ANALIZA TOKSYKOLOGICZNA

Zależności między pracą analityka (określenie poziomu stężenia
ksenobiotyków) i pracą (eko)toksykologa (oszacowanie zagrożenia dla
populacji)
Ekspozycja
ANALIZA
TOKSYKOLOGICZNA
Toksykologia
We współczesnej analizie śladowej mamy do czynienia z wykrywaniem substancji na
poziomie ppm i ppb. Aby oznaczyć tak małe ilości substancji chemicznych w
skomplikowanej matrycy, jaką są próbki środowiskowe, niezbędne jest
przygotowanie procedury składającej się z kilku etapów:
pobieranie próbki,
przechowywanie,
wstępne przygotowanie obejmujące wyodrębnienie od matrycy, zatężanie czy
przekształcanie analitu w postać bardziej trwałą lub dogodną dla końcowego
oznaczania,
analiza właściwa,
obróbka danych.
Dawka (doza)
Zagrożenie dla
życia
(osobnicze)
Zagrożenie dla
populacji
Stężenie
zanieczyszczenia (np. w
powietrzu)
Ekspozycja
Dawka
Zagrożenie dla życia
(osobniczne)
Czas ekspozycji
Parametry
dozymetryczne
(określają dostępność i
łatwość penetracji
ludzkiego ciała przez
toksynę)
Współczynnik
odpowiedzi
Wielkość populacji
poddawanej ekspozycji
(mg.dzień.m-3)
(mg.kg-1.dzień-1)
Prawdopodobieństwo
zachorowania na raka
w ciągu całego życia
Liczba przypadków
raka na rok
Istotne znaczenie dla wyników analizy chemiczno-toksykologicznej ma sposób
pobrania i następnie przechowywania materiału do badań.
W tym celu zostało wprowadzone postępowanie nazwane Systematyczną Analizą
Toksykologiczną (STA). Jest ono rozumiane jako poszukiwanie nieznanej substancji
toksycznej na tle innych, tworzących matrycę.
Uwzględniając relacje między miejscem pracy przyrządu a miejscem pobrania
próbki, można wyróżnić trzy typy powiązań etapóu pobierania próbki z etapem
oznaczeń końcowych:
•On-line – przyrząd pomiarowy jest montowany na boczniku linii do przesyłania
analizowanego medium, strumień próbki po przejściu przez analizator może być
zawracany do linii przesyłowej lub traktowany jako produkt odpadowy
•In-line – przyrząd pomiarowy jest montowany bezpośrednio na linii do przesyłania
medium analizowanego (np. dukt gazów odlotowych)
•Off-line – próbka jest pobierana do pojemnika i transportowana do laboratorium w
celu przeprowadzenia analizy
Pobieranie i przechowywanie próbek
Jednym z najważniejszych zadań analityka jest pobranie reprezentatywnej próbki, gdyż
błędów popełnionych na etapie poboru próbek nie można skorygować w dalszym toku
analizy.
Pobieranie próbek jest procesem o zasadniczym znaczeniu dla poprawności wyników badań,
wymagającym odpowiedniego zaprogramowania i realizacji. Analityk musi sprecyzować cel
badań, który w znacznym stopniu determinuje lokalizację miejsc poboru próby, czas trwania,
częstotliwość i technikę pobierania, sposób postępowania z pobranymi próbkami oraz wybór
metod analizy.
Wyróżnia się trzy podstawowe cele pobierania próbek:
kontrolę jakości w celu stwierdzenia zgodności badanych parametrów z obowiązującymi
wymaganiami, której wyniki służą do podejmowania doraźnych i krótkoterminowych decyzji,
charakterystykę jakości prób do wyznaczania lub prognozowania zmienności parametrów
jakościowych prób w czasie oraz do długookresowych potrzeb kontrolnych,
identyfikację źródeł lub przyczyn zmian jakości oraz ustalenia okresowości ich pojawiania
się.
Stabilizację składu i właściwości próbek uzyskuje się często poprzez dodanie odpowiednich
środków utrwalających, zmniejszających lub całkowicie hamujących aktywność biologiczną
organizmów występujących w próbkach, eliminujących zjawisko adsorpcji składników próbek
na ściankach naczyń, ulatnianie się, rozkład termiczny, reakcje chemiczne i in. Jeśli próbki
nie mogą być analizowane bezpośrednio po pobraniu powinny być przechowywane w
szklanych, szczelnych pojemnikach w ciemności i w obniżonej temperaturze.
