednostkach. Są to:
jednostka enzymatyczna (U) oraz katal (kat). Jednostka enzymatyczna (U) jest to taka
ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w warunkach optymalnych dla danego enzymu. Katal (kat) jest jednostką aktywności enzymatycznej
obowiązującą w układzie SI i jest definiowany jako aktywność katalityczna, która zwiększa
szybkość reakcji o 1 mol na sekundę, w warunkach optymalnych.
Przy stałym stężeniu enzymu i substratu szybkość powstawania produktu reakcji powinna być
wprost proporcjonalna do czasu reakcji. W rzeczywistości tylko w początkowej fazie reakcja
ta jest reakcją pierwszego rzędu (Ryc. 2), co znaczy, że szybkość działania enzymu jest liniową funkcją czasu – jest to tzw. szybkość początkowa reakcji enzymatycznej (V0).
Ryc. 2. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w czasie
3
Należy pamiętać, że w analizach in vitro stężenie substratu maleje w czasie reakcji i przy
dłuższym czasie inkubacji zależność pomiędzy przyrostem produktu, a czasem reakcji nie
będzie funkcją liniową (Ryc. 2). Również enzym w trakcie wykonywania oznaczeń może
ulegać denaturacji, co pogłębia powyższy efekt. Wartość V0 uzyskuje się przez wykreślenie
linii prostej stycznej do początkowego odcinka krzywej, poczynając od czasu zerowego
(Ryc. 2). Nachylenie tej prostej ma wartość V0. Dla badań kinetyki enzymów in vitro niezwykle ważne jest więc określenie czasu reakcji, w którym przyrost produktu reakcji enzymatycznej jest wprost proporcjonalny do czasu.
produkt (µmole)
V0 =
czas (min)
Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od wielu czynników fizycznych i chemicznych, takich jak: stężenie enzymu, stężenie substratu, temperatura, pH, stężenie aktywatorów i inhibitorów. Większość enzymów wykazuje maksymalną aktywność w środowisku o określonym
stężeniu jonów wodorowych (w określonym pH). Wynika to stąd, że w katalizie enzymatycznej biorą udział, między innymi, zjonizowane grupy funkcyjne centrum aktywnego. Odsetek
cząsteczek enzymu, w których grupy kwasowe lub zasadowe znajdują się w formie jonowej,
zależy od pK tych grup i stężenia jonów wodorowych w roztworze. Zależność aktywności
enzymatycznej od pH przyjmuje najczęściej postać krzywej w kształcie dzwonu (Ryc. 3).
Ryc. 3. Zależność aktywności enzymu od pH (Koolman i Röhm 2005)
4
Rozpiętość optimum pH, czyli takiej wartość pH, przy której aktywność jest maksymalna,
jest bardzo duża. Dla wielu enzymów optimum pH znajduje się w pobliżu pH komórki (pH
7,0), ale np. pepsyna (EC 3.4.23.1) występująca w kwaśnym środowisku żołądka wykazuje
najwyższą aktywność w pH około 2,0, a arginaza (EC 3.5.3.1.) w pH powyżej 10,0. Optymalną wartość pH, która jest jedną z wartości liczbowych charakteryzujących dany enzym, wyznacza się z wykresu zależności aktywności od pH.
WYKONANIE
Zasada metody
W ćwiczeniu, do wyznaczenia optimum pH, podobnie jak w wyznaczaniu szybkości
początkowej reakcji, stosuje się metodę, w której naturalny substrat kwaśnej fosfatazy zostaje zastąpiony sztucznym substratem – p-nitrofenylofosforanem (analogiem naturalnego
substratu). Enzym hydrolizując p-nitrofenylofosforan, uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku zasadowym tworzy żółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy.
O
O2 N
O
P
OH + H2O
fosfataza
O2 N
OH + H 3 PO4
OH
p-nitrofenylofosforan (pNPP)
p-nitrofenol (pNP)
Natężenie barwy mierzone przy λ = 405 nm jest proporcjonalne do ilości zhydrolizowanego
substratu. Ryc. 4 przedstawia widmo absorpcyjne p-nitrofenylofosforanu (pNPP) i pnitrofenolu (pNP).
Ryc. 4. Widmo absorpcyjne pNPP i
pNP w środowisku alkalicznym
5
Odczynniki:
1. 8 mM p-nitrofenylofosforan w H2O
2. 0,1M NaOH
3. 0,9% NaCl
4. 0,5 M bufory Tris-octan o pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5
Materiał:
Wyciąg z ziemniaka: obrany i umyty ziemniak zetrzeć na tarce, przesączyć przez warstwę
nylonu. Odstawić do lodówki.
