pobierz plik - Wydział Biologii UW

Rozprawa doktorska mgr Radosława Mazura
Wpływ zmian w składzie i organizacji kompleksów chlorofilowo-białkowych na
przestrzenną strukturę tylakoidów roślin typu C3
Promotor:
Dr hab. Maciej Garstka, prof. UW
Zakład Regulacji Metabolizmu, Instytut Biochemii, Wydział Biologii, Uniwersytet
Warszawski
Recenzenci:
Prof. dr hab. Květoslava Burda
Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki; Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej; Akademia
Górniczo-Hutnicza im. Stanisława Staszica w Krakowie
Prof. dr hab. Grzegorz Jackowski
Zakład Fizjologii Roślin; Instytut Biologii Eksperymentalnej; Wydział Biologii; Uniwersytet
im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Tylakoidy, wewnętrzny system błon chloroplastowych, zróżnicowany jest na tworzące
grana obszary ścieśnione oraz nieścieśnione tylakoidy stromy łączące rejony ścieśnione. Taki
rodzaj organizacji przestrzennej jest wymuszony przez unikatowy skład białkowo-lipidowy
błon tylakoidów oraz związane z nim niejednorodne rozmieszczenie kompleksów
chlorofilowo-białkowych wewnątrz błon tylakoidów. W wyniku szeregu oddziaływań typu
białko-białko oraz białko-lipid zachodzących zarówno w płaszczyźnie lateralnej jak
i wertykalnej
błon
tylakoidów,
kompleksy
fotosyntetyczne
tworzą
hierarchicznie
zorganizowane układy. Począwszy od anten zbierających światło poprzez fotosystemy
i superkompleksy, a na multikompleksach i mikrodomenach skończywszy.
Dostosowanie aparatu fotosyntetycznego do zmieniających się warunków środowiska
związane jest z istnieniem w komórkach roślinnych szeregu mechanizmów regulacyjnych,
których aktywność odpowiada za precyzyjną reorganizację kompleksów fotosyntetycznych
prowadzącą do zmian w strukturze tylakoidów na poziomie całego chloroplastu.
W pracy przedstawiono wyniki badań nad zmianami struktury przestrzennej błon
tylakoidów w zależności od składu i organizacji kompleksów chlorofilowo-białkowych (CP)
przeprowadzonych na dwóch gatunkach roślin: grochu zwyczajnym (Pisum sativum) oraz
fasoli wielokwiatowej (Phaseolus coccineus). Gatunki te różnią się odpornością na niską
temperaturę, groch jest rośliną tolerującą temperatury w zakresie 0-12oC, natomiast fasola jest
wrażliwa na chłód. Różnią się także przestrzenną strukturą chloroplastów, w grochu tylakoidy
zorganizowane są w duże, wyraźnie wyodrębnione grana, natomiast u fasoli obszary
ścieśnione są mniejsze i nieregularnie rozmieszczone wewnątrz chloroplastu.
Na podstawie obrazów fluorescencji chlorofilu uzyskanych metodą laserowej skaningowej
mikroskopii konfokalnej opracowano przestrzenne modele odzwierciedlające rozkład
i organizację błon tylakoidów u obu gatunków. Zbadano również wpływ jonów magnezu na
zmiany struktury przestrzennej tylakoidów w warunkach in vitro.
U grochu w nieobecności jonów magnezu następuje rozfałdowanie obszarów ścieśnionych
błon tylakoidów związane z migracją części kompleksów LHCII/PSII do obszarów
pozagranowych. W efekcie błona tylakoidów przypomina lekko pofałdowaną sferę, a niski
poziom fluorescencji chlorofilu (Chl) wskazuje na dysocjację kompleksów antenowych PSII.
Zwiększenie stężenia jonów magnezu powoduje szybką reorganizację błon i odtworzenie gran
– powierzchnia błony staje się silnie pofałdowana, a znaczny wzrost fluorescencji Chl
świadczy o odbudowie superkompleksów LHCII-PSII.
W przypadku chloroplastów fasoli zmiany stężenia soli magnezu nie wywołują znaczących
zmian strukturalnych, co potwierdzają obserwacje techniką mikroskopii konfokalnej oraz
pomiary spektroskopowe. Zróżnicowany wpływ jonów Mg2+ na reorganizacje błon
tylakoidów u obu gatunków jest związany z odmiennym składem i organizacją kompleksów
CP, w szczególności znacznie większym zagęszczeniem kompleksów CP w tylakoidach
fasoli.
