M47 Microgen Strep

M47 MICROGEN®Strep
PRZEZNACZENIE TESTU
®
MICROGEN Strep jest szybkim testem szkiełkowym aglutynacji lateksowej do typowania paciorkowców
z podłoŜy stałych do grup A, B, C, D, F i G wg Lancefield.
Większość szczepów paciorkowców izolowanych z zakaŜeń u ludzi posiada antygeny swoiste grupowo.
Identyfikacja szczepów polega na ekstrakcji i charakterystyce tych antygenów z organizmów z rosnących
hodowli. System do grupowania paciorkowców zawiera odczynnik enzymatyczny do szybkiej ekstrakcji
antygenów wielocukrowych oraz serię aglutynacyjnych odczynników lateksowych swoistych dla grup A, B, C, D,
F i G w celu szybkiego wykrycia i identyfikacji wyekstrahowanych antygenów.
Produkt przeznaczono jedynie do uŜytku profesjonalnego.
ZASADA TESTU
Zestaw zawiera 6 buteleczek z cząsteczkami lateksu indywidualnie uczulonymi przeciwciałami króliczymi
swoistymi dla jednego z wielocukrowych antygenów paciorkowcowych z grupy A, B, C, D, F lub G. Kolonie
paciorkowcowe pobrane z płytek agarowych inkubuje się z roztworem enzymu, aby wyekstrahować antygen.
Mieszanina ekstrakt/antygen jest badana na karcie reakcyjnej z 6 zawiesinami pokrytych przeciwciałami
cząsteczek lateksowych, kaŜdej swoistej dla jednej z grup A, B, C, D, F lub G. W obecności antygenu
homologicznego cząsteczki jednej z zawiesin będą tworzyć agregat, dając widoczną aglutynację,
w przeciwieństwie do innych zawiesin, które pozostają jednorodne.
SKŁAD TESTU
KaŜdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla 50 testów. Data waŜności kaŜdego odczynnika znajduje się
na naklejce na buteleczce.
M47a REAG A: 2,5 ml
Zawiera cząsteczki lateksu uczulone króliczymi przeciwciałami przeciw paciorkowcom z grupy A w buforze ze
stabilizatorem i 0,099% azydkiem sodowym jako konserwantem.
M47b REAG B: 2,5 ml
Zawiera cząsteczki lateksu uczulone króliczymi przeciwciałami przeciw paciorkowcom z grupy B w buforze ze
stabilizatorem i 0,099% azydkiem sodowym jako konserwantem.
M47c REAG C: 2,5 ml
Zawiera cząsteczki lateksu uczulone króliczymi przeciwciałami przeciw paciorkowcom z grupy C w buforze ze
stabilizatorem i 0,099% azydkiem sodowym jako konserwantem.
M47d REAG D: 2,5 ml
Zawiera cząsteczki lateksu uczulone króliczymi przeciwciałami przeciw paciorkowcom z grupy D w buforze ze
stabilizatorem i 0,099% azydkiem sodowym jako konserwantem.
M47f REAG F
: 2,5 ml
Zawiera cząsteczki lateksu uczulone króliczymi przeciwciałami przeciw paciorkowcom z grupy F w buforze ze
stabilizatorem i 0,099% azydkiem sodowym jako konserwantem.
M47g REAG G: 2,5 ml
Zawiera cząsteczki lateksu uczulone króliczymi przeciwciałami przeciw paciorkowcom z grupy G w buforze ze
stabilizatorem i 0,099% azydkiem sodowym jako konserwantem.
M47p KONTROLA +:
1,0 ml
Dodatnia kontrola, zawierająca inaktywowany poliwalentny ekstrakt antygenowy dla grup A, B, C, D, F i G,
zakonserwowany 0,099% azydkiem sodowym.
M47x ENZ: 2 x 10 ml
Liofilizowany enzym ekstrakcyjny
Jednorazowe karty reakcyjne i jednorazowe pałeczki do mieszania
DODATKOWE MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIE WCHODZĄCE W SKŁAD ZESTAWU
• ezy bakteriologiczne
• szklane lub plastykowe probówki
• pipeta do odmierzenia objętości 0,4 ml
• łaźnia wodna nastawiona na 37°C
• zakraplacze do próbek lub pipetki pasterowskie
M47 MICROGEN®Strep
Strona 1
•
minutnik laboratoryjny
ŚRODKI OSTROśNOŚCI
®
1. MICROGEN Strep jest przeznaczony wyłącznie do uŜytku in vitro.
2. Nie uŜywać odczynników po upływie daty waŜności na naklejce na kartonowym opakowaniu zestawu.
3. Nie zanieczyszczać krzyŜowo odczynników ani próbek.
4. Wykonywać test wyłącznie zgodnie z instrukcją dostarczoną z zestawem.
5. Nie pipetować próbek lub odczynników ustami.
6. Wszystkie próbki kliniczne i hodowle powinny być uwaŜane za zakaźne i traktowane oraz niszczone
zgodnie z zaakceptowaną procedurą. Dekontaminację materiału zakaźnego moŜna przeprowadzić
podchlorynem sodowym w końcowym stęŜeniu 3% przez 30 min.