Np. do oznaczania chlorowcopochodnych węglowodorów i węglowodorów aromatycznych:
stosuje się naczynia szklane,
próby schładza do temperatury 2-5ºC i przechowuje nie dłużej niż 1 tydzień w ciemności,
WWA w wodzie utrzymują stabilność przechowywane w ciemności przez 72 h w szklanym
naczyniu po dodaniu chloroformu w ilości kilku ml na 1 l próbki,
próbki gleby przechowuje się w ciemności i schłodzone do temperatury poniżej 0ºC,
najlepiej po wysuszeniu do powietrznie suchych.
1
WYODRĘBNIANIE TRUCIZN METALICZNYCH
Z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO
Istotnym elementem w oznaczaniu trucizn w materiale biologicznym jest ich
wyodrębnienie. Metody wyodrębniania trucizn z materiału biologicznego (tkanki,
narządy, płyny ustrojowe, treść żołądkowa) stanowią integralną część postępowania
analitycznego i są zdeterminowane rodzajem trucizny.
Metody wyosabniania dobiera się w ten sposób, aby poszukiwana trucizna nie
ulegała w toku operacji destrukcji, a jednocześnie, aby można było ją wyodrębnić z
dużą wydajnością, co jest szczególnie istotne w badaniach ilościowych.
W zależności od charakteru substancji sposoby wyodrębniania trucizn można
podzielić na:
wyodrębnianie trucizn nieorganicznych z materiału biologicznego;
 wyodrębnianie trucizn organicznych z materiału biologicznego.
Do trucizn metalicznych zalicza się te metale i metaloidy, które w postaci
soli, par i połączeń metaloorganicznych wprowadzone do ustroju w
małych ilościach, powodować mogą zarówno ostre, jak i przewlekłe
zatrucia.
W przypadkach śmiertelnych zatruć związkami metali, przedmiotem
badań na zawartość składników toksycznych są zwykle wycinki przewodu
pokarmowego - głównie żołądka i jelit, a z narządów miąższowych wycinki wątroby i nerki. Przydatnym materiałem są także wymiociny oraz
mocz i krew.
Mineralizacja
Proces ten polega na zniszczeniu substancji organicznych w wyniku utleniania przy
jednoczesnym przeprowadzeniu trucizn metalicznych w postać jonową.
Mineralizacja na sucho
Polega ona na spopieleniu badanego materiału w piecu elektrycznym w
temperaturze od 400 do 500°C, po uprzednim usunięciu wody przez odparowanie
na łaźni wodnej, w suszarce lub pod promiennikiem podczerwieni. Dla
przyspieszenia procesu spopielania do próby dodaje się substancje utleniające, jak
np.: kwas azotowy(V), azotan(V) potasu, azotan(V) amonu.
Metodę spopielania stosowano z dobrymi wynikami podczas analizy materiału
biologicznego na zawartość magnezu, baru, a także ołowiu. Nie można jej
wykorzystywać dla materiału zawierającego związki metali lotnych, np. rtęci, talu ani
też związki arsenu, selenu, antymonu, cyny czy bizmutu.
Mineralizacja UV
Mineralizacja z użyciem promieniowania UV polega na naświetleniu rozpuszczonej próbki
(często z dodatkiem H2O2, O3, K2S2O8) w kwarcowym naczyniu reakcyjnym nisko- lub
wysokociśnieniową lampą kwarcową ( = 254 nm). Metoda ta stosowana jest m.in. do
mineralizacji płynów ustrojowych. Jest ona skutecznym, „czystym" sposobem rozkładu
substancji organicznych (nie zanieczyszcza próbki), nieszkodliwym dla środowiska.
Rozpuszczanie ultradźwiękowe
Rozpuszczanie z użyciem ultradźwięków jako źródła energii do rozkładu matrycy próbek
polega na umieszczeniu ich wraz z naczyniem reakcyjnym zawierającym kwasy i ewentualnie
utleniacze w łaźni ultradźwiękowej. Technikę tę zaliczyć można do metod rozpuszczania
próbek „na mokro" w systemie otwartym. Jest ona metodą szybszą i wymagającą mniejszych
ilości odczynników niż klasyczne techniki rozpuszczania oraz znacznie tańszą niż np. technika
rozpuszczania mikrofalowego.
Mineralizacja na mokro
Znany od połowy XIX wieku sposób rozkładu matrycy organicznej „na mokro" według
Freseniusa-Babo za pomocą chloranu(VI) potasu i kwasu solnego w temperaturze
łaźni wodnej prowadzi tylko do częściowej mineralizacji. Produkt rozkładu uzyskany
tą metodą zawiera znaczną ilość substancji organicznych, zwłaszcza tłuszczowych,
w postaci koloidalnej, które utrudniają wykrycie niewielkiej ilości toksycznych metali
w materiale biologicznym.
