Badanie wpływu liganda na proces rozwijania białka

Ćwiczenia: Biochemia Fizyczna kurs zaawansowany
2015
Proszę przynieść ze sobą laptopy (przynajmniej 1 na 2 osoby)
Badanie wpływu liganda na proces rozwijania białka
a także badanie domenowej struktury białek przy użyciu metody DSC
Wpływ wiązania liganda na krzywe DSC
Zastosowanie reguły Le Chatelier’a lub proste rozważania równowagowe wykazują, że każdy
ligand (tzn. mała cząsteczka, inne białko lub makromolekuła) wiążąca się preferencyjnie do
zwiniętej (natywnej) formy białka stabilizuje stan zwinięty zaś rozwijanie białka jest tym mniej
faworyzowne im wyższe jest stężenie liganda. I odwrotnie ligand chętniej wiążący się do
rozwiniętej formy białka destabilizuje stan zwinięty i prowadzi do szybszej denaturacji.
Wiązanie liganda i równowaga zwijania
Wiązanie liganda do natywnej formy białka
Dla najprostszego przypadku, gdy cząsteczka liganda (L) wiąże się specyficznie do jednego
miejsca wiązania w natywnej cząsteczce białka (N) ustala się równowaga opisana równaniami:
Wiązanie liganda: N + L
NL, KLN = [NL]/ [N][L],
Dysocjacja liganda: NL
N + L, KL,N = [N][L]/[NL]
Rozwijanie białka: N
U, K0 = [U]/[N]
Gdzie KL,N jest stałą dysocjacji liganda do natywnej formy białka oraz K0 jest stałą równowagi
procesu rozwijania dla białka pod nieobecność liganda.
Efektywna stała równowagi procesu rozwijania białka w kompleksie z ligandem (Kunf) jest
wyrażona przez stosunek stężeń całkowitego stężenia formy rozwiniętej do stężenia formy
zwiniętej:
Kunf = [U]/([N]+[NL]) = K0[N]/([N] + [N[[L]/ KL,N) = K0/(1 + [L]/ KL,N)  K0KL,N /[L]
gdzie końcowa przybliżona postać równania jest słuszna dla wysokich stężeń wolnego liganda
([L] >> KL,N).
Z powyższego równania wynika, że ze wzrostem stężenia liganda wartość Kunf maleje czyli
wzrasta stabilność zwiniętej formy białka. Do tego samego wniosku można dojść rozważając
wyrażenia na entalpię swobodną:
Gunf = -RTln(Kunf) = Gunf,0 + RTln(1 + [L]/KL,N)
1
Przy wysokim stężeniu wolnego liganda ([L] >> KL,N):
Gunf = -RTln(Kunf)= -RT ln(K0KL,N /[L])
Gunf = -RT lnK0- RT ln(KL,N /[L])
Gunf  Gunf,0 + RT ln([L]/KL,N)
Gunf  Gunf,0 + RTln[L] –RTln(KL,N)
Gunf  Gunf,0 + Godiss,N + RTln[L]
gdzie Gunf,0 oznacza entalpię swobodną procesu denaturacji pod nieobecność liganda, zaś
Godiss,N = -RTln(KL,N) to standadowa energia Gibbs’a procesu dysocjacji liganda od natywnej
formy białka
Jak widać stabilizujący wpływ wiązania liganda wynika z konieczności dostarczenia dodatkowej
porcji energii potrzebnej do jego usunięcia z miejsca wiążącego (przed procesem rozwijania)
oraz udziału członu (RTln[L]) związanego z entropią mieszania oddysocjowującego liganda
uwalnianego do roztworu.
