streszczenie (PL)

STRESZCZENIE
Jedwabnik morwowy, Bombyx mori, jest jednym z dwóch owadów określanych
jako udomowione przez człowieka. Od pięciu tysięcy lat jedwabnik jest wykorzystywany
do produkcji jedwabiu, jednak w ostatnich latach stał się również organizmem modelowym
w badaniach nad spokrewnionymi z nim szkodnikami, a także znalazł zastosowanie
w laboratoriach przy produkcji rekombinowanych białek eukariotycznych. Cykl życiowy tego
owada został bardzo dobrze poznany, opisany oraz scharakteryzowany. Jego genom został
zsekwencjonowany w roku 2004. Wciąż jednak jest bardzo niewiele wyników badań
dotyczących proteomu jedwabnika, zwłaszcza liczba białek, dla których udało się określić
strukturę przestrzenną, jest niewielka. W roku 2009, czyli w momencie rozpoczęcia moich
badań, liczba struktur białek jedwabnika zdeponowanych w Banku Danych Białkowych
(PDB) wynosiła zaledwie 34, dla porównania w przypadku muszki owocowej takich struktur
było ok. 500. Powyższy przykład bardzo dobrze ilustruje, jak słabo poznane są białka
jedwabnika morwowego.
Cykl życiowy jedwabnika morwowego można podzielić na trzy części: owad
występuje na początku w postaci larwy, następnie przeobraża się w poczwarkę, aż wreszcie
przekształca się w owada dorosłego. Intensywna ekspresja białek zachodzi w piątym,
ostatnim stadium larwalnym. Bardzo wiele ważnych białek jest wydzielanych do hemolimfy,
która jest odpowiednikiem krwi ssaków. Białka obecne w hemolimfie można podzielić
na dwie grupy: białka o wysokiej masie cząsteczkowej (głównie heksameryny o masie
500 kDa) oraz lipoproteiny o masie cząsteczkowej 30 kDa (30-kDa LPs).
Heksameryny są białkami zapasowymi jedwabnika, bogatymi w reszty metioniny
lub w reszty aminokwasów aromatycznych, w tym drugim przypadku są one wówczas
określane jako aryloforyny. Trzy główne białka zapasowe obecne w hemolimfie to SP1, SP2
oraz SP3. Białka SP1 i SP2 były intensywnie badane, choć nie strukturalnie, w ciągu ostatnich
trzydziestu lat, podczas gdy bardzo niewiele informacji odnośnie SP3 jest dostępnych
w literaturze.
Z kolei rodzina białek 30-kDa LPs jest bardzo liczna, opisano 48 różnych genów
kodujących białka z tej rodziny. 30-kDa LPs uczestniczą w wielu procesach w organizmie
jedwabnika, m. in. biorą udział w transporcie lipidów, mogą pełnić rolę białek zapasowych,
uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej. Ponadto, białka te mogą być również niezwykle
przydatne
w
laboratoriach
biologii
molekularnej,
gdyż
wykazują
właściwości
antyapoptotyczne – zwiększają przeżywalność komórek linii owadzich i ssaczych, a także są
zdolne do wnikania do komórek ssaczych na drodze pinocytozy.
Celem niniejszej pracy było określenie struktur krystalicznych wybranych białek
hemolimfy jedwabnika morwowego. W rozprawie zostały opisane wszystkie kroki
prowadzące do uzyskania struktur przestrzennych badanych białek, zaczynając od izolacji
hemolimfy z larw jedwabnika, poprzez oczyszczanie białek przy pomocy chromatografii, ich
krystalizację do uzyskania danych dyfrakcyjnych oraz rozwiązania i udokładnienia struktur.
Otrzymane struktury krystaliczne białek hemolimfy zostały następnie poddane szczegółowej
analizie.
Hemolimfa została wyizolowana z larw jedwabnika piątego stadium larwalnego.
