cwiczenie 4

Zastosowanie dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej do separacji kumaryn
Wstęp
Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki dwuwymiarowej chromatografii
cienkowarstwowej (2D-TLC) do separacji i identyfikacji kumaryn. W trakcie ćwiczenia
zostanie wykonana ekstrakcja kumaryn ze sproszkowanych korzeni arcydzięgla w aparacie
Soxhleta. Następnie ekstrakt zostanie rozdzielony techniką 2D-TLC, co umożliwi
identyfikację wybranych kumaryn arcydzięgla.
5
4
6
3
7
2
8
O
O
1
Rys. 1. Struktura benzo-α-pironu.
Kumaryny są pochodnymi benzo-α-pironu (rys. 1) występującymi zarówno w postaci
wolnej oraz jako glikozydy. Ze względu na budowę strukturalną wyodrębnia się cztery typy
kumaryn: kumaryny proste, izokumaryny, furanokumaryny oraz piranokumaryny.
KUMARYNY PROSTE
HO
O
O
H3CO
O
O
ostol
umbeliferon
7-hydroksykumaryna
H3C
CH3
FURANOKUMARYNY
O
O
O
O
O
O
O
O
psoralen
angelicyna
H3CO
O
O
O
bergapten
5-metoksypsoralen
O
H3CO
ksantotoksyna
8-metoksypsoralen
Rys. 2. Wzory strukturalne wybranych kumaryn prostych oraz furanokumaryn występujących w arcydzięglu
1
Najbogatszym źródłem kumaryn są rośliny z rodzin Rutaceae oraz Apiaceae.
Arcydzięgiel litwor (Angelica archangelica, synonim Archangelica officinalis) przedstawiciel
rodziny Apiaceae zawiera między innymi furanokumaryny: angelicynę, archangelicynę,
bergapten, imperatorynę, ksantotoksynę oraz kumaryny proste: ostol i umbeliferon (rys. 2).
Zawartość ostolu wynosi nawet około 0,2 % suchej masy korzenia arcydzięgla. Archangelicae
radix (korzeń arcydzięgla) jest wykorzystywany w lecznictwie (w zaburzeniach trawienia,
wzdęciach, jako środek wzmagający łaknienie i pobudzający wydzielanie soku trawiennego).
Uwaga: furanokumaryny mają działanie fotouczulające.
Kumaryny są substancjami stosunkowo lotnymi o charakterystycznym zapachu.
Rozpuszczalność kumaryn zależy od obecności (bądź nie) wiązania glikozydowego oraz od
podstawników hydroksylowych w cząsteczkach. Glikozydy kumarynowe rozpuszczają się
dobrze w wodzie i polarnych rozpuszczalnikach takich jak metanol i etanol. Furanokumaryny
i piranokumaryny są rozpuszczalne w średniopolarnych i niepolarnych rozpuszczalnikach
takich jak chlorek metylenu, chloroform czy eter naftowy. Dobór rozpuszczalnika do
ekstrakcji kumaryn zależy od rodzaju kumaryn występujących w badanej próbce.
Analizy TLC kumaryn są najczęściej wykonywane na żelu krzemionkowym. Fazy
ruchome stosowane do separacji furanokumaryn i piranokumaryn to mieszaniny: eter
naftowy-eter dietylowy, toluen-octan etylu, heksan-octan etylu natomiast do separacji
kumaryn prostych: średniopolarne rozpuszczalniki takie jak na przykład chlorek metylenu.
Analizy TLC kumaryn monitoruje się za pomocą światła UV. Kumaryny wykazują
silne właściwości fluorescencyjne pod wpływem promieniowania UV, co powoduje, że ich
detekcja jest stosunkowo prosta. Fluorescencja jest to zjawisko emitowania przez niektóre
związki chemiczne światła pod wpływem naświetlania zewnętrznym promieniowaniem.
Można zaobserwować charakterystyczne kolory plamek kumaryn; na przykład: niebieski
(umbeliferon), niebiesko-zielony (ksantotoksyna), żółto-zielony (izopimpinelina) pod
wpływem światła UV o długości fali 365 nm. Obserwowane kolory kumaryn nie pozwalają
na ich ostateczną identyfikację i mogą być jedynie wskazówką przy identyfikacji.