7. Odczynniki w tym zestawie zawierają 0,099% azydek sodowy jako konserwant, więc naleŜy zachować
ostroŜność w obchodzeniu się z nimi. Azydek sodowy moŜe reagować z ołowianą lub miedzianą
instalacją kanalizacyjną, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Po utylizacji odczynniki zalać
duŜą objętością wody, aby zapobiec osadzaniu się azydków.
PRZECHOWYWANIE
Przechowywać wszystkie odczynniki w temp. 2 - 8°C. Nie zamraŜać. W tych warunkach odczynniki powinny
nadawać się do uŜytku do upływu daty waŜności na kartonie z zestawem. Enzym ekstrakcyjny jest stabilny przez
3 miesiące po rozpuszczeniu, jeŜeli przechowuje się go w temp. 2 - 8°C. Aby przedłuŜyć czas waŜności enzymu,
moŜna go rozlać do odpowiednich probówek w objętości 0,4 ml i przechowywać zamroŜony w temp. -20°C lub
poniŜej, to będzie stabilny przez 6 miesięcy. Enzymu nie powinno się rozpuszczać i zamraŜać więcej niŜ raz.
OZNAKI POGORSZENIA JAKOŚCI TESTU
MoŜna podejrzewać pogorszenie jakości testu, jeŜeli:
• Widoczne jest wyraźne wykłaczanie któregoś z odczynników lateksowych i nie moŜna go usunąć przez
energiczne wytrząsanie buteleczki przez kilka sekund.
• Kontrola dodatnia lub enzym ekstrakcyjny stają się mętne lub tworzy się w nich osad.
• Dodatnia kontrola nie powoduje aglutynacji jednego lub więcej odczynników lateksowych
w przepisanym czasie reakcji.
• Sam enzym ekstrakcyjny powoduje aglutynację jednego z odczynników lateksowych.
Odczynników wykazujących oznaki pogorszenia jakości nie powinno się uŜywać.
PRZYGOTOWANIE HODOWLI I PRÓBEK
Test jest przeznaczony do badania kolonii o wyglądzie i charakterze wzrostu paciorkowców po całonocnej
hodowli na rutynowych podłoŜach laboratoryjnych. Szczegóły dotyczące pobierania i dalszego postępowania
z materiałami oraz na temat wyboru, posiewania i inkubacji podłoŜy, zawarte są w podstawowych
podręcznikach.
Kolonie moŜna pobierać z płytek z pierwotną hodowlą, lub z czystych przesiewów, po upływie pierwszej doby
po posianiu na podłoŜa.
Nie powinno się uŜywać starych hodowli. Własności hemolityczne hodowli są waŜną cechą diagnostyczną
i powinno się zaznaczyć, czy wzrost badanych bakterii pochodzi z podłoŜa z dodatkiem krwi.
KONTROLE
Kontrolę dodatnią powinno się przeprowadzać regularnie, aby upewnić się, Ŝe odczynniki dają prawidłowe
wyniki.
Kontrola dostarczona jest w stanie gotowym do uŜycia i powinno się ją dodawać w miejsce ekstraktu z hodowli
w procedurze badawczej. Kontrola dodatnia powinna dawać aglutynację z kaŜdym z odczynników lateksowych.
JeŜeli nie zachodzi aglutynacja, moŜe to być oznaką inaktywacji odczynnika lateksowego.
JeŜeli potrzebna jest kontrola ujemna, powinno się dodać czysty enzym ekstrakcyjny w miejsce ekstraktu
z hodowli w procedurze badawczej.
PROCEDURA BADAWCZA
®
Przed uŜyciem doprowadzić cały zestaw odczynników MICROGEN Strep do temperatury pokojowej!
Dla kaŜdego badanego szczepu:
1. Doprowadzić odczynniki lateksowe i kontrolę dodatnią do temperatury pokojowej.
M47 MICROGEN®Strep
Strona 2
2. Bezpośrednio przed uŜyciem rozpuścić enzym w butelce, dodając 10 ml wody destylowanej. Wymieszać
delikatnie do zupełnego rozpuszczenia. Rozlać po 0,4 ml do małych probówek.