Powyższą, uproszczoną formę wyrażenia na entalpię swobodną można rozbić na człony:
entalpowy i entropowy:
Hunf  Hunf,0 + Hodiss,N
Sunf  Sunf,0 + Sodiss,N –Rln[L]
W wielu przypadkach ciepło pochodzące z dysocjacji liganda (Hodiss,N) jest stosunkowo małe w
porównaniu z ciepłem procesu rozwijania białka (szczególnie dotyczy to małych ligandów) i
dlatego może być trudne do wyznaczenia w eksperymentach kalorymetrycznych. Jest to jeszcze
trudniejsze, kiedy ∆Hunf zmienia się z temperaturą z powodu efektu ∆Cp W takich przypadkach
będzie dominował efekt entropowy zwłaszcza ten wynikający z mieszania liganda (Rln[L]).
Podobne rozważania można przeprowadzić dla sytuacji z niskim stężeniem liganda, chociaż
algebraiczne wyrażenia są bardziej skomplikowane. Wówczas termodynamiczne parametry
przyjmują wartości pośrednie pomiędzy tymi otrzymanymi dla białka niezwiązanego i całkowicie
wysyconego ligandem.
2
o
Temperature ( C)
Powyższy wykres stanowi typowy przykład wpływu wiązania małego liganda (2’-CMP) na denaturację białka
globularnego (RNAza). Termogram analizowano według modelu dwustanowego w celu wyznaczenia T, ∆Hcal i
∆HVH. Wewnętrzny wykres przedstawia względne przesuniecie T w funkcji całkowitego stężenia liganda (warunki
eksperymentu 0.1M CH3COONa, pH 4.5, 80 µM rybonukleaza, 0-1.5 mM CMP).
Wiązanie liganda do rozwiniętej formy białka
Takie samo podejście stosuje się w sytuacji gdy ligand wiąże się tylko do rozwiniętej formy
białka:
U+L
UL KL,U = [U][L]/[UL]
Kunf =([U]+[UL])/[N] = ([U] + [U][L]/KL,U)/([U]/K0)= K0*(1 + [L]/KL,U)  K0[L]/KL,U i
Gunf =-RTln(Kunf) = Gunf,0 - RTln(1 + [L]/KL,U)
 Gunf,0 -Godiss,U -RTln[L], dla wysokiego [L]
Destabilizujący wpływ liganda uwidacznia się tutaj w obniżeniu entalpii swobodnej denaturacji.
Analogiczne wyrażenia na udziały członów entropowego i entalpowego można zapisać podobnie
jak wyżej. Jako przykład przedstawiono wyniki DSC dla lizozymu związanego cyklodekstranem.
3
Znormalizowany termogram dla lizozymu (40 mM bufor glicynowy/HCl, pH 3.0) w obecności 0, 5, 10, 15% (w/v)
α-cyklodekstranu. Widoczne różnice w ∆Hcal wynikają raczej z naturalnych różnic temperaturowych w entalpii
rozwijania (efekt ∆Cp) niż z powodu samego wiązania liganda.
Zmiany w temperaturze przejścia (denaturacji) T
Najbardziej oczywistą manifestacją wpływu wiązania liganda na rozwijanie białka jest
przesuniecie temperatury denaturacji. Zmiana temperatury może być wyliczona w następujący
sposób.
Entalpia swobodna procesu rozwijania kompleksu jest wrażona następująco i jest zależna od
temperatury:
Gunf = -RTln(Kunf) = Gunf,0 ± RTln(1 + [L]/KL,N lub U)
Gunf,0 (dla wolnego białka) wynosi 0 w temperaturze Tm0, czyli w temperaturze rozwijania.
