Ćwiczenie 6

Spektroskopia NMR w badaniach struktury i aktywności biomolekuł
I.
Magnetyczny rezonans jądrowy – uproszczone podstawy teoretyczne stosowanej metody i
aparatura pomiarowa.
Jądra atomowe – co udowodnił Ernest Rutherford, przeprowadzając swój legendarny już
eksperyment – obdarzone są ładunkiem dodatnim. Ładunek ten, będący konsekwencją obecności
protonów w jądrach pierwiastków, może być rozmieszczony w różny sposób – zależny od ilości i rodzaju
nukleonów tworzących dane jądro. Ponieważ jądra atomowe wirują wokół własnej osi, w niektórych
przypadkach wirujący ładunek elektryczny generuje dwubiegunowe pole magnetyczne (tzw. dipol
magnetyczny), zorientowane wzdłuż osi obrotu. Moment pędu wirującego ładunku można zdefiniować za
pomocą kwantowej liczby spinowej (spinu) I, która przyjmuje wartości równe całkowitym
wielokrotnościom liczby ½ (oraz 0). Natomiast podstawowym parametrem, który definiuje powstały (w
wyniku istnienia spinu) dipol magnetyczny jest moment magnetyczny jądra µ, który możemy wyobrazić
sobie jako wektor skierowany wzdłuż osi obrotu jądra – a którego zwrot, zależny od kierunku obrotu, można
określić zgodnie z regułą śruby prawoskrętnej (albo prawej dłoni).
Izotopy pierwiastków, które posiadają nieparzystą ilość nukleonów w jądrze (przy dowolnej liczbie
protonów), takie jak 1H, 13C, 15N, 17O, 19F, 31P, etc., mają kwantową liczbę spinową I równą ½. W
„naturalnym środowisku” jądra tych atomów są dipolami magnetycznymi, zaś wektory ich momentów
magnetycznych skierowane są losowo, we wszystkie możliwe strony. W konsekwencji, cząsteczki
zbudowane (przynajmniej częściowo) z takich izotopów (a dalej – substancje złożone z takich cząsteczek)
nie wykazują własności magnetycznych, ponieważ obecne w populacji jąder dipole magnetyczne
„wygaszają się” wzajemnie.
Jednakże, kiedy cząsteczki zawierające atomy izotopów, których jądra są dipolami magnetycznymi,
zostaną umieszczone w silnym, zewnętrznym polu magnetycznym, wektory momentów magnetycznych
tych jąder zaczynają się porządkować (jest to efekt analogiczny do magnesowania paramagnetyków).
Ilość orientacji, które wektor momentu magnetycznego danego jądra może przyjąć w zewnętrznym polu
magnetycznym, zależna jest od kwantowej liczby spinowej jądra I i wyrażona wzorem N = 2I + 1. Dla
wymienionych wcześniej jąder o I = ½, N równa się 2, co oznacza, że wektory ich momentów
magnetycznych mogą w zewnętrznym polu magnetycznym przyjąć dwie orientacje: równoległą i
antyrównoległą w stosunku do wektora natężenia zewnętrznego pola magnetycznego.
Jądro atomowe, którego wektor momentu magnetycznego jest skierowany antyrównolegle w
stosunku do wektora natężenia zewnętrznego pola magnetycznego, znajduje się w stanie o wyższej energii,
niźli jądro, którego wektor momentu magnetycznego jest skierowany równolegle w stosunku do linii sił
zewnętrznego pola. W warunkach pomiaru, stosunek ilości jąder znajdujących się w stanie o wyższej energii
(NW) do ilości jąder znajdujących w stanie o niższej energii (NN) jest minimalnie mniejszy od 1:
𝑁𝑊
Δ𝐸𝑊,𝑁
= exp⁡
(−
)
𝑁𝑁
𝑘𝑇
co oznacza, iż w populacji jąder znajdujących się w badanej próbce istnieje niewielka przewaga jąder,
których wektory momentów magnetycznych skierowane są równolegle względem linii sił zewnętrznego
pola, w konsekwencji czego próbka zyskuje makroskopowe własności magnetyczne.
Jądra atomowe, które znajdują się w stanie o niższej energii można przeprowadzić w stan o wyższej
energii, pod warunkiem, że zaabsorbują one kwanty promieniowania elektromagnetycznego o energii
odpowiadającej różnicy omawianych stanów energetycznych, zgodnie ze wzorem:
1
𝐸 = ℎ𝜈
Ponieważ energia kwantu promieniowania zależy od częstotliwości fali elektromagnetycznej,
możemy powiedzieć, iż jądra atomowe posiadają pewne „częstotliwości własne” promieniowania, dzięki
którym będą „wzbudzane”. Ponieważ, w fizyce, zjawisko pobudzania danego układu (najczęściej do drgań)
w wyniku absorbcji energii fal, których częstotliwość odpowiada częstotliwości własnej danego układ, nosi
nazwę rezonansu, omawiane zjawisko nazywa się magnetycznym rezonansem jądrowym (ang. Nuclear
Magnetic Resonance, NMR), a częstotliwości własne jąder atomowych - częstotliwościami rezonansowymi
(Larmora).
