Czytaj dalej - Instytut Mikroekologii

ARTYKUŁ ORYGINALNY
Przydatność oznaczania kalprotektyny w stolcu
w chorobie Leśniowskiego i Crohna
Piotr Eder, Kamila Stawczyk-Eder, Iwona Krela-Kaźmierczak, Krzysztof Linke
Katedra i Klinika Gastroenterologii, Żywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego, Poznań
SŁOWA KLUCZOWE
STRESZCZENIE
choroba Leśniowskiego i Crohna,
kalprotektyna, ocena
stanu zapalnego
Wprowadzenie Adres do korespondencji:
lek. Piotr Eder, Katedra i Klinika
Gastroenterologii, Żywienia
Człowieka i Chorób Wewnętrznych,
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego,
ul. S. Przybyszewskiego 49, 60-355
Poznań, tel.: 061-869-13-43,
fax: 061-867-92-35, e-mail:
[email protected]
Praca wpłynęła: 16.03.2008.
Przyjęta do druku: 12.05.2008.
Nie zgłoszono sprzeczności
interesów.
Pol Arch Med Wewn. 2008;
118 (11): 622-626
Copyright by Medycyna Praktyczna,
Kraków 2008
Choroba Leśniowskiego i Crohna (ChLC) stanowi w świetle danych epidemiologicznych coraz poważniejsze wyzwanie nie tylko dla gastroenterologów, ale także dla lekarzy
rodzinnych. Ważnym etapem diagnostyki jest różnicowanie ChLC z zaburzeniami czynnościowymi,
w tym przede wszystkim z zespołem jelita drażliwego (ZJD). Brak jednak powszechnego dostępu
do nieinwazyjnych i prostych testów, które pomogłyby w podjęciu decyzji, który chory zgłaszający
dolegliwości takie, jak ból brzucha, biegunka, powinien zostać skierowany na dalsze badania, w tym
badania endoskopowe.
Cele Celem pracy była ocena przydatności diagnostycznej oznaczania stężenia białka cytoplazmatycznego neutrofilów – kalprotektyny w stolcu chorych na ChLC.
Pacjenci i metody Grupę badaną (n = 31) stanowili pacjenci Kliniki Gastroenterologii, Żywienia
Człowieka i Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu chorujący na ChLC.
Grupą kontrolną (n = 12) były osoby z rozpoznanym ZJD. Oznaczono stężenie kalprotektyny w pojedynczej próbce stolca przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Oceniono stężenie białka
C-reaktywnego (C-reactive protein – CRP) oraz wykonano morfologię krwi obwodowej, a aktywność
kliniczną ChLC oszacowano przy pomocy wskaźnika aktywności choroby (Crohn’s Disease Activity
Index). Dokonano odpowiedniej analizy statystycznej uzyskanych wyników.
Wyniki Średnie stężenie kalprotektyny w stolcu pacjentów chorujących na ChLC wyniosło 32,01
±22,58 mg/l i było istotnie wyższe (p <0,0003) w porównaniu z grupą kontrolną. Dla wartości 16,01
mg/l czułość i swoistość zastosowanego testu w różnicowaniu między ChLC a ZJD wyniosły odpowiednio 67,7% i 66,7%. Stwierdzono istotną zależność dodatnią między poziomem ocenianego białka
a CRP oraz negatywną ze stężeniem hemoglobiny w grupie chorych na ChLC.
Wnioski Zaproponowana metoda może być przydatna w diagnostyce różnicowej ChLC i ZJD oraz
pomocna w monitorowaniu stanu pacjentów cierpiących z powodu ChLC.
WPROWADZENIE Wykrywalność choroby Leśniowskiego i Crohna (ChLC), należącej do nieswoistych zapaleń jelit (NZJ), stale rośnie.1 Istotą schorzenia jest przewlekły, występujący odcinkowo stan zapalny, obejmujący całą ścianę przewodu pokarmowego. Najczęściej ChLC lokalizuje
się w dystalnej części jelita krętego, ale może dotyczyć każdego odcinka przewodu pokarmowego.