Pomijając wpływ ∆Cp (tzn. zakładając dla uproszczenia ze entalpia rozwijania jest względnie
stała w zakresie badanej temperatury), entalpia swobodna rozwiania pod nieobecność liganda
może być wyrażona przez entalpię przejścia (∆Hunf,0) w (Tm0):
Z prawa Kirchhoffa wynika znana zależność G od T:
G = H(w TR) + Cp(T-TR) – T[S(w TR) + Cp ln(T/TR)], TR - temperatura referencyjna,
dla rozwijania dla wolnego białka TR = Tm0, S=Hunf,0/Tm0, oraz gdy Cp = 0
Otrzymujemy Gunf,0 = Hunf,0 (1 – T/Tm0)
Po podstawieniu do wzoru na Gunf
Gunf = Hunf,0 (1 – T/Tm0) ± RTln(1 + [L]/KL,N lub U) tak więc po przekształceniu:
Dalsze przekształcenia dotyczą liganda preferencyjnie wiążącego białko zwinięte (znak „+”):
- Hunf,0 (1 – T/Tm0) = RTln(1 + [L]/KL,N)
4
- Hunf,0 (Tm0/T – 1) = RTm0ln(1 + [L]/KL,N)
Hunf,0(1 – Tm0/T) = RTm0ln(1 + [L]/KL,N)
((T – Tm0)/T) = [RTm0ln(1 + [L]/KL,N)]/ Hunf,0
Tm/T = ±(RTm0/Hunf,0)*[ln(1 + [L]/KL)] ogólny zapis
gdzie ∆Tm = T - Tm0 jest zmianą temperatury denaturacji wynikająca z obecności liganda
zaś znak ± zależny jest od tego czy ligand stabilizuje zwiniętą (KL = KL,N) czy rozwiniętą (KL =
KL,U) formę białka. Zatem ligand wiążący się do natywnej formy podnosi T zaś do rozwiniętej
obniża T.
T - temperatura przejścia dla kompleksu
Tm0 - temperatura przejścia dla samego białka
Inna postać równania pozwala wyznaczyć T
- Hunf,0 (Tm0/T – 1) = RTm0ln(1 + [L]/KL,N)
T = {-(RTm0ln(1 + [L]/KL,N))/Hunf,0+1}
T =Tm0/{[-(RTm0ln(1 + [L]/KL,N))/Hunf,0]+1}
Jeszcze inna postać równania umożliwia wyznaczenie KL,N
-Hunf,0 (1 – T/Tm0) = RTln(1 + [L]/KL,N)
-Hunf,0 (1 – T/Tm0)/RT= ln(1 + [L]/KL,N)
Trzeba pamiętać, że [L] jest to stężenie wolnego liganda w temperaturze T.
Uwaga: w powyższych równaniach zdefiniowano T jako temperaturę przejścia gdzie ∆Gunf
wynosi zero i populacje formy zwiniętej i rozwiniętej są sobie równe. W doświadczeniach DSC z
pojedynczym przejściem odpowiada to maksimum termogramu (lub bardzo blisko maksimum).
Jednak w przypadku liganda o dużym powinowactwie i stężeniu niższym niż stechiometryczne
5
mogą być obecne dwa piki odpowiadające oddzielnemu rozwijaniu wolnego białka i kompleksu
białka z ligandem. W takiej sytuacji “T” zdefiniowane jak powyżej leży gdzieś pomiędzy dwoma
pikami.
W bardziej ogólnym przypadku wielokrotnie i słabo wiązanych ligandów równanie to może być
rozszerzone do postaci:
Tm/T = ±nRT0/Hunf,0 ln(1 + [L]/KL)
gdzie n oznacza liczbę miejsc wiążących ligand ( przy założeniu ich identyczności) .
W niskim stężeniu i w przypadku liganda słabo wiążącego się ([L]/KL << 1) wyrażenie opisujące
zmiany w temperaturze denaturacji, Tm, staje się niemal liniową funkcją stężenia liganda
∆Tm /T ≈± nRT0 [L]/(KL∆Hunf,0)
Co istotne, z równania wynika, wbrew podszeptom naszej naiwnej intuicji, że T będzie się
przesuwać z wzrostem stężenia liganda nawet poza poziom całkowitego wysycenia miejsc
wiążących białka. Jest to konsekwencja przeważającego udziału opisanego powyżej procesu
mieszania. Wzrost temperatury, nie wynika bowiem jak się często błędnie mniema z
powstawania wiązań miedzy białkiem a ligandem co w jakiś sposób miałoby utrzymywać białko
w bardziej stabilnej konformacji (gdyby to była prawda po wysyceniu białka nie możliwa byłaby
dalsza stabilizacja, a jest to sprzeczne z obserwacją).