Częstotliwość Larmora, czyli częstotliwość fali elektromagnetycznej zdolnej przeprowadzić jądro
atomowe w stan o wyższej energii, dana jest wzorem:
𝜈𝐿 =
𝛾
𝐵 (1 − 𝜎)
2𝜋 0
i zależy od następujących parametrów:
1)
typu jądra (1H, 13C, etc.), reprezentowanego we wzorze przez współczynnik żyromagnetyczny jądra,
γ (który jest stały dla danego typu jądra);
2)
warunków pomiaru, a dokładniej: mocy spektrometru, reprezentowanej we wzorze przez wartość
indukcji omawianego wcześniej zewnętrznego pola magnetycznego, B0 (pamiętamy, że indukcja
pola magnetycznego jest wielkością wprost proporcjonalną do natężenia pola magnetycznego);
3)
otoczenia chemicznego jądra atomowego, a dokładniej: wpływu pól magnetycznych pozostałych
jąder oraz elektronów znajdujących się w bezpośredniej bliskości danego jądra, reprezentowanego
we wzorze przez stałą ekranowania, σ.
Punkt 3) wymaga dodatkowego komentarza. Otóż okazuje się, iż omawiane wcześniej, zewnętrzne
pole magnetyczne porządkujące wektory momentów magnetycznych w badanej populacji jąder, ulega
„modyfikacji” w wyniku obecności lokalnych pól magnetycznych jąder atomowych oraz elektronów
wchodzących w skład danej cząsteczki chemicznej. W konsekwencji, jądra atomowe, które mają różne
otoczenia chemiczne, tj. znajdują się blisko (w przestrzeni) atomów różnego typu lub różnej ilości atomów
tego samego typu (a przez to: różna jest gęstość elektronowa wokół tych jąder), znajdują się w
wypadkowym polu magnetycznym o różnych, lokalnych natężeniach - w konsekwencji czego
częstotliwości rezonansowe tych jąder są różne! Jest to fakt, który umożliwia zastosowanie zjawiska
magnetycznego rezonansu jądrowego do celów praktycznych.
Czytelnikowi należy się jeszcze schemat ideowy aparatury stosowanej w spektroskopii NMR.
Spektrometr taki składa się z nadprzewodzącego elektromagnesu, którego zadaniem jest wytworzenie
silnego, możliwie jednorodnego pola magnetycznego (o indukcji B0), porządkującego wektory momentów
magnetycznych jąder w badanej próbce; nadajnika (transmitera), który „naświetla” próbkę
promieniowaniem elektromagnetycznym o wybranym przez operatora spektrum częstotliwości oraz
odbiornika.
Moc spektrometru jest najczęściej charakteryzowana przez częstotliwość rezonansową (Larmora)
jądra wodoru (1H), zależną od wartości indukcji wytworzonego przez elektromagnes pola magnetycznego.
Dla B0 = 2,35 T, częstotliwość Larmora dla protonów wzorca (tetrametylosilanu, TMS) wynosi 100 MHz;
dla spektrometrów o wyższej mocy te proporcje są zachowane (np. spektrometr wytwarzający pole o B0 =
11,75 T wzbudza protony wzorca falą elektromagnetycznąo częstotliwości 500 MHz).
Czytelnika zainteresowanego spektroskopią magnetycznego rezonansu jądrowego odsyłamy do literatury
uzupełniającej, gdzie podstawy fizyczne stosowanej metody oraz proces powstawania wyniku eksperymentu, czyli tzw.
widma, omówiono dużo bardziej szczegółowo i bezkompromisowo.
2
II.
Elementy widma jednowymiarowego oraz informacje z nich wypływające.
Spektroskopia NMR jest w istocie spektroskopią absorpcyjną, zatem wynik eksperymentu powinien
w jakiś sposób opisywać energię pochłoniętą przez próbkę. I tak oto, jednowymiarowym widmem NMR
nazywamy wykres ilości kwantów energii promieniowania elektromagnetycznego pochłanianego przez
próbkę w funkcji częstotliwości tego promieniowania. Przykładowe, jednowymiarowe widmo NMR
widoczne jest na poniższym rysunku:
Widoczne powyżej widmo składa się z następujących elementów:
1)
wykresu ilości zaabsorbowanych kwantów energii;
2)
skali przesunięcia chemicznego;
3)
integracji sygnałów rezonansowych.
Każdym z tych elementów zajmiemy się w kolejnych akapitach.