Obecnie proces mineralizacji „na mokro" polega najczęściej na ogrzewaniu
badanego materiału (w kolbach Kjeldahla, aparacie typu Bethge lub innych
mineralizatorach szklanych) ze stężonym kwasem siarkowym w obecności
czynników utleniających. Jako czynniki utleniające powszechnie stosuje się kwas
azotowy(V) i/lub kwas chlorowy(VII), perhydrol i inne. Kwasy lub nadtlenek wodoru
dodawane są porcjami do zakończenia procesu całkowitego utleniania substancji
organicznych i ukazania się białych dymów kwasu.
Odbiałczanie
Przed oznaczaniem niektórych metali ciężkich, np. ołowiu (w połączeniach nieorganicznych i
organicznych) lub kadmu można zamiast mineralizacji przeprowadzić odbiałczanie próby krwi
lub wycinków narządów wewnętrznych. Do odbiałczania stosuje się związki denaturujące
białko, np. 5% kwas azotowy(V) lub stężony kwas nadchlorowy. Oznaczanie metali
przeprowadza się w supernatancie uzyskanym po odbiałczeniu próbki. W czasie odbiałczania
nie wszystkie związki organiczne ulegają denaturacji i część metali pozostaje związana
(nierozpuszczona). Metodę tę można stosować w przypadku, gdy zachodzi potrzeba
określenia stężenia formy niezwiązanej (np. z białkami), czyli przeprowadzenia analizy
specjacyjnej.
Rozcieńczanie próbek
W niektórych metodach oznaczania metali można wykorzystać uproszczony sposób
przygotowania próbki. Na przykład w absorpcyjnej spektrometrii atomowej (AAS) można, w
niektórych przypadkach, zrezygnować z długotrwałego procesu mineralizacji na rzecz
bezpośredniego wprowadzania prób do płomienia palnika (technika płomieniowa) lub kuwety
grafitowej (technika bezpłomieniowa). W płomieniowej AAS taki uproszczony sposób można
stosować oznaczając metale (np. Pb, Zn, Tl, Cr) w moczu w przypadkach ostrych zatruć.
Analizując próby surowicy lub krwi w kuwecie grafitowej (Pb, Cd, Ni, Fe w zakresie poziomów
normalnych), wymagane jest jedynie rozcieńczenie prób Tritonem X-100 lub fosforanem (V)
amonu.
2
Rozpuszczanie mikrofalowe (rozkład „na mokro" w systemie otwartym lub
zamkniętym)
Technika mikrofalowego rozpuszczania próbek różni się od klasycznych technik
rozpuszczania tym, że energia mikrofalowa (najczęściej o częstotliwości 2450 MHz) jest
dostarczana bezpośrednio do próbki bez pośrednictwa naczyń, w których zachodzi proces
rozpuszczania.
Główną jego zaletą jest szybkość procesu mineralizacji czy roztwarzania próbek (dla
większości próbek czas ich mineralizacji lub roztwarzania zmniejsza się z wielu godzin do
kilku lub kilkunastu minut), wadą natomiast - w niektórych przypadkach - niecałkowity rozkład
próbki.
Rozpuszczanie mikrofalowe z zastosowaniem różnych kwasów, ich mieszanin i utleniaczy w
otwartych systemach (zlewka, kolba) pod ciśnieniem atmosferycznym może być prowadzone
w domowych lub zmodyfikowanych kuchniach mikrofalowych. W tym systemie istnieje
możliwość ciągłego dodawania reagentów w trakcie rozpuszczania oraz stosowania próbek o
dużych masach (do kilkunastu gramów), wadą jest natomiast stosunkowo długi czas
rozpuszczania.
Mikrofalowe źródło ogrzewania zostało wykorzystane również do tzw. bomby teflonowej i
prowadzenia ciśnieniowego rozpuszczania z udziałem kwasów w kuchni mikrofalowej zamiast
w suszarce laboratoryjnej. Skraca się nie tylko czas rozpuszczania, ale i czas chłodzenia
bomby, ze względu na brak metalowego korpusu o dużej pojemności cieplnej.
Metody rozdziału i identyfikacji trucizn metalicznych
Stosuje się chromatografię cienkowarstwową. Szereg trucizn metalicznych łatwo
tworzy barwne związki zespolone, co wykorzystuje się do ich ilościowego
wyosabniania i oznaczania metodą kolorymetryczną.
Do wyosabniania metali można również stosować metody ekstrakcyjne. Tok
postępowania ekstrakcyjnego ma umożliwić:
zatężenie badanego składnika (np. kompleksowanie);
oddzielenie go od innych substancji mogących z nim interferować.