Termodynamiczna racjonalizacja tłumaczy wzrost stabilności przyczynkiem do entalpii
swobodnej koniecznym do usunięcia liganda z miejsca wiązania w białku przed procesem (i vice
versa), a ten z kolei dodatek entalpii swobodnej
w istocie wynika z entropii mieszanie
oddysocjowującego liganda. Jest to proces niezależny od konformacji białka i zależy od
względnego stężenia liganda w roztworze.
Jeden czy dwa piki?
Warto zastanowić się jak zależy kształt krzywej DSC w zależności od rodzaju liganda i proporcji
pomiędzy białkiem i ligandem.
Jeżeli ligand wiąże się relatywnie słabo i jego stężenie jest znacznie większe niż stężenie białka,
wówczas (zakładając, że proces jest dwu-stanowy) obserwujemy jeden pik endotermiczny
stopniowo przesuwający się w stronę wyższych lub niższych T wraz ze zmianą stężenia liganda.
a nie, jak można by się spodziewać, dwa piki: jeden odpowiadając populacji białka wolnego
drugi dla białka związanego z ligandem. gdyż między tymi dwoma populacjami występuje
6
równowaga. Przyczyną tego stanu rzeczy jest ustalająca się szybko dynamiczna równowaga
pomiędzy stanami białka związanym z ligandem i wolnym. Oznacza to, że obserwujemy
termodynamiczną średnią pochodząca od tych dwóch stanów, zakładając (co zwykle jest zgodne
z prawdą), że wiązanie i oddysocjowanie liganda jest względnie szybkie w porównaniu do skali
czasowej odpowiadającej pomiarowi DSC.
Dwa piki pochodzące od wolnej i związanej z ligandem formy białka obserwuje się w
przypadku, gdy ligand wiąże się bardzo mocno i występuje w niedomiarze w stosunku do
białka.
Przykładem takiej sytuacji jest eksperyment DSC polegający na termicznym rozwijaniu białka
represorowego (represora metioniny, MetJ) w obecności wzrastających stężeń specyficznego
fragmentu DNA. Kiedy białko jest w nadmiarze w stosunku do DNA widoczne są dwa piki. Pik
odpowiadający niższej temperaturze pochodzi od białka wolnego zaś ten o większej Tm od białka
związanego
z
DNA.
Wraz
ze
wzrostem
stężenia
DNA
wzrasta
udział
piku
wysokotemperaturowego. Przy stosunku równomolowym widoczne jest tylko jedno przejście. dla
białka związanego. (topnienie dupleksu DNA nie zachodzi w zakresie badanych temperatur).
Termogram DSC) dla MetJ i złożonego z 16 pz specyficznego fragmentu DNA. Badano mieszaninę białko-DNA w
różnych stosunkach stechiometrycznych; 25mM bufor fosforowy, 0.1M KCl, 1mM DTT, pH 7.
7
Badanie oddziaływania międzydomenowego białek o budowie domenowej na podstawie modelu
Brandts’a
Wpływ oddziaływania domen w białku dwu-domenowym na krzywe DSC.
Jeżeli rozpatrujemy białko dwu-domenowe (zbudowane z domen A i B), w którym każda z
domen ma inną „wewnętrzną” temperaturę topnienia (T*A oraz T*B), to gdy oddziaływanie
międzydomenowe jest obecne wówczas eksperymentalna temperatura przejścia (TA) dla
podjednostki mniej stabilnej (o niższej „wewnętrznej” temperaturze przejścia) będzie wyższa niż
T*A z powodu oddziaływania międzydomenowego:
GAB = – HA (1 – T*A/TA) + Cp(T*A ln[T*A/TA ] + TA – T*A)
Dla Cp = 0
GAB = – HA (1 – T*A/TA),
gdzie HA zmiana entalpii denaturacji domeny A.