Ad. 1. W wykresie ilości zaabsorbowanych kwantów energii można wyróżnić dwa rejony: rejony
płaskie, czyli tzw. linię bazową, oraz szczególnie nas interesujące sygnały rezonansowe. Obecność sygnału
rezonansowego świadczy o absorpcji promieniowania o danej częstotliwości przez jądro (lub grupę jąder)
wchodzące w skład badanego związku chemicznego. Każdy z sygnałów rezonansowych posiada swoją
strukturę subtelną, na którą składają się:

multipletowość sygnału rezonansowego, informująca o ilości partnerów sprzężenia spinowospinowego;

stałe sprzężenia, informujące o wartości kąta dwuściennego pomiędzy partnerami sprzężenia
spinowo-spinowego.
Multipletowość sygnału rezonansowego, czyli ilość tworzących go linii i stosunek ich względnych
intensywności, zależy od wzajemnej orientacji w przestrzeni wektorów momentów magnetycznych
obserwowanego jądra i jąder sąsiadujących. Informacja ta jest przenoszona do obserwowanego jądra przez
elektrony wiązań chemicznych, przeważnie dwóch lub trzech (dla 1H NMR). Informację taką nazywamy
3
sprzężeniem skalarnym lub spinowo-spinowym. Sprzężenie przez dwa wiązania nazywamy sprzężeniem
geminalnym; zaś przez trzy wiązania – sprzężeniem wicynalnym.
W widmie jednowymiarowym, sygnał rezonansowy protonu, który nie posiada partnerów sprzężenia
spinowo-spinowego (lub należy do tzw. układu silnie sprzężonego, np. izolowanej grupy –CH3), ma postać
singletu. Proton, który ma jednego partnera sprzężenia skalarnego, generuje sygnał rezonansowy w postaci
dubletu (o względnej intensywności linii: 1:1); natomiast proton, który ma dwóch partnerów sprzężenia objawia się w widmie w postaci trypletu (o względnej intensywności linii: 1:2:1) lub dubletu dubletów
(cztery linie o równej intensywności). Wyjaśnienie zjawiska powstawania multipletów oraz reguły tworzenia
multipletów bardziej skomplikowanych Czytelnik odnajdzie w literaturze uzupełniającej.
Odległość pomiędzy liniami w danym sygnale rezonansowym, wyrażoną w Hz, nazywa się stałą
sprzężenia, J. Wartość wicynalnej stałej sprzężenia spinowo-spinowego (przez trzy wiązania, co
zapisujemy: 3J) zależy od wartości kąta dwuściennego ϕ pomiędzy partnerami sprzężenia i jest
wyrażona równaniem Karplusa:
3
𝐽 𝜙 = 𝐴𝑐𝑜𝑠 2 𝜙 + 𝐵𝑐𝑜𝑠𝜙 + 𝐶
w którym parametry A, B i C są parametrami otrzymanymi doświadczalnie, zależnymi od rodzaju
sprzężonych jąder oraz podstawników obecnych w cząsteczce.
Zależność wartości wicynalnej stałej sprzężenia, obserwowanej w widmie jednowymiarowym, od
wartości kąta dwuściennego pomiędzy partnerami sprzężenia spinowo-spinowego ilustruje tzw. krzywa
Karplusa:
Wartość stałej sprzężenia spinowo-spinowego pomiędzy obserwowanym protonem a jego partnerem
sprzężenia najłatwiej jest zmierzyć, gdy sygnał rezonansowy interesującego nas protonu ma postać dubletu.
W przypadku multipletów bardziej złożonych, pomiar stałej (bądź: stałych) sprzężenia bywa dużo bardziej
skomplikowany.
Oprócz sprzężenia spinowo-spinowego, pomiędzy jądrami należącymi do danej cząsteczki (a niekiedy
pomiędzy jądrami należącymi do różnych cząsteczek) występuje inny rodzaj sprzężenia, nazywany
sprzężeniem dipolarnym. Sprzężenie dipolarne dwóch jąder jest wynikiem ich wzajemnej bliskości w
przestrzeni (odległość pomiędzy nimi nie może przekraczać ok. 4 Å); przy czym bliskość jąder w
przestrzeni nie gwarantuje wystąpienia sprzężenia dipolarnego pomiędzy nimi (wynika to z mechanizmu
powstawania sprzężenia, którego nie będziemy rozważać w niniejszej instrukcji). Sprzężenie dipolarne
dwóch jąder objawia się widmie jednowymiarowym poprzez wzajemne, delikatne zwiększenie bądź
4
zmniejszenie intensywności ich sygnałów rezonansowych i jest niemożliwe do wykrycia bez
dodatkowego eksperymentu różnicowego.
Zjawisko zmiany intensywności sygnału rezonansowego danego jądra w wyniku bliskości w
przestrzeni innego jądra nazywa się jądrowym efektem Overhausera (ang. Nuclear Overhauser Effect,
NOE) i jest fundamentem jednego z najczęściej wykorzystywanych eksperymentów dwuwymiarowych,
NOESY. Należy jednak pamiętać, iż jądrowy efekt Overhausera dostarcza wyłącznie dowodów
pozytywnych; tj. jego wystąpienie świadczy o bliskości w przestrzeni badanych jąder, natomiast jego brak
nie dowodzi, iż odległość pomiędzy badanymi jądrami jest większa, niż 4 Å.