Jako czynniki kompleksujące stosuje się:
 acetyloaceton;
 dietyloditiokarbaminian sodu (DDC);
 pirolidynotiokarbaminian amonu (APDC);
 ditizon;
 8-hydroksychinolinę.
Utworzone obojętne kompleksy łatwo ekstrahują się ketonami, np. ketonem
metyloizobutylowym, a także estrami, np. octanem etylu, n-propylu, n-butylu,
Metoda ta może być stosowana do oznaczania metali (np. Pb, Ni, Mn) W moczu i
krwi.
WYODRĘBNIANIE TRUCIZN ORGANICZNYCH
Z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO
Przygotowanie materiału do oznaczeń należy tak prowadzić, aby zminimalizować
Wśród metod przygotowania próbek techniki ekstrakcyjne stanowią dominującą
grupę. Opierają się one na procesach przebiegających na granicy faz: gaz - ciecz czy
gaz - ciało stałe (HS, ang. Head Space), ciecz - ciecz (LLE), ciecz -ciało stałe (SPE,
ang. Solid Phase Extraction) i jej odmianę na skalę mikro (SPME, ang. Solid Phase
Micro Extraction).
Cennym uzupełnieniem technik ekstrakcyjnych stosowanych w laboratoriach są:
ekstrakcja ultradźwiękami (USG, ang. Ultrasonic Extraction), ekstrakcja w stanie
nadkrytycznym (ang. supercritical fluid extraction), ekstrakcja mikrofalowa (MES,
ang. Microware Extraction) i przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikami (ASE, ang.
Acceleration Solvent Extraction).
możliwość wystąpienia strat substancji oznaczanej. Straty te spowodowane są
głównie:
•procesami utleniania się związków trujących (trucizny lotne);
•reagowaniem trucizn z materiałem biologicznym (aktywne związki chemiczne);
•rozkładem lub przemianami trucizn, które prowadzą do wytworzenia produktów
nietoksycznych, stanowiących fizjologiczny składnik organizmu;
•koniecznością używania szeregu rozpuszczalników organicznych;
•procesami zagęszczania i oczyszczania wyosobnionych trucizn.
Przygotowanie materiału biologicznego do ekstrakcji
Odbiałczanie i odtłuszczenie
Hydroliza
Do odbiałczania można stosować różne substancje: kwas wolframowy, chlorowy(VII)
i trichlorooctowy, alkohol etylowy, mieszaninę alkoholu etylowego i kwasu
winowego, siarczan amonowy, alkaliczny roztwór siarczanu cynku.
Odbiałczanie prowadzi się zazwyczaj w temperaturze podwyższonej 60-100 oC, co
przyspiesza proces oraz zwiększa rozpuszczalność w wodzie substancji trudno
rozpuszczalnych. Jest to etap konieczny, ponieważ próby ekstrakcji nie
spreparowanego, a tylko zhomogenizowanego materiału biologicznego nastręczają
wiele trudności (pienienie, emulsja), a uzyskane wyciągi są silnie zanieczyszczone.
Wiele związków organicznych i ich metabolitów wiąże się w ustroju z białkami, a
także ulega sprzęganiu z kwasem glukuronowym i siarkowym. Przed dokonaniem
analizy należy związki te wyodrębnić w postaci wolnej. W tym celu przeprowadza się
hydrolizę, najczęściej kwaśną. Metodę tę stosuje się do oznaczania środków
uzależniających, np.: morfiny, pochodnych benzodiazepiny, metakwalonu,
trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych, salicylanów.
W celu odbiałczania najczęściej stosuje się metody:
siarczanowo-amonową,
wolframową (trucizny o charakterze kwaśnym i obojętnym).
W stosunku do leków zasadowych, takich jak amitryptylina, chloropromazyna,
pochodnych benzodiazepin, można używać też enzymu bakteryjnego - proteazy
alkalicznej. Trawienie materiału biologicznego enzymami jest metodą prostą,
posiadającą wiele zalet, jak np.: stosowanie niskiej temperatury nie powodującej
rozkładu substancji termolabilnych, unikanie wprowadzania kwasów, brak emulsji w
czasie ekstrakcji oraz większa wykrywalność. Niedogodnością metody
enzymatycznej jest długi czas hydrolizy.
3
Ekstrakcja do fazy gazowej
Wyodrębnianie trucizn za pomocą mikrodyfuzji
Metoda ta polega na oznaczeniu w sposób pośredni lotnych związków organicznych w
próbkach ciekłych lub stałych poprzez analizę frakcji gazowej będącej w stanie równowagi
termodynamicznej z próbką w układzie zamkniętym. Można tutaj zastosować zarówno
techniki w układzie statycznym jak i dynamicznym (wymywanie i wychwyt analitów).