Niestety występujące w naturze mieszaniny kumaryn są trudne do rozdzielenia za
pomocą jednowymiarowych technik TLC. Dlatego do separacji kumaryn stosuje się często
technikę dwuwymiarową (2D-TLC) dla pełnego rozdzielenia związków o podobnych
właściwościach chemicznych. Pojedynczą próbkę nanosi się w jednym rogu płytki TLC, którą
następnie rozwija się w pierwszym kierunku (rys. 3). Składniki próbki są częściowo
2
rozdzielone wzdłuż jednego boku płytki. Chromatogram po wysuszeniu i obróceniu o 90° jest
rozwijany ponownie w drugim kierunku z użyciem fazy ruchomej o innym składzie.
Rys. 3. Dwuwymiarowa chromatografia cienkowarstwowa
Część doświadczalna
Ekstrakcja
Odważyć około 5 g zmielonego korzenia arcydzięgla za pomocą wagi precyzyjnej w
zlewce o V = 100 ml. Wprowadzić próbkę do gilzy, którą po zamknięciu niewielką ilością
waty należy umieścić w aparacie Soxhleta. Do kolby okrągłodennej o V = 250 ml wrzucić
kamyczki wrzenne i wprowadzić 120 ml eteru naftowego. Kolbę wraz z zawartością umieścić
w płaszczu grzejnym, połączyć z aparatem Soxhleta oraz chłodnicą zwrotną. Po włączeniu
przepływu wody przez chłodnicę należy włączyć stabilizator napięcia i ustawić jego pokrętło
w pozycji 2 - 3. Ekstrakcję prowadzić 1,5 godziny, po czym wyłączyć ogrzewanie. Zawartość
kolby ekstrakcyjnej przenieść przez lejek porcjami do kolby o V = 100 ml, zatężyć do
objętości około 1,0 – 1,5 ml na odparowywaczu obrotowym w temp. ≤ 30°C, następnie
przelać do szklanej ampułki i zatężyć w strumieniu azotu do objętości 0,25 ml.
Chromatografia cienkowarstwowa TLC
Należy wykonać analizy TLC ekstraktu z korzenia arcydzięgla oraz wzorców kumaryn
(bergapten, umbeliferon, ksantotoksyna) na małych płytkach TLC (o wymiarach 4 × 6,5 cm)
przy użyciu następujących faz ruchomych:
- faza 1: chloroform,
- faza 2: eter naftowy-octan etylu (70:30, v/v).
Należy policzyć wartości współczynników opóźnienia (RF) dla rozdzielanych
wzorców kumaryn oraz składników ekstraktu z obu analiz.
3
Następnie należy wykonać analizę TLC ekstraktu z korzenia arcydzięgla przy
zastosowaniu techniki dwuwymiarowej na dużej płytce TLC (o wymiarach 10 × 10 cm). W
tym celu należy nanieść ekstrakt na płytkę w lewym dolnym rogu w odległości 1,5 cm od obu
brzegów płytki. Nie należy nanosić na jedną płytkę dwóch (lub więcej) różnych roztworów.
Rozwijanie chromatogramu w jednym kierunku trwa co najmniej 0,5 godziny.
Odpowiednio wcześniej należy przygotować dwie duże komory chromatograficzne
zawierające:
- komora 1 – faza 1: chloroform,
- komora 2 – faza 2: eter naftowy-octan etylu (70:30, v/v).
Rozwinąć chromatogram przy użyciu fazy 1. Wysuszyć bardzo dokładnie płytkę tak,
aby usunąć całkowicie rozpuszczalnik. Obejrzeć płytkę TLC w świetle UV i bardzo delikatnie
obrysować plamki ołówkiem. Nie wolno zniszczyć powierzchni sorbentu. Należy policzyć
wartości współczynników opóźnienia (RF) dla składników ekstraktu.
Rozwinąć ponownie chromatogram przy użyciu fazy 2 w kolejnej komorze
chromatograficznej. W tym celu należy płytkę wprowadzić do komory obróconą o 90° w
lewo. Powtórnie obejrzeć płytkę TLC w świetle UV i bardzo delikatnie obrysować plamki
ołówkiem. Następnie policzyć wartości współczynników opóźnienia (RF) dla składników
ekstraktu.
