Ćwiczenia nr 6 i 7

MIKROBIOLOGIA KOSMETOLOGICZNA
dla studentów II roku, studiów I st.
kierunku KOSMETOLOGIA
Ćwiczenie 6 i 7
6 Fizjologia drobnoustrojów
Wymagania metaboliczne bakterii. Rodzaje podłóż mikrobiologicznych. Zasady hodowli
drobnoustrojów. Techniki posiewów na podłożach płynnych i stałych.
7 Typy wzrostu mikroorganizmów w pożywkach mikrobiologicznych. Morfologia kolonii
bakteryjnych. (Repetytorium – obejmujące materiał z ćwiczeń 1-7)
liczba godzin
2
2
Zagadnienia do ćwiczeń 6
1. Występowanie i właściwości fizjologiczne bakterii.
2. Wymagania metaboliczne bakterii.
3. Materiały zapasowe i przetrwalniki bakteryjne.
4. Rodzaje podłóż mikrobiologicznych - podział ze względu na konsystencję, skład, zastosowanie:
- płynne, półpłynne, stałe,
- naturalne, półsyntetyczne, sztuczne,
- proste, wzbogacone, wybiórczo-namnażające, wybiórczo-różnicujące, specjalne, transportowe.
5. Zasady hodowli drobnoustrojów (zawartość składników odżywczych w podłożu, pH, ciśnienie
osmotyczne, temperatura, potencjał oksydo-redukcyjny, czas).
6. Techniki posiewów na podłożach płynnych i stałych.
Zagadnienia do ćwiczeń 7
1. Typy wzrostu mikroorganizmów w pożywkach mikrobiologicznych płynnych, półpłynnych i stałych.
2. Cechy morfologii kolonii bakteryjnych (kształt, wielkość, brzeg, powierzchnia, struktura, kolor,
przejrzystość, konsystencja, zapach, inne np. typ hemolizy).
lp. Ćwiczenia praktyczne
Duża różnorodność wymagań metabolicznych i przystosowań fizjologicznych mikroorganizmów przyczynia się do ich
rozprzestrzenienia i występowania w wielu różnych środowiskach.
Zróżnicowane wymagania metaboliczne i właściwości biochemiczne mikroorganizmów pozwalają także na identyfikację
drobnoustrojów chorobotwórczych izolowanych od osób zakażonych.
Klasyczna diagnostyka mikrobiologiczna obejmuje:
- mikroskopowe badanie próbki pobranej od pacjenta – wykonanie preparatu bezpośredniego,
- wykonanie hodowli z tej próbki – posiew na podłoża płynne i stałe,
- izolację czystych szczepów i ich identyfikację metodami biochemicznymi, serologicznymi, molekularnymi, biologicznymi,
- badanie lekowrażliwości wyizolowanego drobnoustroju.
1 Podłoża mikrobiologiczne – sztucznie stworzone środowisko wzrostu do hodowli mikroorganizmów, stosowane do
namnażania, izolacji, różnicowania, identyfikacji, określania właściwości fizjologicznych i biochemicznych,
otrzymywania określonych produktów metabolizmu
A Podział ze względu na konsystencję:
Charakterystyka/przykłady
płynne
półpłynne
stałe
B
Podział ze względu na zawartość składników:
naturalne
Charakterystyka/przykłady
półsyntetyczne
syntetyczne
1
C
Podział ze względu na ilość i jakość składników: Charakterystyka/przykłady
proste
- płynne (bulion zwykły)
- stałe (agar zwykły)
wzbogacone
- płynne (bulion cukrowy)
- stałe (agar z 5% odwłóknioną krwią baranią)
wybiórczo-namnażające
- płynne (bulion z żółcią)
- stałe (podłoże z cetrymidem)
wybiórczo-różnicujące
- stałe (Chapmana)
specjalne
- płynne (Tarrozziego-Wrzoska)
- stałe (Loewensteina-Jensena)
transportowe
2
2
