docProFil ekspresji genów kodujących białka związane z aktywnościa
download 
Reklamacja Transkrypt
ProFil ekspresji genów kodujących białka związane z aktywnościa
&ARM0RZEGL.AUK COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 0ROFILEKSPRESJIGENÌWKODUJCYCHBIAKA ZWIZANEZAKTYWNOuCIABIOLOGICZNLEPTYNY WRAKUENDOMETRIUM %XPRESSIONPROFILEOFGENESCONNECTEDWITHBIOLOGICALACTIVITYOFLEPTIN INENDOMETRIALCANCER -AGORZATA3TACHOWICZ*OANNA/RCHEL*ACEK/LENDER )ZABELA7OxNICZKO!NDRZEJ7ITEK +ATEDRAI:AKAD"IOLOGII-OLEKULARNEJW3OSNOWCU +ATEDRAI+LINIKA0OONICTWAI'INEKOLOGIIW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD'ENETYKI-EDYCZNEJW3OSNOWCU +ATEDRAI:AKAD"IOLOGII-OLEKULARNEJW3OSNOWCU +IEROWNIKDRHAB5RSZULA-AZUREK Streszczenie Leptyna indukuje wzrost komórek nowotworowych poprzez aktywację różnych ścieżek sygnałowych w komórce. Celem pracy było porównanie transkryptomów tkanek endometrium wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) oraz wyselekcjonowanie z puli transkryptów genów kodujących białka związane z aktywnością biologiczną leptyny, które na poziomie mRNA różnicują tkanki endometrium. W badaniu analizowano wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraka endometrium G1-G4, Na podstawie bazy Affymetrix, bazy NCBi i danych literaturowych wyselekcjonowano 91 transkryptów genów kodujących białka związane z aktywnością biologiczną leptyny. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Expres wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance analysis of microarrays) Wśród tych genów w gruczolakoraku endometrium obserwowano nadekspresję MMP2, MMP9 i VEGFA. w porównaniu do endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej. Słowa kluczowe; leptyna, mikromacierz oligonukleotydowa, rak enometrium ' Ö Leptyna (LEP) początkowo zidentyfikowana jako hormon związany z regulacją przyjmowania pokarmu, jest adipokiną o wielokierunkowym działaniu. Plejotropowa natura leptyny związana jest z występowaniem w organizmie receptora leptyny Ob-R. Znanych jest kilka izoform receptora leptyny będących wynikiem alternatywnego składania eksonów i proteolitycznego rozszczepienia białek już istniejących izoform receptora (ryc. 1). Wewnątrzko- Summary Intracellular signalling pathways are activated by leptin and are involved in cancerogenesis. The aim of the study was to analyze of endometrial tissues transcriptome by using oligonucleotide microarray technique (HGU133A Affymetrix). Next, among from 91 transcripts connecting with biological activity of leptin there were choose genes which differentiated investigated tissues of endometrium. There were analyzed: endometrium histopatological estimated as healthy in proliferative phase and endometrial adenocarcinoma (G1-G4). The obtained values of fluorescence for each probe on microarray chips were normalized with the RMAExpress.. Differences in mRNA levels were evaluated with SAM program (Significance Analysis of Microarrays), Statistica v.6,0 and Excel. Among from 91 transcripts connecting with biological activity of leptin including transcripts involved in leptin– induced intracellular signaling pathway; MMP2, MMP9 i VEGFA occurred overexpression in cancer tisssues. Key words; leptin, oligonucleotide microarray, endometrial cancer mórkowa domena receptora leptyny Ob-Rb zawiera region box1 złożony z 29 aminokwasów, który przyłącza domenę kinazy tyrozynowej Janusa JAK2, region box2 również odpowiedzialny za przyłączenie kinazy JAK oraz region box3, miejsce wiązania białek STAT (ang. signal transducer and activator of transcription), które po ufosforylowaniu i utworzeniu dimerów pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych w regulacji ekspresji genów [1,] (ryc. 1). Badania Myers’a dowodzą, że w przypadku długiej izoformy receptora leptyny Ob-Rb do aktywacji kinaz JAK oprócz regionu box1 &ARM0RZEGL.AUK kinase1) oraz kinazy MEK1/MAP2K1 i MEK2/MAP2K2 (ang. mitogen-activated protein kinase kinase 1; mitogenactivated