3. Pobrać ezą kolonie paciorkowcowe z powierzchni agaru i dokładnie zawiesić w probówce z enzymem
ekstrakcyjnym. Aby otrzymać najlepszy wynik, pobrać do ekstrakcji 4 lub 5 kolonii średniego rozmiaru
lub ich ekwiwalent. Zbyt gęsta zawiesina w enzymie ekstrakcyjnym moŜe powodować niespecyficzną
aglutynację. Dla szczepów rosnących w postaci małych kolonii moŜe być konieczne pobranie materiału
wymazówką.
4. Inkubować probówkę przez 10 do 15 min. w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Wstrząsnąć probówkę
po pierwszych 5 minutach inkubacji i wytrząsać energicznie przed badaniem, aby otrzymać jednolitą
zawiesinę antygenu.
5. Energicznie wytrząsać odczynniki lateksowe przez kilka sekund, aby otrzymać jednolitą zawiesinę.
Dodać po 1 kropli kaŜdego z odczynników lateksowych oddzielnie do sześciu kół na karcie reakcyjnej.
6. Nanieść po 1 kropli dobrze wymieszanego ekstraktu (lub kontroli dodatniej) do 6 oddzielnych kół obok
kropli odczynnika lateksowego.
7. Wymieszać zawartość kaŜdego koła uŜywając oddzielnych patyczków i rozprowadzić płyn pokrywając
całą powierzchnię koła. Nie uŜywać tego samego patyczka do mieszania zawartości więcej, niŜ jednego
koła.
8. Powoli i dokładnie kołysać i okręcać kartę reakcyjną w celu wymieszania odczynników przez
maksymalnie 1 minutę.
9. Sprawdzić, czy pojawiła się aglutynacja. Aglutynacja powinna być dobrze widoczna gołym okiem.
INTERPRETACJA WYNIKÓW
Kiedy po czasie 1 minuty cząsteczki lateksu aglutynują i powstają wyraźne grudki, wynik jest dodatni dla danej
zawiesiny. JeŜeli ekstrakt zawiera duŜą ilość antygenu, aglutynacja moŜe być bardzo szybka i dawać duŜe grudki.
Dla ekstraktów zawierających mniej antygenu, aglutynacja moŜe zachodzić później i dawać mniejsze grudki, ale
nie powinno być trudności z rozróŜnieniem reakcji dodatniej i ujemnej.
Kiedy cząsteczki lateksu zachowają swój oryginalny mleczny wygląd, bez znaczącej agregacji, wynik jest ujemny
dla tej zawiesiny. Ślady niewyraźnej agregacji powinny zostać zignorowane i uznane za wynik ujemny.
PRZEWIDYWANE WYNIKI
Kolonie z beta-hemolizą:
1. Aglutynacja z pojedynczym odczynnikiem lateksowym wskazuje na grupę, do której naleŜy badany
szczep.
Powinno się wziąć pod uwagę testy uzupełniające, w szczególności:
• dla szczepów z grupy D, wykonać testy biochemiczne w celu rozróŜnienia między
Enterococcus sp. i paciorkowcami z grupy D (te pierwsze są względnie oporne na antybiotyki).
• dla szczepów z grupy A, C lub G o małych koloniach naleŜy przeprowadzić testy biochemiczne,
aby potwierdzić identyfikację S. milleri/S. anginosus.
2. Aglutynacja więcej niŜ jednego odczynnika lateksowego wskazuje, Ŝe moŜe to być mieszany wzrost
szczepów z róŜnych grup lub obecność szczepu, który posiada antygeny z róŜnych grup (np. pewne
paciorkowce z grupy D, które posiadają równieŜ antygen grupowy G).
NaleŜy wziąć pod uwagę:
• Przesianie w celu otrzymania czystej izolacji i ponownego przeprowadzenia testu.
• Dla szczepów posiadających antygeny grupowe D i G, wykonać testy biochemiczne, aby
odróŜnić enterokoki od gatunków innych paciorkowców z grupy D (szczepy Enterococcus z obu
antygenami mogą być bardziej oporne na antybiotyki od posiadających tylko antygen D).
3. Aglutynacja zachodząca ze wszystkimi odczynnikami lateksowymi moŜe wskazywać na zbyt gęstą
zawiesinę w enzymie ekstrakcyjnym lub zanieczyszczenie badanego szczepu drobnoustrojem
powodującym niespecyficzną aglutynację cząsteczek lateksowych (łatwo to zwykle stwierdzić po
wyglądzie kolonii)
• zagotować pozostałą resztę ekstraktu przez 2 - 3 minuty, schłodzić i ponownie oznaczyć –
powinno to dać wyraźniejszy wynik.
• powtórzyć test uŜywając mniejszego inokulum w enzymie ekstrakcyjnym.
• przesiać w celu otrzymania czystego szczepu, który moŜna ponownie zbadać.