Wykonywanie posiewu redukcyjnego i murawkowego na stałym podłożu agarowym
- przygotować stanowisko pracy, pobrać hodowlę mikroorganizmów w podłożu płynnym (do posiewu) oraz 1 szalkę
z agarem zwykłym i podzielić ją na 2 połowy i opisać
Wykonanie posiewu redukcyjnego (jedna połowa szalki):
- jałową (wyżarzoną) ezą pobrać zawiesinę bakteryjną i nanieść na podłoże agarowe - posiew zacząć od górnego
brzegu szalki i dynamicznym ruchem zygzakowatym kierować ezę do środka szalki, pozostawiając znaczną część
powierzchni płytki wolną,
- ezę wyżarzyć się w płomieniu palnika, obrócić szalkę o 45° w lewo i ponownie wykonać zygzakowate ruchy ezą,
zahaczając na początku o wcześniejszą ścieżkę,
- ponownie wyżarzyć ezę i powtórzyć procedurę jeszcze dwa razy,
- po inkubacji w miejscach z ostatnich etapów posiewu redukcyjnego powstaną osobne kolonie bakterii wywodzące się
z pojedynczych komórek
Wykonanie posiewu murawkowego (druga połowa szalki):
- jałową (wyżarzoną) ezą pobrać zawiesinę bakteryjną i nanieść na podłoże agarowe – materiał należy rozprowadzać
gęstymi, zygzakowatymi ruchami ezy na całej połowie szalki, w trzech kierunkach, bez wyżarzania ezy przy zmianie
kierunku posiewu
- płytki inkubować w temperaturze 37ºC, przez 48 godzin, do góry dnem
- po inkubacji opisać morfologię kolonii drobnoustrojów wyrosłych na agarze zwykłym w sektorze, w którym
wykonano posiew redukcyjny
- opis morfologii kolonii bakteryjnych powinien obejmować następujące dane: kształt, wielkość, kolor, brzeg,
powierzchnia, struktura, przejrzystość, (konsystencja, zapach)
rysunek wykonania posiewów:
posiew redukcyjny
posiew murawkowy
opis kolonii wyrosłych na agarze zwykłym:
3
3
Badanie właściwości metabolicznych mikroorganizmów
- wykonywanie posiewów na podłoża diagnostyczne z podłóż stałych
- jedna osoba z pary wykonuje posiew Escherichia coli, druga Pseudomonas aeruginosa
A Źródła węgla
A.1 Badanie zdolności do rozkładu laktozy w warunkach tlenowych - podłoże Endo
wykonać posiew redukcyjny na podłożu Endo
- płytki inkubować w temperaturze 37ºC, przez 24-48 godzin, do góry dnem,
- po okresie inkubacji odnotować wynik.
Podłoże Endo – zawiera laktozę (źródło węgla), fuksynę zasadową i siarczyn sodowy redukujący fuksynę do
bezbarwnej leukozasady. Po okresie inkubacji, bakterie fermentujące laktozę wytwarzają w procesie fermentacji
aldehyd octowy, który powoduje uwolnienie fuksyny - dzięki temu podłoże oraz kolonie przybierają barwę
ciemnoczerwoną z metalicznym zielono-złotym połyskiem.
wynik:
fermentacja laktozy - podłoże i kolonie ciemnoczerwone z metalicznym zielono-złotym połyskiem,
brak fermentacji laktozy – kolonie białe, przejrzyste, błyszczące.
A.2 Badanie zdolności do rozkładu laktozy w warunkach beztlenowych - woda peptonowa z 10% laktozą pod
parafiną
wykonać posiew za pomocą jałowej ezy - pobrać posiewany materiał, wprowadzić ezę pod warstwę parafiny przy
ściance probówki i uwolnić materiał do pożywki
- inkubację prowadzić w temperaturze 37°C, przez 24-48 godzin,
- po okresie inkubacji odnotować wynik.