Wyznaczanie optimum pH kwaśnej fosfatazy
Do probówek napipetować po: 0,25 ml 8 mM p-nitrofenylofosforanu i 0,25 ml odpowiedniego buforu, kolejno od pH 4,0 do 6,5. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach dla
każdego pH. Starannie wymieszać zawartość probówek i wstawić je do łaźni wodnej o temp.
300C (preinkubacja). Wyciąg z ziemniaka zawierający kwaśną fosfatazę rozcieńczyć 250x
używając 0,9% roztworu NaCl (w cylinderku miarowym na 25 ml).
Do preinkubowanych prób zawierających napipetowany substrat i bufor dodawać, w
odstępach co 30 sekund, po 0,5 ml rozcieńczonego roztworu enzymu. Próby inkubować 15
minut w temperaturze 300C, po czym reakcję przerwać dodając do każdej z nich po 5 ml
0,1M roztworu NaOH, w odstępach co 30 sekund i w kolejności takiej jak dodawano enzym.
Próbę kontrolną (zerową) wykonać równolegle z próbami badanymi postępując następująco: do probówki napipetować 0,25 ml buforu o pH 5,0 oraz 0,25 ml roztworu pnitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować 15 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1 M roztworu NaOH, a na końcu dodać 0,5 ml enzymu (enzym w takich warunkach nie będzie już działał, ponieważ roztwór zawiera wysokie stężenie
NaOH).
Natężenie barwy zmierzyć wobec próby zerowej przy λ = 405 nm. Wykreślić krzywą
zależności szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyrażoną jako absorbancja przy
405nm) od pH.
Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji
Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji hydrolizy p-nitrofenylofosforanu należy
wykonać używając 4 lub 5 różnych rozcieńczeń wyciągu z ziemniaka (różne stężenie enzymu). Każda para ćwiczeniowa przygotowuje jedno z wybranych rozcieńczeń wyciągu, np.
6
10x, 50x, 100x lub 250x (wyciąg należy rozcieńczyć 0,9% roztworem NaCl w cylindrze miarowym na 25 ml) i wykonuje oznaczenie szybkości początkowej dodając do mieszaniny reakcyjnej wyciąg o określonym rozcieńczeniu (każda para inne rozcieńczenie!).
Do suchych probówek napipetować po 0,25 ml buforu octanowego o pH optymalnym
dla aktywności kwaśnej fosfatazy (zwykle jest to pH 5,5) i 0,25 ml roztworu substratu (próby
wykonać w dwóch powtórzeniach). Każda próba zawiera zatem po 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej o pH optymalnym dla fosfatazy kwaśnej. Próby wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 300C. Reakcję enzymatyczną rozpocząć dodając do każdej próby, w odstępach co 30
sekund, po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x,
100x lub 250x). Próby inkubować: 2, 4, 6, 8, 10 i 12 minut. Reakcję przerwać dodając, w
30-sekundowych odstępach, po 5 ml 0,1M roztworu NaOH w kolejności takiej jak dodawano enzym.
Próby zerowe należy przygotować następująco: do probówki napipetować 0,25 ml
buforu o pH 5,5 oraz 0,25 ml p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować 12 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec
0,5 ml enzymu o danym rozcieńczeniu.
Dokonać pomiaru absorbancji przy λ = 405 nm wobec próby zerowej. Na podstawie
otrzymanych wyników należy wykreślić zależność szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyrażonej jako wartości absorbancji przy 405 nm) od czasu inkubacji, dla odpowiedniego rozcieńczenia enzymu. Wszystkie pary ćwiczeniowe wymienią się wynikami, a następnie każda osoba wykona jeden wykres, który będzie przedstawiał wyniki uzyskane przez całą
grupę ćwiczeniową. Należy przeanalizować przebieg krzywych zależności dla poszczególnych rozcieńczeń enzymu!
Zagadnienia do przygotowania:
− podstawy katalizy enzymatycznej (zbliżenie i orientacja substratu, eliminacja wody, stabilizacja stanu przejściowego, przenoszenie grup funkcyjnych)
− kinetyka reakcji enzymatycznych (aktywność enzymatyczna, jednostki aktywności, teoria
wysyceniowa Michaelisa-Menten, szybkość początkowa, szybkość maksymalna )
− enzymy izosteryczne i allosteryczne
− klasyfikacja i nomenklatura enzymów
7
Literatura:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005
Elementy enzymologii – J Witwicki, W Ardelt, PWN, Warszawa 1984
Podstawy biologii komórki – B Alberts i wsp., PWN, Warszawa 1999
8