Lab 6

Laboratorium 6
Immobilizacja enzymu metodą pułapkowania w matrycy hydrożelowej
Prowadzący: dr inż. Karolina Labus
1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA
Enzymy uważane są za niezwykle wydajne katalizatory różnorodnych reakcji, które
efektywnie mogą być wykorzystane w różnych dziedzinach, np. w przemyśle chemicznym,
kosmetycznym, tekstylnym, spożywczym czy farmaceutycznym, jak również w medycynie,
ochronie środowiska oraz rolnictwie. Niemniej jednak w większości przypadków zastosowanie
enzymów w skali przemysłowej jest ograniczone z uwagi na kilka głównych czynników: wysokie
koszty produkcji preparatów enzymatycznych, niewielka możliwość użycia tego samego preparatu
kilkukrotnie oraz znacząca podatność enzymów w formie natywnej (niezwiązanej) na inaktywację
w ekstremalnych warunkach procesowych (np. wysoka temperatura, obecność rozpuszczalników
organicznych, niskie lub wysokie wartości pH).
W związku z powyższym, jednym z największych wyzwań obecnej biotechnologii
przemysłowej jest stworzenie takiego biokatalizatora, który działałby perfekcyjnie. Do
najważniejszych właściwości charakteryzujących efektywny preparat enzymatyczny należą:
wysoka stabilność w warunkach procesowych oraz w warunkach przechowywania, jak również
możliwość wielokrotnego wykorzystania lub zastosowanie takiego biokatalizatora w procesie
ciągłym. Te założenia można spełnić m. in. poprzez immobilizację enzymu.
IMMOBILIZACJA ENZYMÓW
Immobilizacja jest jedną z najpopularniejszych procedur stosowanych w celu efektywnego
zwiększenia stabilności enzymów. Termin immobilizowany enzym po raz pierwszy został
rekomendowany w 1971 roku przez Katzir-Katchalskiego na Pierwszej Konferencji Inżynierii
Enzymatycznej (the First Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, US)
i zdefiniowany jako:
Enzym unieruchomiony/zamknięty w ściśle określonej przestrzeni, który zachowuje
swoje właściwości katalityczne oraz może być zastosowany wielokrotnie lub
w procesie ciągłym.
1
Ogólnie, metody immobilizacji można podzielić na trzy główne grupy: (1) sieciowanie, (2)
pułapkowanie i (3) wiązanie z nośnikiem (Rysunek 1).Wszystkie te procedury umożliwiają
uzyskanie preparatów enzymatycznych o zwiększonej stabilności, które mogą być zastosowane
wielokrotnie lub w procesie ciągłym.
Rysunek 1. Ogólny podział metod immobilizacji enzymów.
Metoda sieciowania opiera się na wytworzeniu wielokrotnych wiązań kowalencyjnych
pomiędzy poszczególnymi cząsteczkami enzymu w wyniku czego powstaje trójwymiarowa
usieciowana struktura. Procesy sieciowania charakteryzują się brakiem znaczącego udziału nośnika
w całej procedurze i przeprowadzane są z wykorzystaniem różnych typów czynników sieciujących,
np.: (i) związków katalizujących powstawanie wiązań kowalencyjnych bezpośrednio pomiędzy
grupami funkcyjnymi enzymu lub difunkcyjnych czynników, które są wprowadzane pomiędzy
grupy funkcyjne sieciowanych cząsteczek białka tworząc w rezultacie końcowym pewnego typu
mostki łączące.
Metoda pułapkowania polega na zatrzymaniu cząsteczek natywnego enzymu w ściśle
zdefiniowanej przestrzeni ograniczonej przez nierozpuszczalną, porowatą barierę pochodzenia
naturalnego lub syntetycznego (np. sieć polimerowa, półprzepuszczalna membrana). Poprzez taką
barierę możliwa jest wymiana reagentów (substratów, produktów i innych składników mieszaniny
reakcyjnej) z szybkością związaną z dyfuzją tych związków zachodzącą w obu kierunkach.
Wiązanie z nośnikiem jest najbardziej popularną metodą immobilizacji, opierającą się
o wiązanie cząsteczek enzymu z powierzchnią nierozpuszczalnego nośnika. W tym przypadku
odpowiedni dobór matrycy do immobilizacji oraz typu wiązania jest kluczowe do uzyskania
biokatalizatora charakteryzującego się satysfakcjonującą (z przemysłowego punktu widzenia)
2
jakością. Szereg różnych materiałów można zastosować jako nośniki do immobilizacji m.in.
nieorganiczne, organiczne, pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, jak również materiały
hybrydowe. Enzymy mogą być wiązane z wykorzystaniem m.in.: słabych oddziaływań typu van der
Waalsa, metali przejściowych, oddziaływań powinowactwa lub trwałych wiązań kowalencyjnych.
Niemniej jednak, w praktyce najczęściej stosowaną metodą jest adsorpcja i wiązanie kowalencyjne
z wykorzystaniem nośników zawierających szeroką gamę reaktywnych grup funkcyjnych.
Każda z wyżej wymienionych metod immobilizacji posiada zarówno zalety jak i wady.
Dodatkowo różnią się one pod względem stopnia ingerencji w przestrzenną strukturę
unieruchamianego białka oraz jego stabilność w warunkach procesowych. Najważniejsze cechy
charakteryzujące poszczególne procedury immobilizacji zebrano w Tabeli 1.
Tabela 1. Główne cechy charakteryzujące poszczególne metody immobilizacji enzymów
Wiązanie z nośnikiem
a
Cecha
Sieciowanie
Pułapkowanie
Wytwarzanie
Trudne
Aktywność enzymu
Adsorpcja
Wiązanie
kowalencyjne
Umiarkowanie trudne
Proste
Trudne
Umiarkowana
Wysoka
Niska
Wysoka
Siła wiązania
Mocna
Mocna/Umiarkowanaa
Słaba
Mocna
Ingerencja w
strukturę enzymu
Wysoka
Niska
Niska
Wysoka
Regeneracja nośnika
Niemożliwa
Niemożliwa
Możliwa
Niemożliwa
Koszty
immobilizacji
Umiarkowane
Niskie
Niskie
Wysokie
Wykorzystanie w
szerszej skali
Niewielkie
Duże
Niewielkie
Duże
w zależności od typu matrycy zastosowanego jako nośnik
Podstawowym parametrem charakteryzującym efektywność immobilizacji metodą pułapkowania w
hydrożelowej matrycy jest wydajność pułapkowania definiowana jako:
Do kartkówki obowiązuje materiał umieszczony w instrukcji (zarówno część teoretyczna
i praktyczna).
3
2. CEL ĆWICZENIA
Podczas zajęć zapoznają się Państwo z procedurą otrzymywania immobilizowanych
preparatów enzymatycznych metodą pułapkowania. Ogólnie, metoda ta bazuje zatrzymaniu enzymu
w sieci trójwymiarowej matrycy polimerowej. W tym przypadku, enzym nie jest bezpośrednio
związany z nośnikiem tylko niejako „uwięziony” w pustych przestrzeniach pomiędzy łańcuchami
polimerowymi. W związku z tym wpływ immobilizacji na strukturę oraz specyficzne właściwości
katalityczne tak unieruchomionego enzymu jest nieznaczny.
3. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Przygotować 0,1M bufor fosforanowy pH 7.0 (dla całej grupy 1L)