Ekstrakcja do fazy gazowej jest stosowana głównie do oznaczania śladowych ilości lotnych
składników organicznych w próbkach o złożonej matrycy, mogącej interferować z
oznaczanymi związkami, w próbkach zawierających związki nieorganiczne lub wysoko
cząsteczkowe polimery organiczne, w mieszaninach wymagających skomplikowanego
oczyszczania i przygotowywania do analizy (oznaczanie w moczu lotnych substancji np.
disiarczek węgla, dichloroetan).
Metoda ta znajduje zastosowanie w stosunku do tych trucizn, których współczynnik podziału
powietrze : woda jest dostatecznie wysoki. W praktyce zamiast powietrza stosuje się często
obojętne gazy, np. azot. Dla polepszenia aeracji stosuje się często ogrzewanie
przedmuchiwanego roztworu, dla zwiększenia zaś wydajności pochłaniania wydzielonego
związku oziębia się roztwór pochłaniający.
Metoda polega na dyfuzji lotnych związków do rozpuszczalnika, do momentu osiągnięcia
stanu równowagi w komorze Conwaya (krew, osocze, mocz).
Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi
Często stosowaną w analizie toksykologicznej metodą wyodrębniania nielotnych
organicznych i nieorganicznych związków trujących z materiału biologicznego jest
ekstrakcja do fazy ciekłej.
Procesem tym rządzi prawo podziału Nernsta, które mówi, że substancja
rozpuszczona dzieli się pomiędzy dwa nie mieszające się rozpuszczalniki w ten
sposób, że w stanie równowagi stosunek stężeń substancji rozpuszczonej w obu
rozpuszczalnikach jest stały w danej temperaturze.
Do najczęściej używanych technik ekstrakcji należą:
ekstrakcja poprzez wytrząsanie próbki wraz z rozpuszczalnikiem,
ekstrakcja przy użyciu aparatu Soxhleta,
zmydlanie (saponifikacja). Pierwszy ekstrahent to najczęściej roztwór KOH w alkoholu,
następnie do układu dodaje się wody, filtruje i ekstrahuje za pomocą rozpuszczalnika
organicznego,
homogenizacja – badaną próbkę homogenizuje się z rozpuszczalnikiem (np.: poprzez
ucieranie), następnie faza rozpuszczalnikowa jest pobierana do kolejnych analiz,
ekstrakcja strumieniem rozpuszczalnika – próbkę umieszcza się w kolumnie a następnie
ogrzewa do temperatury zbliżonej do temp. wrzenia rozpuszczalnika. Następnie przez taki
układ przepompowywany jest rozpuszczalnik,
ekstrakcja sekwencyjna – ta technika jest szczególnie użyteczna w przypadku analizy
różnych związków lub mogących występować w różnych układach chemicznych z tej samej
matrycy. Aby wyodrębnić i oznaczyć poszczególne formy analitu koniecznym jest
zastosowanie kilku etapów ekstrakcji różnymi rozpuszczalnikami. Metoda ta pozwala na
dokładniejszą kontrolę oraz porównanie stężenia na poszczególnych etapach ekstrakcji do
wyniku oznaczenia ogólnego.
Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)
Aparat Soxhleta składa się układu rurek, które montuje się między
kolbę z wrzącym rozpuszczalnikiem i chłodnicę zwrotną. Pary
wrzącego rozpuszczalnika wędrują z dolnej kolby przez rurkę (A) do
chłodnicy znajdującej się nad soxhletem. Ekstrahowaną próbkę
umieszcza się w specjalnym koszyku, tzw. gilzie (B), który znajduje
się w szerokiej rurce, która powoli zapełnia się skroplonym przez
chłodnicę zwrotną rozpuszczalnikiem. Na dole szerokiej rurki
znajduje się wylot rurki syfonowej (C). W momencie gdy poziom
cieczy w rurce (B) staje się wyższy niż w syfonie (C) cały
rozpuszczalnik z rurki B wypływa samoczynnie i wędruje przez syfon
z powrotem do kolby na dole.
Cały aparat pracuje zatem cyklicznie - napełnia
się powoli rozpuszczalnikiem do górnego
poziomu syfonu, a gdy ten poziom zostanie
osiągnięty jest samoczynnie opróżniany i jest
ponownie zapełniany kolejną porcją świeżego
rozpuszczalnika.