Ad. 2. W widmie jednowymiarowym, każdy sygnał rezonansowy ma swoją pozycję na skali
przesunięć chemicznych, wyrażoną w „częściach na milion” (ang. parts per million, ppm). Przesunięcie
chemiczne, δ, jest stransformowaną wartością częstotliwości Larmora jądra reprezentowanego przez
dany sygnał rezonansowy, otrzymaną wg wzoru:
𝛿=
𝜈𝐿 − 𝜈𝑊
∗ 106
𝜈𝑊
i powstałą w celu ujednolicenia wyników otrzymywanych za pomocą spektrometrów o różnej mocy.
Dla przykładu: w spektrometrze o mocy 300 MHz (częstotliwość Larmora wzorca, νW), częstotliwość
rezonansowa danego jądra wynosi 300 000 450 Hz (częstotliwość Larmora badanego jądra, νL); natomiast w
spektrometrze o mocy 500 MHz częstotliwość rezonansowa tego samego jądra (wchodzącego w skład tej
samej cząsteczki) wynosi 500 000 750 Hz. Po stransformowaniu tych wyników za pomocą powyższego
wzoru, okazuje się, że wartość przesunięcia chemicznego uzyskanych sygnałów rezonansowych w obydwu
przypadkach jest taka sama i wynosi 1,5 ppm.
Jak już powiedzieliśmy, przesunięcie chemiczne informuje o częstotliwości rezonansowej jądra (bądź
jąder) generującego dany sygnał rezonansowy. Z nieco bardziej praktycznego punktu widzenia,
przesunięcie chemiczne informuje o otoczeniu chemicznym jądra (jąder) reprezentowanego przez
dany sygnał; ponieważ, co podkreśliliśmy już wcześniej (patrz: część I), częstotliwość Larmora danego
jądra zależy również od jego otoczenia chemicznego. Pod pojęciem otoczenia chemicznego kryją się: rodzaj
atomu, z którym związane jest obserwowane jądro (najczęściej 1H) oraz atomy sąsiadujące.
Jeżeli obserwowanym jądrem jest proton, decydujący wpływ na przesunięcie chemiczne jego sygnału
rezonansowego ma typ atomu węgla, z którym jest związany (sp3, sp2, sp1, aromatyczny) oraz bliskość
ewentualnych grup funkcyjnych cząsteczki. Powstało wiele tablic, w których zgromadzono informacje o
wpływie sąsiadujących podstawników na przesunięcie chemiczne badanego jądra; można jednak pokusić się
o sformułowanie następującego uogólnienia: obecność podstawników o wysokiej elektroujemności
powoduje zwiększenie przesunięcia chemicznego sygnału rezonansowego badanego jądra (jest to tzw.
efekt odsłaniania).
Jeżeli proton związany jest z atomem innym, niż węgiel (np. z azotem bądź tlenem), ogromny wpływ
na wartość przesunięcia chemicznego jego sygnału rezonansowego mają: rodzaj rozpuszczalnika użytego do
wykonania eksperymentu, temperatura oraz stężenie próbki.
Rodzaj użytego rozpuszczalnika będzie determinował, czy sygnały rezonansowe tzw. protonów
wymienialnych w ogóle pojawią się w widmie – jeżeli bowiem wymiana protonów pomiędzy cząsteczkami
badanego związku a rozpuszczalnikiem będzie zbyt szybka, sygnały rezonansowe protonów labilnych z
dużym prawdopodobieństwem zanikną lub pojawią się w postaci rozmytej.
Dodatkowo, wszystkie wymienione powyżej czynniki będą decydowały o wystąpieniu i mocy wiązań
wodorowych. Warto bowiem wiedzieć, iż jądro atomu wodoru, który bierze udział w tworzeniu
wiązania wodorowego, ulega bardzo wyraźnemu efektowi odsłaniania. Uzyskanie informacji o
5
występowaniu wiązań wodorowych ma szczególnie duże znaczenie przy badaniach struktury i aktywności
biomolekuł.
Ad. 3. Pole powierzchni pod sygnałem rezonansowym nazywa się integracją sygnału. Integracja
ilustruje ilość kwantów energii promieniowania elektromagnetycznego o danej częstotliwości (bądź
częstotliwościach) pochłoniętych przez jądra atomowe.
W praktyce, integracja sygnału rezonansowego informuje o ilości jąder atomowych w próbce
wzbudzonych przez kwanty promieniowania o danej częstotliwości, a co za tym idzie: o ilości jąder,
których sygnał rezonansowy został zarejestrowany w widmie. Informację o ilości jąder, które wchodzą w
skład związku chemicznego i generują dany sygnał rezonansowy, uzyskujemy poprzez podzielenie wartości
integracji tego sygnału przez wartość integracji sygnału odniesienia. Sygnałem odniesienia jest z reguły
sygnał rezonansowy o najmniejszej, sensownej wartości integracji (tj. niepochodzący od ewentualnych
zanieczyszczeń, obecnych w próbce).