Wpływ zmian składu i organizacji kompleksów CP na strukturę przestrzenną tylakoidów
badano z wykorzystaniem dwóch układów doświadczalnych: przechłodzenia w ciemności
odciętych liści oraz wzrostu roślin w warunkach optymalnej temperatury i umiarkowanego
lub słabego natężenia światła.
Stwierdzono, że w warunkach niskiej temperatury w tylakoidach fasoli następuje wzrost
fosforylacji białek LHCII niezwiązany z aktywnością fotochemiczną tylakoidów. Natomiast
w tych samych warunkach w tylakoidach grochu poziom fosforylacji ulega obniżeniu.
Stosując
techniki
frakcjonowania
wykazano,
że
w
tylakoidach
izolowanych
z przechłodzonych liści fasoli większość fosforylowanych LHCII zlokalizowana jest
w obszarach ścieśnionych błon. Natomiast w tylakoidach stromy stwierdzono minimalną ilość
białek LHCII o wysokim poziomie fosforylacji.
Obserwacje te korelują ze zmianami struktury przestrzennej błon tylakoidów w warunkach
stresu niskiej temperatury. U fasoli stwierdzono częściowe rozfałdowanie błon będące
efektem zwiększenia ujemnego ładunku na powierzchni stromalnej błon prowadzącego do
wzrostu sił odpychających, a w konsekwencji destabilizacji struktur granowych.
Obserwowane zmiany strukturalne gran fasoli mogą wpływać na zwiększenie dostępności
substratów dla galaktolipazy – enzymu odpowiedzialnego za degradację lipidów błon
tylakoidów i wykazującemu wysoką aktywność w chloroplastach fasoli.
Z kolei w chloroplastach grochu pod wpływem niskiej temperatury stwierdzono agregację
struktur granowych, którą można powiązać ze spadkiem poziomu fosforylacji białek LHCII
wpływającym na zmniejszenie sił odpychających między sąsiadującymi błonami tylakoidów.
Taki stan fizyko-chemiczny błony faworyzuje siły przyciągające, które stabilizują struktury
gran.
W badaniach nad wpływem słabego natężenia światła określono różnice w strukturze
przestrzennej tylakoidów, które zestawiono ze zmianami w: składzie białkowo-lipidowym
błon tylakoidów, organizacji kompleksów CP i oddziaływaniach wewnątrzbłonowych oraz
aktywności fotochemicznej PSII i PSI.
W warunkach wzrostu w słabym natężeniu światła (LL) w chloroplastach obu gatunków
zaobserwowano zwiększenie średnicy gran oraz zmniejszenie ich wysokości w porównaniu
z chloroplastami roślin uprawianych w warunkach umiarkowanego natężenia światła (ML).
Elementem rozróżniającym badane gatunki jest położenie „punktu przegięcia”, czyli wartości
wymiaru (średnica, wysokość) w której następuje zmiana znaku zależności LL-ML.
W przypadku średnicy gran jest to około 400 nm dla obu gatunków – w warunkach LL ubywa
gran o średnicy poniżej 400 nm, a przybywa tych powyżej 400 nm. W przypadku wysokości
gran „punkt przegięcia” jest inny dla każdego z gatunków i wynosi około 250 i 100 nm,
odpowiednio dla grochu i fasoli. Poniżej tych wartości w warunkach LL wzrasta ilość gran,
powyżej – spada.
Pomimo podobnych zmian strukturalnych w błonach tylakoidów zmiany organizacji
kompleksów CP u obu gatunków podążają w odmiennych kierunkach. U grochu następuje
m.in. częściowa migracja anten LHCII do fotosystemu I. Natomiast w przypadku fasoli
migracja ta jest utrudniona, co jest sumarycznym efektem zmian składu lipidowego oraz
stopnia agregacji białek – czynników wpływających na elastyczność błony tylakoidów.
Przeprowadzone badania wykazały, że zróżnicowane właściwości fizyko-chemiczne błon
tylakoidów badanych gatunków określają ich możliwości aklimatyzacji do warunków niskiej
temperatury i słabego światła. To zróżnicowanie składu i organizacji błon tylakoidów, będące
punktem wyjściowym ułatwiającym lub utrudniającym przeciwdziałanie określonym
warunkom stresowym, jest związane z pochodzeniem tych roślin z różnych stref
klimatycznych.