Artykuł naukowy

Agnieszka Jóźwiak
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
Wydział Farmaceutyczny
Zakład Chemii Nieorganicznej
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jako technika oceny tożsamości substancji roślinnych.
TLC jest szeroko stosowaną techniką analityczną w analizie jakościowej substancji roślinnych.
Chromatografia cienkowarstwowa pozwala potwierdzić tożsamość substancji roślinnych, odróżnić
gatunki blisko spokrewnione, ocenić obecność zanieczyszczeń/zafałszowań. Jest to technika, która w
połączeniu z detekcją biologiczną może służyć do szybkiej oceny ekstraktów roślinnych pod kątem ich
działania biologicznego (przeciwdrobnoustrojowego, zmiatającego wolne rodniki, hamującego
działanie niektórych enzymów). Przewagą techniki TLC nad również szeroko stosowaną techniką
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) jest to, że jest to technika stosunkowo prosta,
tania,
dająca możliwość analizy kilku próbek jednocześnie, bez ich wstępnego oczyszczania.
Zastosowanie rożnych adsorbentów, eluentów, sposobów elucji oraz sposobów wizualizacji plamek
pozwala na rozdzielnie składników bardzo złożonych matryc, jakimi są najczęściej ekstrakty roślinne.
Zaletą metody jest niewątpliwie łatwość dokumentowania i prezentacji wyników w postaci zdjęć,
wideoskanów, densytogramów.
Technika TLC (szczególnie w zakresie analizy jakościowej typu fingerprint) jest zalecana przez
Farmakopeę Europejską, Europejską Agencję Leków (EMA) oraz Amerykańska Agencja ds. Leków i
Żywności (FDA) do oceny tożsamości substancji roślinnych, przetworów roślinnych, do oceny
zanieczyszczeń próbki, oceny jakości produktów leczniczych roślinnych (tym samym ich procesów
wytwarzania), jak również stabilności tychże produktów.
Fingerprint TLC (tzw. chromatograficzny „odcisk palca”) to charakterystyczny układ pasm lub
pików, pozwalający znaleźć różnice międzygatunkowe czy zanieczyszczenia badanej substancji
roślinnej. Kolejnym etapem analizy tego typu jest porównanie otrzymanych wideoskanów bądź
chromatogramów, biorąc pod uwagę: ilość, kolor, intensywność barwy oraz rozmieszczenie
poszczególnych pasm/plamek w uzyskanych obrazach. Do oceny próbek o podobnych profilach
chromatograficznych stosuje się porównanie uzyskanego obrazu z wzorcami pojedynczych
składników próbki, wzorcami danej rośliny lub występujących w roślinie zanieczyszczeń (np.
stosowane w monografiach farmakopealnych wzorce typu HRS). Oceny uzyskanego obrazu można
dokonać poprzez zwykłą ocenę wizualną lub też za pomocą różnych technik przetwarzania obrazu.
Zastosowanie tych ostatnich pozwala na chemometryczną analizę zgromadzonych danych, tym
samym na statystyczną ocenę różnic i podobieństw między analizowanymi próbkami.
Do analizy typu fingerprint techniką
TLC
stosuje
się
najczęściej
analizę
jednowymiarową TLC zastosowaniem różnych
odczynników wywołujących, wizualizacji przy
różnych długościach fali, czy z wykorzystaniem
różnych rodzajów detekcji (Rys 1. Fingerprint
dwóch gatunków z rodzaju Potentilla –
odczynnik
wywołujący:
Liebermann-
Burchard, A - obraz w świetle widzialnym, B –
366 nm ).
W analizie wielu substancji roślinnych jednowymiarowe TLC jest niewystarczające do
konstrukcji charakterystycznego „odcisku palca” (np. dla ekstraktów otrzymanych
małoselektywnymi rozpuszczalnikami czy roślin zawierających substancje znacząco różniące
się polarnością). Jednym ze stosowanych wówczas rozwiązań jest zastosowanie techniki jest
tworzenie wielokrotnych odcisków palca (multiple chromatographic fingerprinting). W
praktyce najczęściej stosuje się podwójne odciski palca (binary chromatographic
fingerprints), opracowane w oparciu o jedną bądź dwie różne techniki chromatograficzne.