Choroba charakteryzuje się okresami remisji i nawrotów, podczas których dominują takie objawy,
jak ból brzucha, biegunka, gorączka, złe samopoczucie. Schorzenie to jest nieuleczalne i prowadzi do wielu powikłań związanych z procesami
zapalnymi w układzie pokarmowym, jak i z licznymi objawami pozajelitowymi. Etiopatogeneza
ChLC jest wciąż nieznana.2,3
Zarówno diagnostyka, jak i monitorowanie
chorych na ChLC sprawiają wiele trudności. Często od momentu pojawienia się pierwszych objawów (na przykład przewlekłego bólu brzucha)
do ustalenia ostatecznego rozpoznania mijają
miesiące, czasami lata. Najistotniejszym etapem
procesu diagnostycznego jest badanie endoskopowe przewodu pokarmowego wraz z oceną histopatologiczną pobranych wycinków. Procedura
ta jednak nierzadko wykonywana jest w późnym
ARTYKUŁ ORYGINALNY Przydatność oznaczania kalprotektyny w stolcu w chorobie...
1
TabEla 1 Charakterystyka grupy badanej
Cała grupa
Kobiety
Mężczyźni
liczebność grupy
31
16
15
wiek (lata)
35,2 ±10,9
38,5 ±12,8
31,9 ±7,7
czas trwania choroby (lata)
  4,9 ±4,3
  4,7 ±3,9
  5 ±4,8
czas trwania dolegliwości (lata)
  8,2 ±7,2
  8,3 ±5,3
  8,1 ±8,9
stadium zaawansowania ChLC.4 Również parametry oceniane rutynowo u pacjentów będących
w stanie remisji, takie jak OB, białko C-reaktywne
(C-reactive protein – CRP) czy morfologia krwi obwodowej mają liczne wady, ponieważ jedynie pośrednio odzwierciedlają nasilenie stanu zapalnego
w jelitach.5 Dlatego wciąż trwa poszukiwanie nowych metod, które w sposób obiektywny i nieinwazyjny będą mogły służyć temu celowi.
Kalprotektyna – stanowiąca >50% białka cytosolu neutrofilów – jest obecna w podwyższonych
stężeniach w zmienionych zapalnie tkankach. Należy do rodziny białek S-100, zbudowana jest z 2
podjednostek o wielkości 8 i 14 kD. Z leukocytów
uwalniana jest zarówno w wyniku śmierci tych
komórek, jak i w aktywnym mechanizmie sekrecji. Jest zaangażowana w procesy zapalne – wykazano jej właściwości proapoptotyczne, przeciwbakteryjne (prawdopodobnie poprzez wiązanie
jonów cynku i wapnia, niezbędnych do wzrostu
mikroorganizmów) oraz hamujące w warunkach
in vitro proliferację dzielących się komórek, takich
jak komórki szpiku, nowotworowe czy stymulowane limfocyty. Należy jednak podkreślić, że jej
znaczenie w rozwoju zmian zapalnych w różnych
jednostkach chorobowych nie jest dokładnie poznane.6,7 Jako, że jednym z elementów patogenezy ChLC jest obfity naciek zapalny w ścianie jelita,
składający się między innymi z neutrofilów, wydaje się, że stężenie omawianego białka powinno być podwyższone zarówno w obrębie chorobowo zmienionego odcinka przewodu pokarmowego, jak i w kale pacjentów. Celem pracy była ocena
przydatności oznaczania kalprotektyny w stolcu
w diagnostyce i monitorowaniu ChLC.
PACJENCI I METODY Grupę badaną stanowiło 31
osób w wieku średnim 35 ±11 lat – pacjentów Kliniki Gastroenterologii, Żywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego
w Poznaniu, z potwierdzoną klinicznie i w badaniach dodatkowych ChLC. Charakterystykę grupy badanej przedstawia tabela 1 .