200 mL laktozy o stężeniu 50 g/L przygotować w 0,1Mbuforze fosforanowym o pH 7.0

Odczynnik I (różowy) do pomiaru aktywności enzymu

Żelatyna,
czynnik
sieciujący
(mikrobiologiczna
transglutaminaza,
mTGaza)
–
przygotowywana przez prowadzącego zajęcia

Enzym do immobilizacji (roztwory β-galactozydazy o różnym stężeniu przygotowane przez
prowadzącego zajęcia).
3.1. Immobilizacja enzymu (β-galaktozydazy) metodą pułapkowania w żelatynowej matrycy
hydrożelowej

Przygotować 30 mL 15% w/v roztworu żelatyny w 0.1M buforze fosforanowym pH 7.0,
umieścić go w termostatowanym szklanym reaktorze (60°C) i mieszać aż do uzyskania
całkowitego rozpuszczenia.

Następnie otrzymany roztwór żelatyny schłodzić do 40 °C.

Następnie, w celu rozpoczęcia procesu sieciowania, schłodzony roztwór żelatyny zmieszać z
czynnikiem sieciującym zawierającym β-galaktozydazę w stosunku 2:1

W celu otrzymania 1 cząstki hydrożelowej do probówki należy wprowadzić 1 mL czynnika
sieciującego zawierającego β-galaktozydazę, a następnie dodać 2 mL roztworu żelatyny,
zamknąć probówkę korkiem i natychmiast zmieszać na worteksie

Należy przygotować po 5 cząsteczek hydrożelu dla jednego stężenia immobilizowanego
enzymu

Każda podgrupa przygotowuje hydrożele z immobilizowanym enzymem dla dwóch stężeń
unieruchamianego białka

Następnie wszystkie probówki z hydrożelami zostawić w 4°C na 1h

Po upływie tego czasu wyjąć hydrożele z probówek używając metalowej szpatułki
i zostawić do pomiarów aktywności
4
3.2. Pomiar aktywności katalitycznej enzymu (przypomnienie analityki z Lab 4)
W pomiarach aktywności enzymu (β-galaktozydazy) wykorzystywany jest test analityczny na
glukozę jednego z produktów reakcji katalizowanej przez ten enzym.
Sposób wykonania testu analitycznego na zawartość glukozy:
Z odpowiednio rozcieńczonej próbki pobrać 10 µl do 1 ml Odczynnika I (Glukoza OXY DST,
Alpha Diagnostics), inkubować przez 5 min w 37°C, a następnie mierzyć absorbancję przy długości
fali 500 nm. Przed rozpoczęciem pomiarów spektrofotometr należy wyzerować na 1 mL
Odczynnika I.
Pomiar katalitycznej aktywności natywnego enzyme (β-galaktozydazy)
 Przygotować roztwór substratu (laktozy) o stężeniu 50 g/L w 0,1M buforze fosforanowym
pH 7.0

Następnie w termostacie (37°C) umieścić probówkę zawierającą 3 mL tego substratu
i inkubować przez około 10 min.