protein kinase kinase 2) i kinaza Raf [2]. Kinazy MAP przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie dochodzi do fosforylacji i aktywacji czynników transkrypcyjnych, takich jak c-jun, c-fos, c-myc, erg-1 i w konsekwencji prowadzi do indukcji ekspresji genów związanych z procesami proliferacji i różnicowania]. Ufosforylowana Tyr 985 jest miejscem przyłączania się zarówno fosfatazy tyrozynowej SHP-2 jak i białka hamującego przekaz sygnału, białka SOCS3 (ang. suppressor of cytokine signaling 3). Przyłączenie białka SOCS3 do reszty Tyr 985 Ryc. 1. Izoformy receptora leptyny; Ob-Ra – krótka izoforma receptora leptyny, Obznosi sygnał przekazywany za pośrednicRb – długa izoforma receptora leptyny, Ob-Re – rozpuszczalna forma receptora twem Ob-Rb z powodu uniemożliwienia leptyny, Lep – leptyna, regiony – box-1, box-2, box-3; JAK2 – kinaza tyrozynowa Janusa 2 (ang. Janus Kinase 2), Tyr985, Tyr1077, Tyr1138 – reszty tyrozynowe w obrębie przyłączenia się JAK2 do receptora. Białwewnątrzkomórkowej domeny długiej izoformy receptora leptyny, p – fosforylacja, ko SOCS3 oddziałuje poprzez domeny SH2 białka STAT (ang. the Signal Transducers and Activators of Transcription), MAP – kiz ufosofrylowaną resztą Tyr 985 receptora nazy aktywowane mitogenami (ang. mitogen-activated protein kinases) leptyny blokując jego aktywność [2]. Badania ostatnich lat wykazały obecwymagana jest także obecność odcinka złożonego z 31-36 ność jej receptorów (LEPR) w wielu komórkach i narząreszt aminokwasowych [2]. dach, a co za tym idzie zaangażowanie leptyny w: angioDługa izoforma receptora leptyny OB-Rb, ze względu genezę, dojrzewanie układu rozrodczego, tworzenie kości, na podobieństwo strukturalne do podjednostki gp 130, aktygojenie ran, a także funkcjonowanie układu immunologiczwuje po połączeniu się z ligandem ścieżki przekazu sygnału nego [3,4,5,]. Badania ostatnich lat dowodzą, że leptyna inw komórce. Białko gp 130 oddziałuje z kinazami tyrozynodukuje wzrost komórek nowotworowych poprzez aktywawymi z rodziny JAK (Janus Kinase) i jest łącznikiem przecję różnych ścieżek sygnałowych w komórce [6,7,8,9,10,]. noszącym pobudzenie z aktywowanego receptora na kinazę Poznanie plejotropowej aktywności leptyny w komórkach tyrozynową Jak pokazano na rycinie 1, Ob-Rb posiada w obrębie zmienionych nowotworowo może w przyszłości być wywewnątrzkomórkowej domeny trzy konserwatywne reszty korzystane do projektowania strategii terapeutycznych tyrozynowe; Tyr 985, Tyr 1077 i Tyr 1138, które wykazują w walce z rakiem. Chociaż ilość prac dotyczących funkcji różną zdolność aktywowania przekazu sygnału w komórce leptyny i jej receptora w różnych typach nowotworów stale i określają plejotropową naturę receptora leptyny. Leptyna wzrasta, to jednak nadal jest to temat nie do końca poznany. łącząc się na powierzchni komórki z receptorem OB-Rb po- Do dzisiaj nie została w pełni poznana funkcja leptyny i jej woduje jego dimeryzację i aktywuje poprzez transfosforyla- receptora w progresji różnych typów nowotworów, w tym cję kinazę tyrozynową Janusa JAK2, co w dalszej kolejności w raku endometrium, który jest piątym pod względem częprowadzi do fosforylacji reszt tyrozynowych w obrębie we- stości występowania nowotworem złośliwym kobiet [11]. Nowotwory zaliczane na podstawie badania klinicznego wnątrzkomórkowej domeny OB-Rb. Tyr 985 uczestniczy w aktywacji w komórce szlaku i patomorfologicznego do tego samego stadium zaawansoERK1/2 – szlaku kinaz regulowanych przez sygnały ze- wania, leczone w ten sam sposób, w różnym stopniu poddają wnątrzkomórkowe (ang. extra cellular signal-regulated się terapii. Różnice te przypisywane są cechom molekularkinases). Kinaza tyrozynowa JAK 2 asocjuje z Ob-Rb za nym, które odpowiedzialne są za różny przebieg kliniczny pośrednictwem domeny box1 oraz fragmentu złożonego nowotworów o podobnym obrazie histologicznym. Analiza z 31-36 aminokwasów. Ufosforylowane reszty tyrozynowe molekularna nowotworów umożliwia