Grupę kontrolną stanowiło 12 chorych (9 kobiet i 3 mężczyzn) w średnim wieku 45,5 ±21,2 lat
z wykluczonym organicznym tłem zaburzeń żołądkowo-jelitowych i zdiagnozowanym przy pomocy II kryteriów rzymskich zespołem jelita drażliwego (ZJD). Na wykonanie zaplanowanych oznaczeń uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy
Uniwersytecie Medycznym w Poznaniu.
Pacjenci oddali pojedynczą próbkę stolca, która następnie była przechowywana w temperaturze –20ºC. Po rozmrożeniu z każdej z nich
2
wyekstrahowano przy pomocy zestawu ekstrakcyjnego firmy Roche 100 mg materiału. Stężenie kalprotektyny w stolcu oznaczono metodą
immuno­enzymatyczną ELISA firmy Immun­
diagnostik – podwójnie dla każdej próbki. Wśród
chorych na ChLC wykonano dodatkowo badania
laboratoryjne – takie jak morfologia krwi obwodowej, OB i stężenie CRP. Kliniczne zaawansowanie choroby oceniono przy pomocy powszechnie
używanej skali CDAI (Crohn’s Disease Activity Index).8 Skala ta remisję definiuje jako CDAI <150,
zaostrzenie – pomiędzy 150 a 450, a bardzo ciężki rzut choroby – >450.
Analiza statystyczna Uzyskane wyniki podda-
no analizie statystycznej. Przy pomocy programu Microsoft Excel XP obliczono średnie, odchylenia standardowe (standard deviation – SD) oraz
wartości minimalne i maksymalne. Różnice statystyczne pomiędzy średnimi w grupie badanej
i kontrolnej obliczono posługując się testem parametrycznym Welcha dla zmiennych niepowiązanych, przyjmując za poziom istotności statystycznej p <0,05. Korelacje pomiędzy stężeniami kalprotektyny a pozostałymi wynikami zostały zbadane przy pomocy współczynnika korelacji liniowej Persona w przypadku zmiennych
o rozkładzie normalnym oraz współczynnika korelacji rangowej Spearmana przy braku normalności rozkładu zmiennych. Ocenę dokładności
diagnostycznej testu, w tym czułość i swoistość
oznaczania kalprotektyny w stolcu w różnicowaniu między ChLC a ZJD zbadano wyznaczając
krzywą charakterystyki odbiornika (receiver operating characteristic curve – ROC) oraz obliczając
pole powierzchni pod krzywą ROC (area under curve – AUC). Dla testu idealnie różnicującego AUC
wynosi 1,00. Im bliżej tej wartości, tym oceniana
metoda jest lepsza.
WYNIKI Średnie stężenie kalprotektyny w stolcu
pacjentów chorujących na ChLC wyniosło 32,01
±22,58 mg/l. Stężenie to w grupie kobiet oszacowano na 36,9 ±26,4 mg/l i było ono istotnie wyższe niż w przypadku mężczyzn – 27,1 ±17,5 mg/l
(p <0,05). W grupie chorych na ZJD poziom kalprotektyny wyniósł 14,73 ±4,58 mg/l. Różnica stężeń między pacjentami cierpiącymi z powodu ChLC i ZJD była istotna statystycznie
(p <0,0003).
AUC wyniosło 0,76 (95% CI: 0,62–0,88),
a p <0,0002. Dla stężenia kalprotektyny w stolcu równym 16,01 mg/l oszacowano, że test ten
ma 67,7% czułość i 66,7% swoistość w różnicowaniu między ChLC a ZJD. Średnia wartość CDAI
wyniosła 156 ±91. Pozostałe wyniki uzyskane
w grupie badanej przedstawia tabela 2 .
Stwierdzono istotną statystycznie (p <0,05) korelację dodatnią między oznaczanym w kale białkiem a CRP, a także istotną zależność negatywną
między kalprotektyną a stężeniem hemoglobiny
we krwi obwodowej. Pozostałe zależności, w tym
pozytywna korelacja z CDAI, nie były istotne.