Woda peptonowa z 10% laktozą pod parafiną – w skład pożywki oprócz laktozy wchodzi wskaźnik pH - purpura
bromokrezolowa (wyjściowa barwa pożywki: fioletowo-purpurowa). Jeśli nastąpi beztlenowy, bakteryjny rozkład
laktozy dochodzi do zakwaszenia (obniżenia pH) pożywki przez akumulujące się produkty przemian metabolicznych,
co manifestuje się zmianą barwy pożywki po inkubacji na kolor żółty.
wynik:
beztlenowy rozkład laktozy: pożywka żółta,
brak rozkładu laktozy: pożywka fioletowo-purpurowa (barwa wyjściowa).
A.3 Badanie wykorzystywania cytrynianu sodu jako jedynego źródła węgla – podłoże Simmonsa
wykonać posiew za pomocą jałowej igły - pobrać posiewany materiał, posiew wykonać poprzez rozprowadzenie
materiału zygzakowatym ruchem igły po skośnej części podłoża
- inkubację prowadzić w temperaturze 37°C, do 5 dni,
- po okresie inkubacji odnotować wynik.
Podłoże Simmonsa – zawiera cytrynian sodu jako jedyne źródło węgla oraz nieorganiczną sól amonową jako
źródło azotu, wskaźnikiem pH jest błękit bromotymolowy – wyjściowa barwa pożywki: zielona. Bakterie
mające zdolność wykorzystywania cytrynianu sodu uwalniają jon amonowy z soli amonowej, co prowadzi
do alkalizacji podłoża (wzrost pH) i barwa pożywki zmienia się po inkubacji na niebieską.
wynik:
wykorzystywanie cytrynianu sodu jako jedynego źródła węgla: podłoże niebieskie,
brak zdolności do wykorzystywania cytrynianu sodu: brak wzrostu, podłoże zielone (barwa wyjściowa).
B Źródła azotu
B.1 Badanie zdolności do rozkładu mocznika - podłoże Christensena
wykonać posiew za pomocą jałowej ezy - pobrać posiewany materiał, wprowadzić ezę do probówki i uwolnić materiał
do pożywki
- inkubację prowadzić w temperaturze 37°C, przez 24-48 godzin,
- po okresie inkubacji odnotować wynik.
Mocznik może stanowić źródło azotu dla bakterii, które posiadają enzym umożliwiający hydrolizę tego związku, tj.
ureazę. Przy udziale ureazy mocznik jest rozkładany do dwutlenku węgla i amoniaku. Zdolność bakterii do rozkładu
mocznika bada się z wykorzystaniem podłoża Christensena
Podłoże Christensena – oprócz mocznika jako jedynego źródła azotu zawiera wskaźnik pH – czerwień fenolową
(wyjściowa barwa pożywki: żółta, słomkowa). Jeśli testowany mikroorganizm rozkłada mocznik, następuje alkalizacja
podłoża (wzrost pH) wskutek uwolnienia amoniaku i podłoże po inkubacji zmienia barwę na czerwono-fioletową
wynik:
rozkład mocznika: pożywka czerwono-fioletowa,
brak rozkład mocznika: pożywka żółta (barwa wyjściowa).
4
3
Badanie właściwości metabolicznych mikroorganizmów – odczyt
cecha
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
A.1 rozkład laktozy na podłożu Endo
rozkład laktozy w warunkach
beztlenowych
wykorzystywanie cytrynianu sodu
A.3
jako jedynego źródła węgla
A.2
B.1
4
rozkład mocznika
Prezentacja testu API
Test API jest testem biochemicznym umożliwiającym identyfikację gatunku mikroorganizmu. Składa się z 20
miniprobówek z przezroczystego tworzywa wtopionych w pasek również wykonany z tworzywa. W każdej
miniprobówce znajduje się odwodniony substrat i wskaźnik umożliwiający odczytanie reakcji.
Oznaczenie polega na dodaniu zawiesiny badanych bakterii do wszystkich probówek i po inkubacji dodaniu do
niektórych probówek odpowiednich odczynników. Zmiany barwy zawartości probówek umożliwiają określenie, jakie
substraty są rozkładane lub jaki rodzaj aktywności enzymatycznej występuje. Określenie grupy lub gatunku dokonuje
się na podstawie załączonego przez producenta klucza diagnostycznego. Do odczytu służy książka kodowa lub
program komputerowy.
5