Ekstrakcja na kolumienkach SPE (ang. Solid Phase Extraction) stanowi obecnie
podstawową technikę stosowaną w rutynowej praktyce laboratoryjnej. Stosowana
jest ona do selektywnego wyodrębniania i wzbogacania analitów z naturalnych
matryc gazowych, ciekłych i stałych. SPE jest procesem, w którym następuje
rozdział ksenobiotyku pomiędzy ciekłą fazą ruchomą a adsorbentem, który stanowi
stałą fazę stacjonarną.
B
A
C
Do zalet metody w porównaniu z klasyczną ekstrakcją ciecz - ciecz należy:
wyższa selektywność;
czystość ekstraktów;
brak emulsji;
powtarzalność;
krótki czas przygotowywania próbek;
możliwość wprowadzenia automatyzacji.
4
Dobór odpowiedniej kolumienki SPE musi uwzględnić następujące kryteria:
Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME)
•objętość próbki;
•stopień zanieczyszczenia;
•złożoność matrycy;
•właściwości i ilość interesujących nas związków;
•wpływ matrycy lub innych analitów.
Do zalet metody SPME należy zaliczyć ograniczenie ilości koniecznych operacji analitycznych.
Tym samym istnieje mniejsze ryzyko popełnienia błędu grubego i systematycznego, a
dodatkowo znacznie skraca się czas analizy.
Metoda jest prosta a jej koszty są relatywnie niskie. W odróżnieniu od innych metod
wzbogacania analitów, w metodzie SPME całkowicie wyeliminowano zużycie drogich i
toksycznych rozpuszczalników. Ponadto charakteryzuje się ona ograniczeniem wpływu
związków utrudniających miarodajne oznaczenie końcowe.
Metoda SPME wymaga jednak stosunkowo częstej kalibracji oraz szczególnej dbałości o
czystość włókna sorpcyjnego. W celu uzyskania powtarzalnych wyników metodą SPME
konieczne jest dokładne kontrolowanie i odtwarzanie parametrów procesu sorpcji i desorpcji
analitów z włókna.
PROBLEMY ANALITYCZNE I INTERPRETACYJNE
NA PRZYKŁADZIE ZATRUĆ SIARKOWODOREM
Opiniowanie w przypadkach zatruć obejmuje dwa
zasadnicze etapy:
• analizę
chemiczno-toksykologiczną
(wykrycie,
identyfikacja i oznaczenie trucizny obecnej w
badanym materiale),
• interpretację otrzymanych wyników (ocena, na
podstawie otrzymanych wyników, czy zatrucie miało
miejsce – piśmiennictwo, doświadczenie zawodowe).
•W przemyśle siarkowodór występuje najczęściej jako niepożądany produkt
uboczny we wszystkich tych procesach, gdzie w wysokich temperaturach
dochodzi do kontaktu siarki elementarnej lub związków zawierających siarkę
z materiałem organicznym (produkcja koksu z węgla kamiennego, produkcja
disiarczku węgla, wytwarzanie włókien wiskozowych).
•Siarkowodór otrzymuje się też celowo na skale przemysłową, ponieważ
stanowi on wyjściowy półprodukt do produkcji siarczków, organicznych
związków siarki itp.
•Siarkowodór zalegający w pokładach razem z gazem ziemnym lub ropą
naftową może być uwalniany w procesie wierceń i wydobywania zasobów.
Według danych piśmiennictwa zawartość H2S w ropie naftowej wynosi 0-5%,
niektóre złoża gazu ziemnego mogą zawierać nawet do 42% H2S, węgiel
kamienny może być zanieczyszczony siarką w ilościach do 80 g/kg - siarka ta
w sprzyjających okolicznościach może ulec przemianie do siarkowodoru.
Siarkowodór jest bezbarwnym gazem o
charakterystycznej woni, dobrze rozpuszcza się
w wodzie gdzie ulega dysocjacji do anionu
wodorosiarczkowego i siarczkowego,
•łatwo ulega reakcjom utleniania, a produkty
utleniania zależą od warunków reakcji i użytego
utleniacza.
•na granicy faz powietrze/woda niezdysocjowany
w wodzie siarkowodór pozostaje w równowadze
z gazowym siarkowodorem w powietrzu.
•stanowi jedno z głównych ogniw w naturalnym
obiegu siarki w przyrodzie, występuje w gazach
wulkanicznych, pokładach ropy i gazu ziemnego
oraz jako produkt działania bakterii w procesie
gnicia białek roślinnych i zwierzęcych, może być
również
wytwarzany
w
procesach
przemysłowych.
Osad siarki na skale powstający przy
wydobywaniu się siarkowodoru z
wnętrza wulkanu
•Toksyczność siarkowodoru jest wysoka (porównywalna z toksycznością cyjanowodoru).