Coraz szerszej do konstrukcji fingerprint TLC wykorzystuje się wielowymiarową
chromatografię planarną. W literaturze opisano następujące rodzaje planarnych technik
wielowymiarowych (wg Schoenmakers oraz Nyiredy):
technika, w której dwukierunkowego rozwinięcia dokonuje się na tej samej płytce
przy użyciu dwóch różnych eluentów, bądź rozwinięcie realizowane jest na płytkach
dwufazowych z wykorzystaniem tej samej, albo różnych faz ruchomych (prosta
dwukierunkowa chromatografia cienkowarstwowa (comprehesive two dimensional
planar chromatography) (PCxPC)
technika polegająca na rozwinięciu w drugim kierunku włącznie wybranych
pasm/plamek
(celowana
bądź
selektywna
dwukierunkowa
chromatografia
cienkowarstwowa (targeted or selective two-dimensional planar chromatography)
(PC+PC)
technika, w której w pierwszym kierunku płytka rozwijana jest fazami ruchomymi o
malejącej sile elucyjnej i takich samych parametrach selektywności, natomiast w
kierunku prostopadłym dokonuje się rozwinięć mieszaninami rozpuszczalników o
różnych
wartościach
selektywności,
ale
o
stałej
sile
elucji
(regulowana
dwukierunkowa chromatografia cienkowarstwowa (modulated two dimensional
planar chromatography) (nPC)
technika, w której składniki częściowo rozdzielone na pierwszym adsorbencie
przenoszone są na drugi adsorbent, z wykorzystaniem rozpuszczalników o dużej sile
elucyjnej, np. metanolu, a następnie rozdzielane są w drugim kierunku na innym
adsorbencie (dwukierunkowa chromatografia cienkowarstwowa na adsorbentach
łączonych (coupled layer planar chromatography) (PC-PC)
technika
łącząca
chromatografię
cienkowarstwową
z
innymi
technikami
chromatograficznymi (HPLC-TLC; TLC-GC)
Chromatografia dwukierunkowa może być realizowana
z użyciem różnych adsorbentów tj. żel
krzemionkowy, celuloza, poliamid, żel cyjanopropylowy czy żel aminopropylowy.
W ostatnich latach obserwuje się znaczący rozwój chromatografii planarnej połączonej z
detekcją biologiczną. Ocena aktywności biologicznej składników próbki po ich rozdzieleniu na płytce
chromatograficznej pozwala na szybkie wyszukiwanie związków aktywnych w badanym kierunku.
Najczęściej badane właściwości biologiczne to: zmiatanie wolnych
(najczęściej z
zastosowaniem roztworów stabilnych rodników np. DPPH (1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl),
działanie przeciwdrobnoustrojowe (ocena hamowania wzrostu E.coli, B.sublilis, Candida albicans).
Ciekawą kwestią jest również poszukiwanie związków będących inhibitorami wybranych enzymów,
odgrywających ważną rolę, w szlakach metabolicznych.
Rys 2. Fingerprint 3 wybranych gatunków
Potentilla; obraz otrzymany po zanurzeniu
płytki w zawiesinie bakteryjnej B.subtilis oraz
inkubacji w wilgotnej komorze; następnie
płytki TLC spryskano wodnym roztworem
barwnika
tetrazoliowego
MTT;
po
wysuszeniu w temperaturze pokojowej,
pojawiły
się
zahamowania
fioletowym tle.
kremowo-białe
wzrostu
bakterii
strefy
na
Coraz szersze zastosowanie biodetekcji w chromatografii planarnej wynika z faktu, że jest to jedyna
technika chromatograficzna dająca bezpośredni dostęp do rozdzielonych składników. Nie bez
znaczenie również pozostaje fakt, że tylko w tej technice można prowadzić analizę kilkunastu próbek
jednocześnie (co znacząco skraca czas i koszt prowadzenia analiz) oraz fakty, że próbka do tej analizy
nie podlega czaso i kosztochłonnemu procesowi oczyszczania. Te wszystkie zalety techniki TLC
powoduję, że jest to technika doskonale nadająca się do monitoringu próbek pod kątem ich
aktywności biologicznej. W dalszych etapach można poddać identyfikacji związki o potwierdzonym
już działaniu biologicznym.
Jak wynika z powyższych rozważań, badania typu fingerprint mogą służyć nie tylko jako
element kontroli jakości substancji roślinnych czy produktu leczniczego roślinnego, ale również jako
podstawa do badań chemotaksonomicznych oraz w poszukiwaniu nowych gatunków roślin o
potencjale leczniczym zbliżonym do tych cenionych pod względem medycznym.
Literatura:
Sz. Nyiredy, Recent applications in multidimensional chromatography, LC-GC Europe 2003,
V.16, p.52
P. Schoenmakers, LC-GC Eur. 3 (2003) 2.
EMA/CPMP/QWP/2820/00 Rev. 2 Guideline on specifications: test procedures and
acceptance criteria for herbal substances1, herbal preparations2 and herbal medicinal
products3/traditional herbal medicinal products