poszukiwanie genów, na powierzchni Ob-Rb stanowią miejsca przyłączania białek które są zaangażowane w proces nowotworzenia. Duże nasygnałowych z domenami SH2 (ang. Src homology). Ufos- dzieje w leczeniu nowotworów wiąże się z terapią celowaforylowana reszta Tyr 985 przyłącza fosfatazę tyrozynową ną, której głównym przesłaniem jest poszukiwanie leków SHP-2, która następnie ulega fosforylacji i przyłącza białko z grupy związków oddziałujących na receptory substancji adaptorowe Grb2. W konsekwencji w komórce zostaje uru- będących czynnikami wzrostu. Szlaki przekazywania sychomiony przekaz sygnału za pośrednictwem kaskady kinaz gnału w komórce odgrywające rolę w regulacji proliferacji, MAP-2 białkowych kinaz aktywowanych przez czynniki apoptozie i transformacji nowotworowej stanowią podstamitogenne (ang. mitogen activated protein kinases), w który wę badań mających na celu poszukiwanie potencjalnych ostatecznie zaangażowane są kinazy ERK (ERK1; MAPK3 markerów mających znaczenie w procesie nowotworzenia. ang. extracelluarly regulated protein kinases1; mitogen- Ponieważ zasadniczym założeniem terapii celowanej jest activated protein kinase 3 i ERK2; MAPK1 – extracellu- poszukiwanie leków, które byłyby w stanie hamować receparly regulated protein kinases2; mitogen-activated protein tory komórkowe, za pośrednictwem których dochodzi w ko- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. mórce do pobudzenia szlaków związanych z procesami nowotworzenia, coraz większe znaczenie mają badania prowadzone na poziomie całego, genomu, transkryptomu lub proteromu Celem przedstawionej pracy było porównanie transkryptomów związanych z aktywnością biologiczną leptyny w endometrium prawidłowym w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraku endometrium, wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix). - Rl-tluR |J¬ Materiał do badań stanowiły wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraka endometrium G1-G4, pobieranych od chorych leczonych w Katedrze i Klinice Położnictwa i GinekoRyc 2. Geny związane z aktywnością biologiczną leptyny charakteryzujące się nadelogii w Katowicach. kspresją aktywności transkrypcyjnej w raku endometrium w porównaniu do aktywności Ekstrakcja całkowitego RNA: Po homo- transkrypcyjnej genów w endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej genizacji 50-100 mg wycinków endometrium przy użyciu homogenizatora Pozytron w programie RMA Expres wykorzystując programy kompu(Kinematyka AG, Szwajcaria), ekstrahowano RNA z uży- terowe: Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance anaciem odczynnika TRIZOL (Gibco BRL) (Invitrogen Life lysis of microarrays). Technologies, Kalifornia, USA), zgodnie z protokołem producenta Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wy- '¬ylpl korzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit, Qiagen w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń DNA. Ekstrakty Analizę profilu ekspresji genów kodujących białka kaRNA oceniano ilościowo przy użyciu spektrofotometru Ge- skad sygnałowych aktywowanych przez leptynę w wycinneQuant II (Pharmacia) Wartość absorbancji przy długości kach endometrium, rozpoczęto od porównania raportów fali 260 nm była podstawą do obliczenia stężenia RNA, wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymeprzy założeniu, że wynik pomiaru w kuwecie o drodze trix bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescencji na optycznej 1 cm równy 1 OD260 odpowiada stężeniu 40 μg mikromacierzy. Rozkład sygnałów fluorescencji na płytce, RNA w 1 cm3 ekstraktu, oraz jakościowo techniką elektro- zgodny z zaleceniami producenta mikromacierzy (Affymeforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem ety- trix „Technical Manual GeneChip Expression Analysis”) dyny. był podstawą do akceptacji kolejnych transkryptomów do Wyznaczanie transkryptomu metodą mikroma- analizy porównawczej, którą rozpoczęto od normalizacji cierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HG- wyników