Działanie toksyczne siarkowodoru zależy od jego stężenia. W otaczającym powietrzu w
dużych stężeniach działa bardzo gwałtownie, w czym przypomina działanie cyjanowodoru.
•Związek ten jest wchłaniany łatwo przez płuca, a wydala się z moczem po utlenieniu w
organizmie, a także w postaci niezmienionej przez płuca.
•Jego szkodliwe działanie polega na zahamowaniu utleniania komórkowego, co powoduje
niedotlenienie tkanek oraz uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego.
•Siarkowodór może być przyczyną zatruć ostrych oraz przewlekłych.
W stężeniach powyżej 1,4 mg/dm3, tak jak to ma miejsce przy zatruciach ostrych,
może działać bardzo gwałtownie - następuje nagłe zatrzymanie oddechu, utrata
przytomności i zgon w ciągu kilku minut wskutek uduszenia.
W mniejszych stężeniach mogą być różne objawy: działanie drażniące błony śluzowe
dróg oddechowych powodujące napady kaszlu, zmiany zapalne i nieżyty, podrażnienie
spojówek, przyspieszenie tętna, wzrost ciśnienia krwi, mdłości, wymioty, utrata
łaknienia, ślinotok, obfite poty.
•Obserwowane są również późne następstwa ciężkich zatruć - zapalenie płuc, trwałe
zaburzenia obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego (zaburzenia zdolności
postrzegania, ubytki inteligencji, przyspieszenie akcji serca, zapalenia wielonerwowe).
5
Schemat oznaczania siarczków w materiale biologicznym
W przypadkach ostrych, śmiertelnych zatruć siarkowodorem, badania
toksykologiczne materiału pobranego ze zwłok i interpretacja otrzymanych
wyników jest trudna. Związane jest to z właściwościami siarkowodoru i
charakterem jego działania na organizm człowieka:
•wysoka toksyczność siarkowodoru i szybki przebieg zatrucia sprawia, że
wchłonięta do organizmu dawka jest mała, a więc stężenie wolnego
siarkowodoru i powstających z niego siarczków w organizmie - bardzo
niskie;
•siarkowodór łatwo ulega eliminacji z organizmu (na skutek ulatniania się
z tkanek i szybkiemu w nich utlenianiu);
•w tkankach może występować siarkowodór endogenny, co jest związane z
metabolizmem aminokwasów zawierających siarkę;
•siarkowodór wytwarza się w procesach rozkładu gnilnego organicznych
związków zawierających siarkę (w tym białek), może więc występować w
materiale sekcyjnym w dużych ilościach.
Tetraboran sodu
(pH = 9,3)
TDMBA, PFBBr,
TBB, Octan etylu
1. Wytrząsanie (1
min)
2. K2HP04
3. Wytrząsanie (10
s)
4. Odwirowywanie
(2500 rpm, 10 min)
granica wykrywalności około 0,01 ug S2-/g
TDMBA
PFBBr
TBB
BPFBS
KH2PO4
- chlorek tetradecylodimetylobenzyloamonu - katalizator
- bromek pentafluorobenzylu - odczynnik do derywatyzacji
- 1,3,5-tribromobenzen - standard wewnętrzny
- siarczek bispentafluorobenzylu - produkt derywatyzacji
- zapobiega tworzeniu H2S z białek, cysteiny itp.
Stężenie siarczków [g/g, g/ml] w materiale sekcyjnym w
przypadkach zatruć u ludzi (według różnych autorów)
Materiał
Przypadek
1
2
3
4
Krew
60,9
1,3
• Krytycznym okazał się czas pobrania materiału po zgonie - jeżeli wynosił
on 48 godzin, to stężenia w materiale pobranym od zatrutego i w materiale
kontrolnym były zbliżone i wynosiły odpowiednio 2,66 i 1,88 ug/ml.
Płuca
14,1
1,3
0,6
0,6
Mózg
5,1
0,6
1,9
0,6
Wątroba
5,1
3,2
2,6
2,6
• Stężenie siarczków w narządach pobranych tuż po śmierci wywołanej H2S
wahały się od 0,21 ug/g w mięśniach kończyn do 1,67 ug/g we wątrobie,
natomiast w materiale kontrolnym były zerowe z wyjątkiem wątroby i nerki.
Nerka
24,4
1,9
3,2
0,6
Mięśnie
brzucha
7,0
Mięśnie uda
9,0
• Pobranie materiału dwa dni po zgonie wskazywało na całkowitą
nieprzydatność oznaczeń siarczków we wątrobie i nerkach. Pewne
znaczenie w diagnostyce zatrucia w przypadku późnego pobierania
narządów do badań może mieć płuco, mózg i mięśnie kończyn.