III. Widma dwuwymiarowe.
W niniejszym opracowaniu nie sposób omówić nawet uproszczonych założeń teoretycznych
eksperymentów dwuwymiarowych – najbardziej wytrwałych Czytelników odsyłamy do książki Jamesa
Keelera „Understanding NMR Spectroscopy”, gdzie podstawy matematyczne zaprezentowanych poniżej
eksperymentów omówione są wyczerpująco, z uwzględnieniem koniecznego do pełnego zrozumienia
omawianych zagadnień rachunku operatorowego. Pozostałych zaś Czytelników zapraszamy do zapoznania
się z elementami składowymi wyników eksperymentów dwuwymiarowych. Różnice w omówionych
poniżej elementach składowych widm 2D będą stanowiły podstawę rozróżniania poszczególnych rodzajów
eksperymentów.
Poniżej zaprezentowano przykładowy wynik eksperymentu dwuwymiarowego:
6




Każde widmo 2D składa się z następujących elementów składowych:
osi pierwotnej przesunięcia chemicznego (F2, [ppm]);
osi wtórnej przesunięcia chemicznego (F1, [ppm]);
widm jednowymiarowych, nałożonych na oś pierwotną i oś wtórną;
sygnałów korelacyjnych (crosspeak’ów).
Dodatkowo, w zależności od rodzaju eksperymentu, widmo dwuwymiarowe może również zawierać:

sygnały autokorelacyjne.
Widma, które zawierają sygnały autokorelacyjne, są wynikami eksperymentów, w których na
obydwu osiach rejestruje się sygnały rezonansowe jąder tego samego typu (np. jąder wodoru).
Eksperyment tego rodzaju generuje widmo, które jest symetryczne względem osi złożonej z sygnałów
autokorelacyjnych, nazywanej diagonalą. Do eksperymentów tego typu zalicza się m.in.:

COSY (ang. COrrelated SpectroscopY) oraz jego odmiany – gCOSY (ang. gradient COSY) i DQFCOSY (ang. Double-Quantum Filtered COSY);

NOESY (ang. Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY) oraz jego „odmianę”, ROESY (ang.
Rotating-frame Overhauser Effect SpectroscopY);

TOCSY (ang. TOtal Crrelated SpectroscopY).
Podstawą fizyczną powstawania sygnałów korelacyjnych w eksperymentach COSY (i jego
odmianach) oraz TOCSY jest zjawisko sprzężenia spinowo-spinowego pomiędzy wzbudzanymi jądrami.
Oznacza to, iż sygnał korelacyjny (crosspeak), który znajduje się „na przecięciu” sygnału rezonansowego
wybranego jądra na osi F2 i sygnału rezonansowego innego jądra (tego samego typu) na osi F1 jest
dowodem wystąpienia zjawiska sprzężenia skalarnego pomiędzy tymi jądrami w badanej cząsteczce.
Podstawową różnicą w wynikach eksperymentów COSY oraz TOCSY jest zasięg obserwowanego w
widmach zjawiska sprzężenia spinowo-spinowego pomiędzy jądrami. W widmach COSY obserwujemy
głównie sprzężenia geminalne oraz wicynalne, rzadziej sprzężenia dalekiego zasięgu; natomiast
eksperyment TOCSY pozwala na obserwację sprzężeń skalarnych w obrębie całych układów spinowych.
Układem spinowym nazywamy fragment cząsteczki, w którym można zaobserwować sekwencję
sprzężeń spinowo-spinowych. Na przykład: jeżeli proton A sprzęga się z protonem B wicynalną stałą
sprzężenia, a proton B sprzęga się zarówno z protonem A, jak i z protonem C (również wicynalną stałą
sprzężenia), wówczas możemy powiedzieć, iż protony A, B i C należą do jednego układu spinowego i
widmie TOCSY powinny wystąpić sygnały korelacyjne świadczące o sprzężeniach A-B, B-C oraz C-A.
Ostatni, wymieniony sygnał korelacyjny nie powinien wystąpić w widmie COSY, ponieważ odległość
pomiędzy protonami A i C wynosi cztery wiązania chemiczne.
Eksperyment TOCSY dostarcza zatem cennej możliwości „segregowania” sygnałów
rezonansowych w widmie jednowymiarowym na grupy odpowiadające układom spinowym,
występującym w badanej cząsteczce. Dzięki niemu możliwe jest stosunkowo szybkie orzeczenie, na
przykład, do którego aminokwasu należy wybrany spośród kilku sygnałów rezonansowych sygnał
rezonansowy jednego z protonów amidowych, zaobserwowanych w widmie jednowymiarowym badanego
oligopeptydu.