w programie RMA Express, w celu wyrównania U133A (Affymetrix). Około 8 μg całkowitego RNA zostało zróżnicowanych wartości tła oraz szumu, zmniejszającego wykorzystane do syntezy dwuniciowego cDNA (Gibco BRL prawdopodobieństwo błędnej interpretacji wyników. SuperScript Choice system). W następnym etapie otrzymaAnalizę porównawczą transkryptomów, rozpoczęto od ny cRNA wyznakowano biotyną (reakcja transkrypcji in grupowania transkryptomów wykonując aglomeracyjną vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA analizę skupień. Jako miarę odległości między mikromaprzeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3 cierzami wykorzystano odległość Czebyszewa, a zastosooraz HG-U133A (Affymetrix) Znakowanie produktów hy- waną metodą aglomeracji była metoda średnich połączeń brydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem ważonych. Oceniono w ten sposób zgodność grupowania streptawidyna–fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami wycinków na podstawie charakterystyki klinicznej, histopaprzeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi tologicznej i molekularnej. Do analizy porównawczej typostreptawidyna–fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGE- wano te transkryptomy, które były kwalifikowane do tej saWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej mej grupy, niezależnie od zastosowanego kryterium podziaHG–U133A w przewodniku Gene Expression Analysis łu (klinicznego, histopatologicznego czy molekularnego). Technical Manual (Affymetrix, Kalifornia, USA). W naW dalszym etapie analizy porównawczej z grupy 22283 stępnym etapie płytki mikromacierzy poddano skanowaniu mRNA, które można analizować na mikromacierzy HGskanerem Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent U133A, na podstawie danych literaturowych oraz bazy Technologies, Kalifornia, USA). Otrzymane wyniki inten- NCBI i Affymetrix wyselekcjonowano 91 transkryptów, sywności fluoroscencji zostały zapisane i zarchiwizowa- których geny kodują białka uczestniczące w ścieżkach przene w programie Microarray Suite. Analizę porównawczą kazu sygnału w komórce, aktywowanych przez leptynę. transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wynikow Następnie wykorzystując technikę Blanda i Altmana wy- &ARM0RZEGL.AUK ID 201069_at 201693_s_at 203936_s_at 211527_x_at mRNA MMP2 EGR1 MMP9 VEGFA Metaloproteinaza 2 (gelatinase A), białko odpowiedzi wczesnego wzrostu (early growth response 1) metallopeptidase 9 (gelatinase B), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular endothelial growth factor A SLR 1,41 2 SLR 4,09 2,24 9,4 ↑ 1,81 6,11 ↑ 1,58 4,85 ↑ ↑ Tabela 1 Transkrypty różnicujące raka endometrium wybrane z 91 mRNA związanych z aktywnością biologiczną leptyny. SLR – ang. signal log ratio – stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych grupach, 2SLR – wartość opisująca wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji pomiędzy porównywanymi transkryptomami, strzałka ↑ - oznacza, nadekspresję genu w wycinkach gruczolakoraka endometrium selekcjonowano geny, które różnicują wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej i gruczolakoraka endometrium G1-G4 (tab. 1, ryc 2). ¬p¥oTechnika mikromacierzy oligonukleotydowych została wykorzystana w celu analizy transkryptów wchodzących w skład ścieżek sygnałowych aktywowanych w komórce po połączeniu się leptyny z jej receptorem. Spośród 91 transkryptów genów związanych z aktywnością biologiczną leptyny, Wyznaczenie dla wszystkich transkryptów parametru SLR wskazującego wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji charakterystycznych dla transkryptomów endometrium kontrolnego i gruczolakoraka, stanowilo jedno z kryteriów typowania genów różnicujących endometrium. Otrzymane wyniki wskazują, że obserwowane różnice aktywności transkrypcyjnej genów tj. MMP2, MMP9 i VEGFA mogą mieć związek z procesem angiogenezy, W danych literaturowych wciąż poszerzana