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2008; 118 (11)
TabElA 2 Wyniki badań laboratoryjnych grupy
badanej – wartości średnie
stężenie białka
C-reaktywnego
  13,9 ±16,3 mg/l
OB
  28,3 ±23,8 mm/h
liczba erytrocytów
   4,4 ±0,6 mln/mm3
liczba leukocytów
   7,1 ±1,9 × 103/mm3
liczba płytek krwi
297 ±94,5 × 103/mm3
stężenie hemoglobiny
  12,2 ±2,2 g/dl
hematokryt
  39,4 ±4,5%
OMÓWIENIE Uzyskane wyniki potwierdzają
przydatność diagnostyczną oznaczania stężenia kalprotektyny w stolcu u pacjentów chorujących na ChLC. Jak wynika z krzywej ROC, test
ten może być przydatny w różnicowaniu pomiędzy tym schorzeniem a ZJD. Jest to o tyle istotne, że ZJD stanowi jedną z najczęstszych chorób
zaliczanych do czynnościowych zaburzeń jelitowych, które stają się powoli chorobami cywilizacyjnymi.9 Pacjenci cierpiący z ich powodu są dużym wyzwaniem dla lekarzy pierwszego kontaktu
oraz dla gastroenterologów z racji złożonej i słabo poznanej etiologii, jak i przewlekłego charakteru choroby i nierzadkich niepowodzeń terapeutycznych.10 Łatwo w takiej sytuacji o pomyłkę –
szczególnie na etapie diagnostyki przewlekłego
bólu brzucha i zaburzeń defekacji u chorych czasem zbyt pochopnie diagnozuje się ZJD i podejmuje adekwatną do rozpoznania próba leczenia.
Warto jednak pamiętać, że niekiedy pod maską zaburzeń czynnościowych rozwija się choroba o tle
zapalnym. Trudności w diagnozowaniu NZJ potwierdzają uzyskane przez nas wyniki (tabela 1 ) –
w ocenianej grupie chorych na ChLC od momentu pojawienia się pierwszych objawów gastroenterologicznych do czasu ustalenia ostatecznego
rozpoznania mijało średnio około 4 lat. Należy
podkreślić, że w każdym przypadku podejrzenia ChLC ważne jest wczesne postawienie odpowiedniej diagnozy, aby uprzedzić pojawienie się
powikłań charakterystycznych dla tego schorzenia, takich jak przetoki, zwężenia jelit czy ropnie
wewnątrzbrzuszne.3
Z drugiej strony nie każdy pacjent zgłaszający
się do lekarza z bólem brzucha, osłabieniem, biegunką kierowany jest od razu na badania takie, jak
inwazyjna i niepozbawiona ryzyka powikłań kolonoskopia czy, narażające na wpływ promieniowania jonizującego, badania radiologiczne przewodu pokarmowego. Dlatego niezwykle istotne jest
właściwie przeprowadzone badanie podmiotowe
i przedmiotowe w celu różnicowania NZJ przede
wszystkim z zaburzeniami czynnościowymi oraz
chorobami infekcyjnymi przewodu pokarmowego. Ważnym etapem w diagnostyce w takich przypadkach są badania laboratoryjne – morfologia
krwi obwodowej, OB czy CRP. Skojarzenie wyżej
wymienionych objawów z anemią, przyspieszeniem OB czy podwyższonym stężeniem CRP powinno raczej skłaniać do poszerzenia diagnostyki
o procedury specjalistyczne. Nie zawsze jednak
stwierdzane są odchylenia w badaniach laboratoryjnych, mimo nasilonych zmian zapalnych w jelitach w ChLC.11 Także dodatni test na krew utajoną w stolcu jest bardziej charakterystyczny dla,
należącego do NZJ, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego niż dla ChLC, w której najczęstszą lokalizacją procesu chorobowego jest dystalny odcinek jelita krętego.12 Dlatego wydaje się, że w takiej sytuacji optymalnym testem diagnostycznym
byłoby oznaczanie markera zapalnego w stolcu.