Poniższy rysunek prezentuje oligopeptyd złożony z ośmiu aminokwasów, w którym kolorami
wyróżniono występujące w zaprezentowanej cząsteczce układy spinowe jąder wodoru:
7
Podstawą fizyczną powstawania sygnałów korelacyjnych w eksperymentach NOESY oraz
ROESY jest zjawisko sprzężenia dipolarnego pomiędzy wzbudzanymi jądrami. Oznacza to, iż sygnał
korelacyjny (crosspeak), który znajduje się „na przecięciu” sygnału rezonansowego wybranego jądra na osi
F2 i sygnału rezonansowego innego jądra (tego samego typu) na osi F1 jest dowodem bliskości tych jąder
w przestrzeni.
Istnieje szereg różnic pomiędzy eksperymentami NOESY oraz ROESY, lecz nie będziemy ich
rozważać w niniejszym opracowaniu. Na potrzeby ćwiczenia możemy przyjąć, iż eksperymenty NOESY
oraz ROESY dostarczają informacji tego samego typu.
Widma dwuwymiarowe, które nie zawierają sygnałów autokorelacyjnych, są wynikami
eksperymentów, w których na osiach rejestruje się sygnały rezonansowe jąder różnego typu (np. jąder
1
H na osi F2 i jąder 13C na osi F1). Eksperymenty takie noszą nazwę eksperymentów heterokorelacyjnych i
nie będą rozważane w niniejszym opracowaniu.
IV. Zastosowanie technik NMR w badaniach struktury i aktywności biomolekuł.
Spektroskopia NMR jest podstawową techniką określania struktur cząsteczek organicznych. Ponieważ
niemożliwe jest dokonanie uogólnienia: „cząsteczka organiczna = biomolekuła”, w niniejszej części
opracowania teoretycznego skupimy się na wymienieniu tych aspektów spektroskopii magnetycznego
rezonansu jądrowego, które okazują się użyteczne przy badaniach struktury i aktywności cząsteczek z
rodzaju enzymów, peptydów i kwasów nukleinowych.
Czytelników zainteresowanych badaniami spektroskopowymi biomolekuł nieco mniejszych, acz
popularnych w tzw. „życiu codziennym” (np. mentolu, kofeiny czy węglowodanów prostych), odsyłamy do
wspaniale napisanej i fascynującej książki pt. „Classics in Spectroscopy”, autorstwa Stefana Bergera i
Dietera Sickera.
Rekonstrukcja sekwencji aminokwasowej oligopeptydów i białek możliwa jest głównie dzięki
zastosowaniu dwóch eksperymentów: TOCSY oraz ROESY. Widmo TOCSY pozwala na szybkie
przyporządkowanie sygnałów rezonansowych protonów widocznych w widmie jednowymiarowym do
odpowiednich reszt aminokwasowych; natomiast widmo ROESY pozwala na odtworzenie sekwencji
8
aminokwasowej w kierunku od N-końca do C-końca dzięki efektom ROE, występującym pomiędzy
protonem α n-tej reszty aminokwasowej a protonem amidowym n+1-szej reszty aminokwasowej:
Eksperymenty NMR, które umożliwiają rekonstrukcję sekwencji nukleotydowej w kwasach
nukleinowych, to przede wszystkim zestaw widm NOESY, wykonanych w H2O oraz w D2O. Eksperyment
wykonany w H2O pozwala na obserwację protonów iminowych oraz aminowych, tworzących wiązania
wodorowe w parach Watsona-Cricka, a następnie przyporządkowanie sygnałów rezonansowych do
protonów aromatycznych zasad azotowych:
9
natomiast eksperymenty wykonane w D2O – dzięki wcześniejszemu przyporządkowaniu sygnałów
rezonansowych do protonów wchodzących w skład poszczególnych nukleotydów – pozwalają na
rekonstrukcję sekwencji kwasu nukleinowego w kierunku 5’→ 3’:
Zadaniem o wiele trudniejszym i jednocześnie ważniejszym, niźli rekonstrukcja sekwencji ww.
biopolimerów, jest rekonstrukcja ich stereostruktury. Spektroskopia NMR jest w chwili obecnej jedyną
techniką eksperymentalną, która pozwala na ustalenie struktur przestrzennych biomakromolekuł w
roztworach z rozdzielczością atomową. Współczesna nauka poświęca tej dyscyplinie badań sporo atencji,
co podkreśla fakt, iż w 2002 roku profesor Kurt Wüthrich został współlaureatem Nagrody Nobla w
dziedzinie chemii, właśnie „za wkład w rozwój technik spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego
w celu ustalania trójwymiarowych struktur biologicznych makromolekuł w roztworach”.