jest lista czynników i cząsteczek stymulujących ten proces. Istnieją doniesienia literaturowe, w których podkreśla się udział leptyny jako czynnika proangiogennego stymulującego proces angiogenezy in vivo i in vitro. Badania Somasundar i wsp. [13] na przykład dowodzą, że in vitro leptyna ma zdolność wzmagania proliferacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z siłą działania podobną do tej, jaką posiada VEGF (vascular endothelial growth factor). Badania prowadzone na modelach zwierzęcych potwierdziły, że leptyna ma zdolność stymulowania procesu angiogenezy synergistycznie z dwoma innymi kluczowymi czynnikami proangiogennymi, tj. z FGF-2 (fibroblast growth factor) i VEGF. Ponadto leptyna zwiększa ekspresję genów zaangażowanych w proces angiogenezy, tj.: MMP-2 (matrix metalloproteinases 2) i MMP-9 (matrix metalloproteinases 9) [14]. W świetle otrzymanych wyników wydaje się jednak, że proces angiogenezy w raku endometrium stymulowany jest raczej poprzez aktywację VEGF a nie leptynę, o czym świadczy brak tej ostatniej wśród genów różnicujących badane tkanki nowotworowe i histopatologicznie ocenione jako zdrowe. Piśmiennictwo 1. Frühbeck G. Intracellular signalling pathways activated by leptin. Biochem J 2006; 1(393): 7-20. 2. Myers MG, Jr. Leptin receptor signaling and the regulation of mammalian physiology. The Endocrine Society 2004; 59: 287-304. 3. Trentz O.A , Handschin A.E., Hemmi S., Zund G, Wanner G.A., Trentz O. Leptin regulates human osteoblast proliferation and phenotype marker expression in vitro. European Cells and Materials. 2004; 7(1), 89 4. Frank S., Stallmeyer B., Kampfer H., Kolb N., Pfeilschifter J. Leptin enhances wound re-epithelialization and constitutes a direct function of leptin in skin repair. JClin-Invest. 2000; 106(4), 501-9 5. Matarese G. Leptin and the immune system: how nutritional status influences the immune response. Eur Cytokine Netw. 2000; 11(1), 7-14 6. Pai R, Lin C, Tran T, Tarnawski A. Leptin activates STAT and ERK2 pathways and induces gastric cancer cell proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Jun 17;331(4):984-92 7. Frankenberry KA, Skinner H, Somasundar P, McFadden DW, Vona-Davis LC. Leptin receptor expression and cell signaling in breast cancer. Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):985-93 8. Somasundar P, Frankenberry KA, Skinner H, Vedula G, McFadden DW, Riggs D, Jackson B, Vangilder R, Hileman SM, Vona-Davis LC. Prostate cancer cell proliferation is influenced by leptin. J Surg Res. 2004 May 1;118(1):71-82] 9. Attoub S., Noe V., Pirola L., Bruyneel E., Chastre E., Mareel M., Wymann M.P., Gespach Ch. Leptin promotes invasiveness of kidney and colonic epithelial cells via phosphoinositide 3-kinase-, Rho-, and Rac-dependent signaling pathways. The FASEB Journal. 2000;14, 2329-2338 10. Koda M., Sulkowska M., Wincewicz A., Kanczuga-Koda L., Musiatowicz B., Szymanska M, Sulkowska S. Expression of leptin, leptin receptor, and hypoxia inducible factor 1α in human endometrial cancer. Annals of the New York Academy of Sciences. 2007; 1095(1), 90-98 11. Kaźmierczak W. Rak endometrium – aspekty hormonalne. Ginek Prakt. 2004; 12( 2), 13-16 12. Somasundar P, Yu AK, Vona-Davis L, McFadden DW. Differential effects of leptin on cancer in vitro. J Surg Res 2003; 113: 50-55. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 13. Park HY, Kwon HM, Lim HJ, Hong BK, Lee JY, Park BE, Jang Y, Cho SY, Kim HS. Potential role of leptin in angiogenesis: leptin induces endothelial cell proliferation and expression of matrix metalloproteinases in vivo and in vitro. Exp Mol Med. 2001; 33(2): 95-102. Adres do korespondencji: mgr Małgorzata Stachowicz Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Wydziału Farmaceutycznego i Oddziału Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, 41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1, tel.: 00 48 032 364 10 20, fax: 00 48 032 364 10 20, e-mail: [email protected]