Kwas Laskorbinowy
NaCI, PFBBr
Próbka (0,2
g krwi)
GC/MS
(identyfikacja)
6
0,5
4,2
1,6
Siarczki
Tiosiarczany
-
48.2
43.7
13.4
-
5
Krewc
0.45
2.8
6
Krewd
Krewc
1.9
60.9
13.4
13.4
2
3
GC/ECD
(oznaczanie)
4
granica wykrywalności około 0,3 ug/ml
PFBBr - bromek pentafluorobenzylu - odczynnik do derywatyzacji,
TBB - 1,3,5-tribromobenzen - standard wewnętrzny,
BPFBS - disiarczek bispentafluorobenzylu - produkt derywatyzacji,
Kwas L-askorbinowy - stabilizator,
Chlorek sodu (NaCI) - katalizator,
Jod - utleniacz
5
5,7
Krew
Mocza
Krew
Moczb
Krew
Mocza
Krew
Moczb
1
Faza organiczna
(BPFBS)
0,6
Stężenie siarczków i tiosiarczanów [ug/ml] w przypadkach
zatruć
Przypadek
1. Wytrząsanie (1
min)
2. jod i TBB
3. Wytrząsanie (30
s)
4. Odwirowywanie
(2500 rpm, 15 min)
GC/ECD
(oznaczanie)
Próbka (0,2 g)
• W jednym z przypadków po pobraniu krwi zaraz po zgonie na skutek
zatrucia siarkowodorem stężenie siarczków wynosiło 0,48 ug/ml, a po 3
dniach przechowywania wzrosło do 0,66 ug/ml. W materiale kontrolnym
stężenie siarczków wynosiło 0,06 ug/ml.
Schemat oznaczania tiosiarczanów w materiale biologicznym
GC/MS
(identyfikacja)
Faza organiczna
(BPFBS)
Materiał
Próba pobrana 6 godz. po wypadku, b próba pobrana 15
godz. po wypadku, c próba pobrana podczas autopsji,
dpróba pobrana 4 godz. po zgonie, przypadek 5, 6 zatrucie śmiertelne
a
6
Wnioski
•W przypadkach zakończonych zgonem stwierdzono obecność zarówno siarczków,
jak i tiosiarczanów. Stężenie tiosiarczanów było w tych przypadkach co najmniej 8krotnie wyższe niż u zdrowych osób, które wynosi mniej niż około 0,3 ug/ml. Było to
zgodne z wynikami przeprowadzonych przez autorów badań na zwierzętach
(śmiertelne zatrucie drogą wziewną), gdzie stężenie tiosiarczanów we krwi było
średnio około 7-krotnie wyższe niż stężenie siarczków.
•W przypadku nr 6 (zatrucie inhalacyjne i doustne) we krwi pobranej w szpitalu
(krewd) stężenie siarczków było niskie (1,9 ug/ml), natomiast we krwi pobranej
podczas autopsji (krewc) - stężenie siarczków (60,9 ug/ml) było wielokrotnie wyższe
niż w przypadkach zatruć siarkowodorem drogą wziewną. Fakt ten można wyjaśnić
tym, że próbka była przechowywana kilka godzin w temperaturze pokojowej zanim
przysłano ją do laboratorium, w związku z czym prawdopodobnie siarczki uległy
zanikowi. Stężenia tiosiarczanów w obu próbkach były takie same (13,4 ug/ml) i co
najmniej 40-krotnie wyższe niż u osób zdrowych.
Wskazuje to, że tiosiarczany w próbce są stabilne, a warunki przechowywania nie
wpływają na ich stężenie.
Na podstawie przedstawionych prac można wysnuć wnioski, że w
przypadkach zatruć siarkowodorem (lub/i siarczkami) najlepsze wyniki
uzyskuje się badając stężenie tiosiarczanów. I tak:
•oznaczanie tiosiarczanów w moczu może potwierdzić zatrucie
siarkowodorem nawet w przypadkach nie zakończonych zgonem, podczas
gdy w tych przypadkach siarczków nie wykrywa się (ich stężenie jest zbyt
niskie),
•w przypadkach zatruć śmiertelnych oznaczenie tiosiarczanów obok
siarczków dodatkowo potwierdza fakt zatrucia siarkowodorem,
• tiosiarczany są bardziej stabilne w materiale biologicznym w porównaniu
do siarczków, co w pewnym stopniu, może chronić przed popełnieniem
błędów w interpretacji w przypadku niewłaściwego przechowywania
materiału.
7