Chociaż badania stereochemii białek budzą zdecydowanie większe zainteresowanie wśród badaczy, co
znajduje odbicie w światowej literaturze, nieustanny rozwój instrumentarium i podejść eksperymentalnych
powoli, acz konsekwentnie przyciąga uwagę biofizyków w kierunku kwasów nukleinowych. Swoista
ostrożność badaczy w stosunku do podejmowania badań stereochemii kwasów nukleinowych metodami
spektroskopii NMR wynika z dwóch powodów. Po pierwsze, sygnały rezonansowe protonów wchodzących
w skład kwasów nukleinowych cechuje zdecydowana większa degeneracja przesunięć chemicznych, niż w
przypadku sygnałów rezonansowych protonów wchodzących w skład łańcuchów bocznych aminokwasów,
co dość poważnie utrudnia analizę spektralną. Po drugie, stosunek ilości jąder wodoru do masy
cząsteczkowej fragmentu kwasu nukleinowego wypada zdecydowanie mniej korzystnie, niźli analogiczny
stosunek dla dowolnego polipeptydu, co wymusza przygotowanie większej ilości próbki o możliwie
najwyższej czystości. Nie są to jednak problemy zniechęcające do wszczęcia rzetelnego,
satysfakcjonującego, a nade wszystko - prowadzącego do sukcesu śledztwa, w którym jedynym materiałem
dowodowym jest zestaw danych spektralnych, zaś głównym poszukiwanym - stereostruktura fragmentu
kwasu nukleinowego.
W przypadku enzymów i białek, dane spektralne, które pozwalają na odtworzenie ich stereostruktury
w roztworze, to przede wszystkim:
10


wartości stałych sprzężenia wicynalnego pomiędzy odpowiednimi protonami łańcucha
aminokwasowego, które dostarczają informacji o wartościach odpowiednich kątów torsyjnych
(dzięki równaniu Karplusa, patrz: część II);
więzy odległościowe odpowiednich protonów w przestrzeni, otrzymywane dzięki eksperymentom
NOESY i ROESY (patrz: część III).
W przypadku kwasów nukleinowych, dane spektralne, niezbędne do możliwie wiernego odtworzenia
stereostruktury biomakromolekuły w roztworze są z grubsza te same, co w przypadku białek i enzymów – z
tą różnicą, iż szkielet kwasu nukleinowego, zbudowany z reszt cukrowych i fosforowych, nie pozwala na
badanie wartości odpowiednich kątów torsyjnych dzięki wartościom wicynalnych stałych sprzężenia
skalarnego proton-proton (z uwagi na fakt, że kwasy nukleinowe zawierają zbyt mało atomów wodoru).
Wykonuje się zatem dodatkowy eksperyment heterokorelacyjny HETCOR 1H-31P i bada wartości
wicynalnych stałych sprzężenia spinowo-spinowego jąder wodoru i fosforu, które – dzięki równaniu
Karplusa – pozwalają na odtworzenie konformacji szkieletu kwasu nukleinowego.
Możliwe jest również zastosowanie spektroskopii NMR do badań aktywności enzymów, przede
wszystkim poprzez zdefiniowanie stereostruktury substratu oraz produktu reakcji enzymatycznej.
Informacje o stereostrukturze substratu/produktu reakcji enzymatycznej otrzymuje się w znany już nam
sposób – dzięki znajomości wartości odpowiednich stałych sprzężenia oraz więzów odległościowych
(NOE). Należy jednak pamiętać o pewnej pułapce: widma NMR dwóch enancjomerów tego samego
związku wyglądają identycznie i niemożliwe jest orzeczenie, które z widm obrazuje który z
enancjomerów, bez uprzedniej modyfikacji chemicznej badanych cząsteczek, polegającej na
wprowadzeniu fragmentu zdefiniowanego stereochemicznie (tzw. sondy chiralnej).
Literatura uzupełniająca.
V.
1.
2.
3.
4.
Robert M. Silverstein, Francis X. Webster, David J. Kiemle; Spektroskopowe metody identyfikacji
związków organicznych; 2007;
Joseph B. Lambert, Herbert F. Shurvell, David A. Lightner, R. Graham Cooks; Organic Structural
Spectroscopy; 2001;
James Keeler; Understanding NMR Spectroscopy; 2010;
Stefan Berger, Dieter Sicker; Classics in Spectroscopy; 2009.
Eksperymenty
Eksperyment 1. Zastosowanie spektroskopii NMR do badania stereochemii reakcji katalizowanej przez
fumarazę.
Fumaraza katalizuje reakcję addycji wody do podwójnego wiązania w cząsteczce kwasu fumarowego
z utworzeniem L-jabłczanu lub reakcję eliminacji wody z cząsteczki L-jabłczanu z utworzeniem fumaranu.
Reakcja jest sterospecyficzna. Wykazanie tego zjawiska jest możliwe za pomocą eksperymentów NMR,
jeżeli reakcję przeprowadza się w D2O.