M47 MICROGEN®Strep
Strona 3
4. JeŜeli nie zachodzi Ŝadna znacząca aglutynacja z odczynnikami lateksowymi, to albo w badanej próbce
nie było antygenów paciorkowców z grupy A, B, C, D, F i G, albo były one w ilości poniŜej zakresu
czułości testu.
Powinno się podjąć następujące kroki:
• ponownie przeprowadzić test z gęstszym inokulum, szczególnie jeŜeli mogą to być paciorkowce
z grupy D lub F.
• jeŜeli jest to konieczne, moŜna zidentyfikować paciorkowce z beta-hemolizą przy pomocy
testów biochemicznych.
Kolonie bez beta-hemolizy:
Aglutynacja z pojedynczym odczynnikiem lateksowym wskazującym na grupę B lub D wskazuje na wiarygodną
identyfikację szczepu. JeŜeli w wyniku otrzymuje się grupę A, C, F lub G, metoda oznaczania moŜe być
nieodpowiednia i konieczne jest uŜycie innych metod identyfikacji.
Powinno się wziąć pod uwagę:
• jeŜeli w wyniku otrzymano grupę D, naleŜy rozróŜnić testami biochemicznymi między enterokokami
i paciorkowcami z grupy D (zob. wyŜej).
• jakiekolwiek inne kombinacje wyników powinny być interpretowane z uŜyciem dostarczonych powyŜej
informacji.
OGRANICZENIA TESTU
Wyniki powinno się interpretować w połączeniu z innymi dostępnymi informacjami klinicznymi
i laboratoryjnymi. Dokładne wyniki zaleŜą od uŜycia zawiesiny o odpowiedniej gęstości. Nie jest to ogólnie
problemem, jednak pewne szczepy naleŜące do grupy D posiadają niŜsze lub śladowe ilości antygenu grupowego,
a kolonie pewnych szczepów z grupy F trudno pobrać z powierzchni podłoŜa. JeŜeli chodzi o szczepy z grupy
D, moŜna zwiększyć produkcję antygenu grupowego hodując paciorkowce na agarze z dodatkiem 0,5 do 1,0%
glukozy. Dodatek ten moŜe zaciemniać obraz hemolizy, ale moŜna brać go pod uwagę w sytuacjach, kiedy waŜne
jest rozwiązanie problemów związanych z identyfikacją.
Wzrost szczepów dających małe kolonie moŜna poprawić przez inkubację w atmosferze wzbogaconej
w dwutlenek węgla.
Paciorkowce z grup Q, R i S mogą takŜe posiadać wykrywalne poziomy antygenu grupowego D.
Antygeny identyczne z antygenami grupowymi paciorkowców opisano u licznych niespokrewnionych gatunków.
Np. fałszywie dodatnie reakcje mogą zachodzić dla Escherichia, Klebsiella i Pseudomonas. MoŜna te kolonie łatwo
odróŜnić po wyglądzie na podłoŜu i nie powinno to powodować wątpliwości związanych z identyfikacja
paciorkowców.
CHARAKTERYSTYKA TESTU
®
Porównano zestaw MICROGEN Strep z handlowo dostępnym zestawem lateksowym wiodącej firmy jako
wzorcem pod względem grupowania paciorkowców, uŜywając próbki kliniczne z licznych niezaleŜnych miejsc.
Wyniki pokazano w Tabeli 1.
Tabela 1: porównanie MICROGEN®Strep z Lateksem Wzorcowym pod względem grupowania paciorkowców.
Lateks
wzorcowy
Czułość:
Wybiórczość:
+
–
MICROGEN®Strep
+
–
607
55
0
24
607/662 = 92%
24/24 = 100%
M47 MICROGEN®Strep
Strona 4
ODTWARZALNOŚĆ
Odtwarzalność dla tej samej serii oznaczono badając czułość dla kaŜdego z lateksów z jednej serii przy 10
okazjach, wykonanych przez trzy róŜne osoby, na seryjnych rozcieńczeniach antygenów wzorcowych. Miano
graniczne róŜniło się maksymalnie o jedno podwójne rozcieńczenie między oznaczeniami.
Odtwarzalność dla róŜnych serii oznaczono badając czułość i swoistość 10 serii produktu z seryjnymi
rozcieńczeniami antygenów wzorcowych. Między seriami zróŜnicowanie miana wynosiło maksymalnie jedno
podwójne rozcieńczenie antygenu, a jakościowe oznaczenia pokrywały się w 100%.
GRASO Biotech
Krąg 4A. 83-200 Starogard Gdański
Dział Obsługi Klienta: 058 562 30 21, 058 562 56 61 do 64 wew. 30,
[email protected]; www.podloza.pl, www.grasobiotech.pl
M47 MICROGEN®Strep
Strona 5