Zidentyfikować
składniki
ekstraktu
dzięki
porównaniu
ich
wartości
współczynników opóźnienia z wartościami uzyskanymi dla wzorców kumaryn przy użyciu
obu faz.
Procedura analizy TLC. Napełnić odpowiednią komorę chromatograficzną fazą
ruchomą (mała komora: V = 3 ml, duża komora: V = 40 ml). Przygotować płytki TLC, czyli
narysować delikatnie miękkim ołówkiem:
- linię startową około 1 cm od dolnego brzegu płytki i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia
próbek,
- linię końcową około 1 cm od górnego brzegu płytki.
Nanieść na płytkę po około 1 µL roztworów badanych wzorców (około 2 - 4 µL
roztworu ekstraktu), uważając, aby plamka nie miała średnicy większej niż 2 mm; im
mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie plamki w czasie rozwijania chromatogramu.
Średnica plamki ma szczególne znaczenie w 2D-TLC. Można powtarzać nanoszenie
roztworu po jego wyschnięciu na płytce. Ilość nanoszonego roztworu zależy od jego stężenia.
Badane związki mają właściwości fluorescencyjne, co powoduje, że łatwo można
kontrolować ilość nanoszonego roztworu. Należy nanieść taką ilość roztworu, aby uzyskać
intensywne zabarwienie plamki widoczne w świetle UV.
4
Delikatnie, przy pomocy pęsety, wstawić płytkę TLC z naniesionymi substancjami do
komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory. Zamknąć komorę
i rozwijać chromatogram, do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości 1 cm
od górnego brzegu płytki, następnie wyjąć i wysuszyć dokładnie płytkę.
Obejrzeć płytkę TLC w świetle UV, obrysować plamki ołówkiem, zrobić zdjęcie lub
zeskenować płytkę TLC i dołączyć do sprawozdania. Wyznaczyć współczynniki opóźnienia
RF i zanotować zabarwienie dla wszystkich plamek. Zidentyfikować składniki ekstraktu.
Literatura
1. Waksmundzka-Hajnos M., Hawrył M.A. Application of TLC in the isolation and analysis of coumarins. W:
Thin layer chromatography in Phytochemistry. Waksmundzka-Hajnos M., Sherma J., Kowalska T. (red.), CRC
Press, Boca Raton, 2008.
2. Cieśla Ł., Waksmundzka-Hajnos M. Two-dimensional thin-layer chromatography in the analysis of secondary
plant metabolites. Journal of Chromatography A, 1216, 2009, 1035–1052.
3. Wagner H., Bladt S. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. Springer, 2009.
Szkło i odczynniki
TLC:
płytki do TLC silica gel 60 firmy Merck, o
Ekstrakcja:
wymiarach 4 × 6,5 cm oraz 10 × 10 cm,
suszony korzeń arcydzięgla (archangelicae radix),
strzykawka lub kapilary do TLC,
zlewka V = 100 ml,
chlorek metylenu do mycia strzykawki V = 25 ml,
łyżka,
2 małe komory chromatograficzne do TLC,
zestaw do ekstrakcji w aparacie Soxhleta (płaszcz
2 duże komory chromatograficzne do TLC,
grzejny,
metalowa pęseta,
regulator
napięcia,
aparat
Soxhleta,
chłodnica zwrotna, kolba okrągłodenna V=250 ml),
pipeta V = 5 ml,
gilzy do ekstrakcji,
pompka do pipet,
kamyczki wrzenne do destylacji,
cylinder miarowy V = 50 ml,
cylinder miarowy V = 250 ml,
linijka oraz miękki ołówek,
kolbka do odparowywacza V = 100 ml,
pisak do szkła,
reduktor do odparowywacza,
chloroform V = 100 ml,
lejek średni,
octan etylu V = 100 ml,
statyw do lejka,
roztwór eter naftowy-octan etylu (70:30, v/v) V =
eter naftowy V = 250 ml,
100 ml,
wata
roztwór wzorcowy bergaptenu c = 5 mg/ml,
roztwór wzorcowy umbeliferonu c = 5 mg/ml,
roztwór wzorcowy ksantotoksyny c = 5 mg/ml,
ręczna suszarka do włosów
Uwaga: Nie wolno suszyć komór chromatograficznych w suszarce, ponieważ pękają!
W archiwizacji płytek TLC pomocny jest cyfrowy aparat fotograficzny.
5