Zaś eksperymentalna temperatura przejścia podjednostki B (TB) o wyższej temperaturze
przejścia, będzie równa z temperatura „wewnętrznego” przejścia (T*B = TB), gdyż oddziaływania
powierzchniowe stabilizujące strukturę zniknęły już podczas denaturacji podjednostki A.
Oznacza to, że oddziaływanie między domenami białka ma wpływ wyłącznie na temperaturę
topnienia domeny mniej stabilnej (niższe T). Gdy piki pochodzące od obu podjednostek są
rozdzielone, wówczas z krzywej DSC nie wiadomo nic o obecności oddziaływania miedzy
domenami lub też jego braku.
Obecność
oddziaływania
międzydomenowego
można
potwierdzić,
przez
wykonanie
eksperymentu, w którym poprzez stabilizację domeny mniej stabilnej (podniesienie jej
temperatury przejścia) zaobserwujemy zmiany w temperaturze denaturacji domeny (początkowo)
bardziej stabilnej. Na przykład, jeśli będziemy zwiększać stężenie liganda specyficznie
wiążącego się zwiniętej formy domeny mniej stabilnej wówczas dochodzi najpierw do zlania się
pików pochodzących od każdej z podjednostek (niesymetryczny pojedynczy pik), następnie
pojawi się jeden symetryczny pik na krzywej DSC, który można opisać raczej jako pojedyncze
przejście między dwoma stanami niż dwa niezależne zachodzące na siebie przejścia. Dalszy
wzrost stężenia liganda spowoduje „crossover” – denaturacja domeny A zajdzie w temperaturze
powyżej przejścia dla domena B, a obserwowana temperatura przejścia podjednostki B jest
8
wyższa niż przed połączeniem pików (T*B), gdyż to domena B jest teraz stabilizowana przez
oddziaływanie międzydomenowe.
Jeśli znane są temperatury denaturacji domeny (początkowo bardziej stabilnej - B) przed i po
crossover możliwe jest wyznaczenie entalpii swobodnej oddziaływania międzydomenowego na
podstawie równania:
GAB = HB (1 – T’B/TB) + Cp(T’B ln[T’B/TB ] + TB – T’B) w temperaturze TB’
GAB = – H’B (1 – TB/TB’) + Cp(TB ln[TB/TB’ ] + TB’ – TB) w temperaturze TB
gdzie HB zmiana entalpii denaturacji domeny B w temperaturze TB (bez ligand), H’B to zmiana
entalpii w temperaturze TB’ (z ligandem).
Wykorzystana literatura:
1. A. Cooper, M. A. Nutley, A. Wadood, Differential scanning microcalorimetry S. E. Harding
and B. Z. Chowdhry (Eds.), Protein-Ligand Interactions: hydrodynamics and calorimetry.
Oxford University Press, Oxford New York, (2000) p 287-318.
2. J.M. Sanchez- Ruiz
Ligand binding on protein thermodynamic stability. Biophysical
Chemistry 126 (2007) 43-49.
3. H. Fukada, J.M. Sturtevant, F.A. Quiocho. Thermodynamics of the binding of L-arabinose and
of D-galactose to the L-arabinose-binding protein of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 258 (1983)
13193-13198 .
4. S.P. Manly, K.S. Mathews, J.S. Sturtevant. Thermal denaturation of core protein of the lac
repressor. Biochemistry 24(1985) 3842-3846.
5. J.F. Brandts, C.Q. Hu, L.-N. Lin. A simple model for proteins with interacting domains.
Applications to scanning calorimetry data. Biochemistry 1989, 28, 8588-8596.
Wymagany materiał:
- definicje i znaczenie funkcji termodynamicznych
- zasada pomiaru metodą DSC, analiza danych pomiarowych
- dokładna znajomość materiałów do ćwiczeń, w tym WYPROWADZEŃ
9