W międzyczasie przygotować statyw z 11probówkami i do każdej z nich dodać po 1 mL
Odczynnika I (różowego).

Po upływie tego czasu, do probówki z preinkubowanym substratem (3mL) dodać 0,3 mL
roztworu natywnego enzymu (przygotowanego przez prowadzącego) i włączyć stoper
 Przez 10 min po każdej 1 minucie reakcji pobrać próbkę z probówki z mieszaniną
laktozy i enzymu (10 µL), niezwłocznie zmieszać z 1 mL Odczynnika I (różowego)
i umieścić dokładnie na 5 minut w łaźni wodnej (37 °C)

Następnie zmierzyć absorbancję na spektrofotometrze przy 500 nm. Przed pomiarami,
aparat musi być wyzerowany (zero base) na 1 mL Odczynnika I. Próbki wyciągnięte z łaźni
wodnej (5 min, 37 ° C) mogą czekać na pomiary absorbancji w temperaturze pokojowej
nawet do 25 min.
Pomiar katalitycznej aktywności enzymu (β-galactozydazy) immobilizowanego w matrycy
hydrożelowej

W termostatowanym reaktorze szklanym (37°C) umieścić 30 mL roztworu laktozy
o stężeniu 50 g/L i inkubować przez około 10 min.

W międzyczasie przygotować statyw z 11 probówkami i do każdej z nich dodać po 1 mL
Odczynnika I (różowego).
5

Po upływie tego czasu, do reaktora z preinkubowanym substratem (30 mL) dodać
1 hydrożel z immobilizowanym enzymem (3 mL) i włączyć stoper
 Przez 20 min po każdych 2 minutach reakcji pobrać próbkę z reaktora zawierającego
laktozę i immobilizowany enzym (10 µL), niezwłocznie zmieszać z 1 mL Odczynnika I
(różowego) i umieścić dokładnie na 5 minut w łaźni wodnej (37 °C)

Następnie zmierzyć absorbancję na spektrofotometrze przy 500 nm. Przed pomiarami,
aparat musi być wyzerowany (zero base) na 1 mL Odczynnika I. Próbki wyciągnięte z łaźni
wodnej (5 min, 37 ° C) mogą czekać na pomiary absorbancji w temperaturze pokojowej
nawet do 25 min.
3.3. Opracowanie wyników

Każda podgrupa do sporządzenia sprawozdania potrzebuje wyniki całej grupy.

W sprawozdaniu procedurę wykonania doświadczenia przedstawić graficznie na schemacie
(nie przepisywać instrukcji).

Wyniki pomiarów aktywności uzyskane dla natywnego i immobilizowanego enzymu
przedstawić na wykresie jako: A500nm = f(t) i na podstawie równania prostej wyznaczyć

Wartości aktywności (wyrażone jako

Wartości aktywności uzyskane dla wszystkich immobilizowanych preparatów enzymu
)
skorelować z ich stężeniem i przedstawić na wykresie (Aktywność immobilizowanego
enzymu = f(CENZYMU)

Dla wszystkich enzymów po immobilizacji wyznaczyć tzw. wydajność pułapkowania

Skomentować i podsumować uzyskane wyniki.
Literatura
[1] Katchalski-Katzir E., Immobilized enzymes – learning from past succesess and failures, Trends in Biotechnology 11
(1993) 471-478.
[2] Bryjak J., Immobilizacja enzymów. Część I: Metody konwencjonalne, Wiadomości Chemiczne 58 (2004) 9-10.
[3] Illanes A., Stability of biocatalysts, Journal of Biotechnology 1 (1999) 1-9.
[4] Tischer W., Wedekind F, Immobilized enzymes: methods and applications, Top. Curr. Chem.. 200 (1999) 95-126.
[5] Wong S.S., Wong L.J.C., Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes, Enzyme Microb.
Technol. 14 (1992) 866-874.
[6] Fernandez-Lafuente R., Rosell C.M., Rodriguez V., Guisan J.M., Strategies for enzyme stabilization by
intramolecular crosslinking with bifunctional reagents, Enzyme Microb. Technol. 17 (1995) 517-523.
[7] Betancor L. Luckarift H.R., Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysisis, Trends Biotechnol. 26 (2008) 566572.
[26] Mateo C., Palomo J.M., Fernandez-Lorente G., Guisan J.M., Fernandez-Lafuente R., Improvement of enzyme
activity, stability and selectivity via immobilization techniques, Enzyme Microb. Technol. 40 (2007) 1451-1463.
6