II. Badanie lekowrażliwości drobnoustrojów – ćwiczenia praktyczne

II. Badanie lekowrażliwości drobnoustrojów – ćwiczenia praktyczne
Ćwiczenie 1. Oznaczanie lekowrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową
Zasada metody: Krążki bibułowe nasycone odpowiednimi ilościami antybiotyków nakłada
się na powierzchnię podłoża Muellera – Hintona z wysianym szczepem bakterii. Antybiotyk
dyfunduje z krążka do podłoża agarowego hamując wzrost szczepu wrażliwego wokół krążka.
Po okresie inkubacji mierzy się średnicę strefy zahamowania wzrostu wokół krążka
w milimetrach. Na podstawie wielkości średnicy strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka
dokonujemy oceny wrażliwości szczepu – wg ustalonych, okresowo publikowanych na stronie
http://www.korld.edu.pl wartości granicznych stref zahamowania dla poszczególnych bakterii
i antybiotyków, ustalamy czy szczep jest wrażliwy, oporny, średnio wrażliwy na zawarty w krążku
antybiotyk.
Wykonanie oznaczenia:
I.
Przygotowanie zawiesiny (inokulum) badanego szczepu.
a. Metoda bezpośredniego zawieszania kolonii badanego szczepu w bulionie lub
jałowym roztworze soli fizjologicznej (0,85% NaCl), do zmętnienia równego 0,5
w skali Mc Farland’a – wytrząsać około 15-20 sek.
b. Metoda standardowa (wzrost w fazie logarytmicznej) w której 4-5 wyizolowanych
kolonii przesiewa się na bulion i inkubuje 2-8h w 350 – 370C, aż do uzyskania
zmętnienia 0,5 w skali Mc Farland’a.
Nie później niż w ciągu 15’ od przygotowania zawiesiny (nie wcześniej niż przed
upływem 3’) wykonać posiew inokulum wg schematu:
II.
1
2
3
III.
IV.
V.
VI.
Nie później niż w ciągu 15’ od wykonania posiewu nałożyć krążki.
Nie później niż w ciągu 15’ od nałożenia krążków wstawić płytki do cieplarki.
Inkubować 16 – 18 godzin w temp. 33-350C w warunkach tlenowych.
Odczyt wyników i ich interpretacja.
Na podłożach przeźroczystych, odczytać średnicę zahamowania wzrostu wokół krążka
z antybiotykiem, trzymając płytkę 5-8 cm nad czarną powierzchnią oświetloną z boku,
z dokładnością do 1 mm, przykładając miarkę od tyłu.
Na podłożach nieprzeźroczystych – oświetlić płytkę światłem padającym z boku pod kątem
450 i odczytać strefę zahamowania wzrostu (nie odczytywać strefy hemolizy)
Antybiotyk
Strefa zahamowania
wzrostu w mm
Interpretacja wyniku
Wynik zinterpretować wg wartości granicznych podanych na stronie http://www.korld.edu.pl.
Interpretacja wyniku: wrażliwy, średnio wrażliwy, oporny
Przykład odczytu:
Wnioski:
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………
Ćwiczenie 2. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości
z przykładowych płytek
Wykonanie odczytu: Na podłożach przeźroczystych, odczytać średnicę zahamowania
wzrostu wokół krążka z antybiotykiem, trzymając płytkę 5-8 cm nad czarną powierzchnią
oświetloną z boku, z dokładnością do 1 mm, przykładając miarkę od tyłu.
Na podłożach nieprzeźroczystych – oświetlić płytkę światłem padającym z boku pod
kątem 450 i odczytać strefę zahamowania wzrostu (nie odczytywać strefy hemolizy).
1. Wynik badania lekowrażliwości dla szczepu …………………………………………...
Antybiotyk
Strefa zahamowania
wzrostu w mm
Interpretacja wyniku
Wnioski:
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………
Ćwiczenie 3. Interpretacja wyniku oznaczania MIC metodą E-testów
Zasada metody: Badanie ilościowe przy użyciu E-testów pozwala określić najmniejsze
stężenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustrojów, czyli wartość MIC (ang. minimal
inhibitory concentration) w oparciu o dyfuzję do podłoża z wzrastającymi bakteriami,
antybiotyku zawartego w pasku plastikowym w odpowiednim gradiencie stężeń.
Na powierzchni paska znajduje się podziałka z kolejnymi stężeniami antybiotyku. Określenie
wartości MIC następuje na podstawie odczytu stężenia antybiotyku z podziałki paska,
w miejscu, w którym brzeg strefy zahamowania wzrostu przecina się z paskiem E-testu.
Wykonanie oznaczenia:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Przygotować podłoże MHA.
Przygotować zawiesinę bakteryjną o gęstości 0,5 McFarlanda.
Nanieść 100 µl zawiesiny na płytkę i rozprowadzić w trzech kierunkach lub nanieść
zawiesinę wymazówką na płytkę rozprowadzając w trzech kierunkach; stosować jedną
wymazówkę na jedna płytkę.
Nanieść pasek z antybiotykiem.
Inkubować w 35C w atmosferze tlenowej przez 48 godzin.
Odczytu dokonać w świetle przechodzącym z użyciem lupy po 24 i 48 godzinach.
Obecność pojedynczych kolonii i podrost w strefie zahamowania wzrostu wokół paska
traktować należy jako oporność na dane stężenie antybiotyku.
Wykonanie ćwiczenia: dokonać pomiaru odczytu wartości MIC
antybiotyk
szczep
Odczyt wartości MIC
Wnioski:
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………
Ćwiczenie 4. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą
seryjnych rozcieńczeń.
Zaletą tej metody jest możliwość oznaczania najmniejszego stężenia leku hamującego wzrost
drobnoustrojów (MIC)
Oznaczenie lekowrażliwości tą metodą może być wykonane:
- w probówkach – metoda makrorozcieńczeń
- w płytkach titracyjnych – metoda mikrorozcieńczeń
Wykonanie oznaczenia: Wykonać szereg dwukrotnych rozcieńczeń badanego antybiotyku
w bulionie Muller’a-Hinton’a wg schematu:
1. Jałowe probówki w statywie napełnić podłożem w ilości 2 cm3, a następnie do 1 probówki
dodać 2 cm3 roztworu zawierającego antybiotyk w określonym stężeniu (w mg/dm3).
2. Po wymieszaniu z 1 probówki przenieść jałową pipetą 2 cm3 do drugiej probówki.
3. Dalsze rozcieńczenia wykonuje się w analogiczny sposób, aż do ostatniej probówki,
z której odrzuca się 2 cm3.
4. Do tak wykonanego szeregu rozcieńczeń dodać zawiesiny drobnoustrojów.
(Przygotowując zawiesinę wyjściową o gęstości 1 x 108 komórek co odpowiada
zmętnieniu 0,5 w skali Mc Farlanda)
5. Dodać taką ilość zawiesiny, aby gęstość końcowa w probówce wynosiła 5 x 105
komórek/cm3.
6. Po przygotowaniu całość inkubować 16-20 godzin w temperaturze 350C.
7. Po inkubacji określić, probówkę z najmniejszym stężeniem antybiotyku, przy którym nie
stwierdza się wzrostu drobnoustrojów (brak zmętnienia podłoża), i która poprzedza probówkę,
w której zmętnienie następuje. Stężenie antybiotyku w tej probówce określa wartość MIC.
antybiotyk
szczep
Odczyt wartości MIC
Wnioski:
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………