Kalprotektyna spełnia warunki dobrego markera z kilku ważnych powodów:
1 nie jest rozkładana przez mikroflorę bakteryjną
kału, jest obecna w nim do 48 godzin przy
przechowywaniu stolca w temperaturze pokojowej, a w temperaturze –20°C – do 3 miesięcy
2 jest dominującym białkiem cytosolu neutrofilów, stąd dobrze odzwierciedla natężenie nacieku
zapalnego w ścianie jelita, którego istotnym elementem są granulocyty obojętnochłonne
3 wystarczy pojedyncza próbka stolca, ponieważ
wykazano, że oznaczanie stężenia kalpro­tektyny
w takiej próbce koreluje ze stężeniem tego białka
w większych próbkach, w tym w dobowej zbiórce
stolca14
4 test ten jest nieinwazyjny i prosty.
Niestety badanie to ma również wady. Przede
wszystkim nie jest obecnie powszechnie dostępne
i, między innymi z tego powodu, jest drogie. Obliczona czułość i swoistość w różnicowaniu między
ChLC a ZJD, mimo istotności ze statystycznego
punktu widzenia, jest zadowalająca, ale niewystarczająca. Wartości te nie przekraczają bowiem 70%
dla stężenia kalprotektyny w stolcu 16 mg/l. Nasze dane nie potwierdzają tych uzyskanych przez
Tibble i wsp., według których czułość i swoistość
tej metody przy stężeniu omawianego białka równemu 30 mg/l wynosi odpowiednio 100% i 94%.13
Warto jednak nadmienić, że przytoczone liczby
odnoszą się do różnicowania między ZJD a ChLC
i wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego łącznie,
podczas gdy nasze badanie dotyczyło tylko chorych na ChLC. Niemniej jednak, mimo pewnych
mankamentów metody, wydaje się, że oznaczanie
stężenia kalprotektyny może być pomocne na etapie różnicowania między zaburzeniami czynnościowymi a organicznymi jelit takimi, jak ChLC.
W szczególności test ten pomógłby w podejmowaniu decyzji – kogo kierować na dalszą diagnostykę, w tym na badania endoskopowe. To mogłoby zmniejszyć zarówno odsetek fałszywych diagnoz ZJD, jak i usprawnić proces kierowania pacjentów do pracowni endoskopowych.
Uzyskane wyniki sugerują również, że oznaczanie kalprotektyny w stolcu znalazłoby zastosowanie na etapie monitorowania chorych z już
rozpoznaną ChLC. Szczególnie istotne są wykazane korelacje z najczulszym spośród powszechnie
oznaczanych markerów zapalnych, jakim jest CRP
oraz ze stężeniem hemoglobiny, która w największym stopniu (w porównaniu ze stężeniem erytrocytów i hematokrytem) odzwierciedla nasilenie anemii.5 Brak istotnej statystycznie zależności
ARTYKUŁ ORYGINALNY Przydatność oznaczania kalprotektyny w stolcu w chorobie...
3
między CDAI a stężeniem kalprotektyny w stolcu wynika najprawdopodobniej z tego, że indeks
ten jest wysoce subiektywny i nierzadko słabo odzwierciedla nasilenie zmian zapalnych w przewodzie pokarmowym.
Zdaniem niektórych autorów regularne oznaczanie kalprotektyny u pacjentów będących w fazie remisji ChLC pomogłoby „przewidzieć” pojawienie się zaostrzenia,14 ponieważ proces zapalny w jelitach jest procesem ciągłym – nasila się
stopniowo przed ostrym rzutem choroby. Te zjawiska są nieme klinicznie. Dopiero przekroczenie
swoistego punktu krytycznego powoduje pojawienie się pełnoobjawowego zaostrzenia schorzenia.
Stale rosnące stężenie kalprotektyny w stolcu mogłoby sugerować nasilanie się zmian zapalnych
w jelitach, a wprowadzenie na tym etapie agresywnej terapii farmakologicznej – uchronić pacjenta przed ostrym rzutem choroby lub złagodzić jego przebieg. Jednak mimo obecności pewnych przesłanek, wciąż brak dużych badań potwierdzających przydatność takiego zastosowania omawianego testu.