Wykorzystując filtrację żelową, chromatografię jonowymienną oraz chromatografię
oddziaływań hydrofobowych, otrzymałam trzy preparaty zawierające cztery różne białka
hemolimfy: Bmlp3, Bmlp7 (należące do 30-kDa LPs) oraz białka zapasowe, SP2 i SP3.
Następnie uzyskałam kryształy Bmlp3, Bmlp7 i kompleksu SP2-SP3 o dobrych
właściwościach dyfrakcyjnych. Otrzymane dane dyfrakcyjne pozwoliły mi na rozwiązanie
sześciu struktur krystalicznych: trzech struktur białka Bmlp7, dwóch struktur Bmlp3
reprezentujących dwie formy krystaliczne oraz struktury kompleksu SP2-SP3. Pierwsza,
wysokorozdzielcza struktura Bmlp7 została rozwiązana przy użyciu metody dostrojonej
dyfrakcji anomalnej, natomiast wszystkie pozostałe struktury zostały rozwiązane metodą
podstawienia cząsteczkowego.
Wszystkie badane białka zostały wyizolowane z hemolimfy jako nieznane białka,
dlatego niezbędna była ich identyfikacja. W tym celu używane były takie metody
jak LC/MS/MS oraz degradacja Edmana (wyłącznie do oznaczenia końca N badanych
białek). Jednak we wszystkich przypadkach ostateczna identyfikacja była możliwa dzięki
krystalografii. Mapy gęstości elektronowej pozwoliły na ustalenie właściwej sekwencji
aminokwasowej badanych białek.
Struktury krystaliczne białek jedwabnika ujawniły także obecność modyfikacji
posttranslacyjnych: utlenienie reszty tryptofanu 180 na atomie C7 pierścienia indolowego
w Bmlp7 oraz N-glikozylację białek SP2 i SP3.
Analiza struktury kompleksu aryloforyn SP2-SP3 umożliwiła wskazanie różnic
pomiędzy aryloforynami oraz hemocyjaninami, białkami ewolucyjnie powiązanymi
z aryloforynami. Ponadto, moje badania po raz pierwszy pokazały, że białka SP2 i SP3
występują w kompleksie i tworzą heteroheksamer. Wcześniej SP2 było zawsze opisywane
jako białko homoheksameryczne, natomiast o białku SP3 w ogóle było bardzo niewiele
informacji w literaturze.
Z kolei analiza struktur białek Bmlp3 i Bmlp7 oraz porównanie ich dwóch domen
(NTD i CTD) z innymi strukturami białek dostępnymi w PDB pozwoliła na przypisanie
potencjalnej funkcji każdej z domen. Domena końca N białek 30-kDa LPs jest strukturalnie
podobna do białka zaangażowanego w procesy apoptozy u człowieka, co może świadczyć
o tym, że to NTD jest odpowiedzialna za właściwości antyapoptotyczne tych białek.
Natomiast domena końca C ma strukturę β-koniczyny, a taki motyw strukturalny najczęściej
jest odpowiedzialny za wiązanie sacharydów przez białka. Zatem prawdopodobnie CTD
uczestniczy w odpowiedzi immunologicznej, ponieważ może rozpoznawać i wiązać
sacharydy. Ponadto, w wysokorozdzielczej strukturze Bmlp7 zlokalizowałam kationy kadmu
związane do białka. Dalsze analizy wykazały, że źródłem kadmu była prawdopodobnie
hemolimfa jedwabnika, co może świadczyć o tym, że jedwabnik posiada mechanizm
detoksyfikacji metali ciężkich, w który zaangażowane jest Bmlp7. Wreszcie, znalazłam
w strukturach Bmlp7 i Bmlp3 cztery potencjalne kieszenie wiążące, gdzie białka te mogą
oddziaływać z ligandami. Analiza powierzchni elektrostatycznej białka Bmlp3 pozwoliła
na zlokalizowanie fragmentu, który może być odpowiedzialny za wnikanie tego białka
do komórek innych organizmów.