W cząsteczce L-jabłczanu znajdują się trzy protony połączone z atomami węgla: HA, HB i HX. Atom
węgla, z którym połączony jest proton HX, stanowi centrum asymetrii. W konsekwencji, atomy HA i HB są
nierównocenne chemicznie i mają charakter diastereotopowy. Wymiana któregokolwiek z nich na inną
11
grupę funkcyjną (lub na atom deuteru) powoduje powstanie drugiego centrum asymetrii i w efekcie cała
cząsteczka staje się diastereoizomerem.
Protony HA i HB są nierównocenne chemicznie, mają one zatem różne otoczenia chemiczne, a co za
tym idzie – różne wartości przesunięć chemicznych swoich sygnałów rezonansowych. W konsekwencji,
ulegają one wzajemnemu sprzężeniu geminalnemu, a także sprzężeniu wicynalnemu z HX. Sygnał
rezonansowy każdego z protonów w widmie jednowymiarowym jest rozszczepiany w wyniku sprzężenia z
dwoma innymi protonami, przyjmując formę dubletu dubletów.
Reakcja addycji wody (w tym przypadku D2O) do podwójnego wiązania może teoretycznie przebiegać
na dwa sposoby:

addycja anti (trans): D+ i OD- atakują atomy węgla wiązania podwójnego po przeciwnych stronach
płaszczyzny cząsteczki fumaranu;

addycja syn (cis): D+ i OD- atakują atomy węgla wiązania podwójnego po tej samej stronie
płaszczyzny cząsteczki fumaranu;
W pierwszym przypadku produktem reakcji addycji byłby (2R, 3S)-3-deuterojabłczan, natomiast w
drugim przypadku powstawałby (2S, 3S)-3-deuterojabłczan. W obu przypadkach generowane są dwa centra
chiralne.
Zastąpienie HA lub HB przez atom deuteru, które ma miejsce w wyniku reakcji katalizowanej przez
12
fumarazę w D2O, powoduje uproszczenie widma 1H NMR w wyniku zaniku jednego ze sprzężeń
wicynalnych protonu HX. Znając oczekiwaną wielkość wicynalnych stałych sprzężenia w zależności od
wartości kąta dwuściennego (na podstawie krzywej Karplusa), można określić, który z protonów, HA czy
HB, został podstawiony przez D w wyniku reakcji katalizowanej przez fumarazę. Wiedza ta pozwoli z
kolei ustalić, czy addycja D2O do podwójnego wiązania w cząsteczce fumaranu ma charakter syn, czy anti.
Materiały
1.
2.
3.
Roztwór L-jabłczanu. 200 mM L-jabłczan w D2O buforowanym 100 mM fosforanem, pH 7,3;
Roztwór fumaranu. 200 mM kwas fumarowy w D2O buforowanym 100 mM fosforanem, pH 7,3;
Fumaraza świńska. Roztwór 1,0 mg/ml w D2O buforowanym 100 mM fosforanem, pH 7,3.
Wykonanie eksperymentu
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Umieść po 0,8 ml roztworów L-jabłczanu i fumaranu w oddzielnych, czystych kuwetach NMR.
Otrzymaj widmo 1H NMR dla obu próbek.
Umieść po 0,8 ml roztworów L-jabłczanu i fumaranu w oddzielnych, czystych probówkach i dodaj
po 5 l roztwory fumarazy. Zamieszać zawartość probówek i pozostaw na 30 minut w temperaturze
pokojowej.
Przenieś zawartości probówek do świeżych, czystych kuwet NMR. Otrzymaj widmo 1H NMR dla
obu próbek.
Przeprowadź analizę wszystkich otrzymanych widm. Zapisz wartości przesunięć chemicznych
wszystkich sygnałów rezonansowych.
Przyporządkuj każdy sygnał obecny w widmach L-jabłczanu i fumaranu do protonów w
odpowiednich cząsteczkach. Oblicz wicynalne stałe sprzężenia spinowo-spinowego JAX i JBX oraz
stałą sprzężenia geminalnego JAB.
Zidentyfikuj i zinterpretuj zmiany w widmach NMR zachodzące w wyniku reakcji enzymatycznej.
Przyporządkuj wszystkie sygnały rezonansowe do protonów w widmach mieszanin poreakcyjnych.
W raporcie z wykonania ćwiczenia odpowiedz na następujące pytania:
1.
2.
3.
Jaka jest przyczyna różnic w wartościach stałych JAX i JBX w widmie L-jabłczanu?
Jakich zmian w widmie NMR należałoby oczekiwać, jeżeli reakcja addycji/eliminacji
przebiegałaby syn, anti lub niestereospecyficznie?
Jaka jest rzeczywista stereochemia reakcji katalizowanej przez fumarazę?
Eksperyment 2. Ustalanie sekwencji oligopeptydu za pomocą spektroskopii 2D NMR.
Otrzymasz zestaw widm dwuwymiarowych, złożony z eksperymentów TOCSY oraz ROESY,
zawierających dane spektralne krótkiego oligopeptydu, a także informację o aminokwasach go budujących.
Twoim zadaniem będzie ustalenie sekwencji połączeń pomiędzy aminokwasami.
13