Podsumowując – należy stwierdzić, że kalprotektyna może być dobrym markerem zapalnym
stosowanym w diagnostyce i monitorowaniu
chorych na ChLC. Białko to zaliczane jest do coraz większej grupy protein oznaczanych w stolcu u chorujących na NZJ, do których należą między innymi laktoferryna, lipokalina, lizozym czy
mieloperoksydaza.15,16 Zyskują one coraz większą
popularność ze względu na dużą przydatność kliniczną, prostotę oznaczania i niską inwazyjność
dla pacjentów. Jednak ostateczne miejsce wyżej
wymienionych białek w gastroenterologii nie jest
znane, stąd potrzeba prowadzenia dalszych badań w tym kierunku.
12 Sakata T, Niwa Y, Goto H, et al. Asymptomatic inflammatory bowel
disease with special reference to ulcerative colitis in apparently healthy
persons. Am J Gastroenterol. 2001; 96: 735-739.
13 Tibble J, Bjarnason I. Non-invasive investigation of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2001; 7: 460-465.
14 Tibble J, Sigthorhsson G, Bridger S, et al. Surrogate markers in intestinal inflammation are predictive of relapse in patients with inflammatory
bowel disease. Gastroenterology. 2000; 119: 15-22.
15 Lisowska-Myjak B, Walo M, Pachecka J. Białka endogenne w kale
jako markery laboratoryjne dla rozpoznawania, różnicowania i oceny
intensywności nieswoistych zapaleń jelit. Gastroenterol Pol. 2007; 14:
357-361.
16 Langhorst J, Elsenbruch S, Koelzer J, et al. Non-invasive markers in
the assessment of intestinal inflammation in inflammatory bowel disease:
performance of fecal lactoferrin, calprotectin, and PMN-elastase, CRP, and
clinical indices. Am J Gastroenterol. 2008; 103: 162-169.
Podziękowania Badanie częściowo sfinansowano z grantu SBN nr 502-05-02225359-50329.
Piśmiennictwo
1 Loftus EV. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: incidence, prevalence, and environmental influences. Gastroenterology. 2004;
126: 1504-1517.
2 Abreu MT, Sparrow MP. Translational research in inflammatory bowel
disease. Mt Sinai J Med. 2005; 78: 1067-1072.
3 Hendrickson BA, Gokhale R, Cho JH. Clinical aspects and pathophysiology of inflammatory bowel disease. Clin Microbiol Rev. 2002; 15: 79-94.
4 Yantis RK, Odze RD. Diagnostic difficulties in inflammatory bowel disease pathology. Histopathology. 2006; 48: 116-132.
5 Vermeire S, Van Assche G, Rutgeerts P. Laboratory markers in inflammatory bowel disease: useful, magic, or unnecessary toys? Gut. 2006; 55:
426-431.
6 Yui S, Nakatani Y, Mikami M. Calprotectin (S100A8/S100A9), an inflammatory protein complex from neutrophils with a broad apoptosis-inducing
activity. Biol Pharm Bull. 2003; 26: 753-760.
7 Kondera-Anasz Z, Marek Z, Mielczarek-Palasz A, et al. Kalprotektyna –
budowa i funkcje. PAMW. 2006; 3: 248-253.
8 Best WR, Becktel JM, Singleton JW. Rederived values of the eight coefficients of the Crohn’s Disease Activity Index (CDAI). Gastroenterology.
1979; 77: 843-846.
9 Foxx-Orenstein A. IBS – review and what’s new. Med Gen Med. 2006;
8: 20.
10 Bednarczuk A, Pawlik M, Rydzewska G. Zespół jelita nadwrażliwego –
czy są nowe aspekty diagnostyki i leczenia? Przew Lek. 2005; 10: 34-40.
11 Mack DR, Langton C, Markowitz J, et al. Laboratory values for children with newly diagnosed inflammatory bowel disease. Pediatrics. 2007;
119: 1113-1119.
4
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2008; 118 (11)