kolokwium II - materiały uzupełniające

Wypełniacze tkanek miękkich – materiały uzupełniające
HIALURONIAN - otrzymywanie
• z grzebieni kogucich, a czasem ze sznura pępowinowego,
• obecnie głównie na drodze mikrobiologicznej fermentacji
(fermentative HA lub Non-Animal-Source-Hyaluronian, NASH –
hialuronian pochodzący ze źródła niezwierzęcego) -> niższe koszty
produkcji, większa wydajność oczyszczania i brak potencjalnych
odzwierzęcych patogenów.
• syntezowany przez streptokoki grupy A i C -> ograniczone
zastosowanie przez obecność bakteryjnych endotoksyn w produkcie
fermentacji. Najczęściej wykorzystywane: Streptococcus equi
i S. zooepidemicus.
• Poszukiwanie drobnoustrojów posiadających status GRAS (Generally
Regarded As Safe) -> bakterie z rodzaju Bacillus sp., Lactococcus
lactis, Agrobacterium sp. i Escherichia coli, po wprowadzeniu do ich
genomu genu kodującego syntazę hialuronianu (Has A)
i dehydrogenazę UDP-glukozy (Has B).
ht t p://w w w.biotechnolog.pl/pods t aw y-t erapii-genow ej-t erapia-genow a
Hialuronian powstaje z kwasu UDP-glukuronowego
i UDP-N-acetyloglukozaminy w procesie katalizowanym
przez syntazę hialuronianu HasA (EC 2.4.1.212) należącą do
rodziny glikozylotransferaz.
Wytwarzanie hialuronianu wymaga obecności związków wykorzystywanych przy
wzroście komórki, a także konkuruje z glikolizą o dostępność węgla, dlatego też
spowolnienie wytwarzania biomasy i osłabienie procesu glikolizy zwiększa stężenie
i masę molową produkowanego kwasu hialuronowego.
Warunki bioprocesu
• pH: 7 – wzrost biomasy; 8,5 – produkcja HA,
• temperatura: 37oC – wzrost biomasy, 30oC – produkcja HA,
• podłoże wzrostowe i produkcyjne – CDM (ang. chemically defined medium),
• dodatek aminokwasów: arginina, lizyna,
• źródło węgla: skrobia ziemniaczana, glukoza,
• natlenienie procesu – zwiększenie ilości i masy molekularnej produkowanego HA.
ht t p://w w w.egr.ms u.edu/pel/s ervices .ht ml
TOKSYNA BOTULINOWA
• Produkowana przez Clostridium botulinum gatunek
mikroorganizmów wywołujących botulizm u ludzi
i zwierząt.
• Zdolność do produkcji toksyny wykazują także inne
gatunki np. Clostridium butyricum oraz Clostridium
baratii.
• Fenotypowo i genetycznie szczepy C. botulinum zostały
podzielone na cztery różne grupy (od I-IV) produkujące
BoNT oraz na siedem różnych typów taksonomicznych
w zależności od serotypu produkowanej neurotoksyny
(A-G),
• mikroorganizmy grupy I i II wywołują botulizm u ludzi,
• mikroorganizmy grupy III wywołują botulizm u zwierząt.
ht t p://pl.123rf.com/phot o_s t rukt ura-chemiczna-czas t eczki-t oks yny-bot ulinow ej.ht ml
Clostridium botulinum anaerobowe pałeczki formujące spory
• Grupa I - szczepy typu A, B i F oraz szczepy produkujące jednocześnie toksyny
dwóch typów AB, AF, czy BF.
 optymalna temperatura ich wzrostu: 35 – 40oC, wykazują zdolność fermentacji
glukozy, fruktozy i maltozy.
• Grupa II - szczepy typu E, B i F.
 optymalna temperatura wzrostu: 18 – 25oC, a nawet do 30oC, wykazują
zdolność do fermentacji glukozy, fruktozy, mannozy, maltozy, sacharozy oraz
trehalozy.
• Grupa III - szczepy typu C i D.
 rosną w temperaturze 40oC, fermentują glukozę, mannozę, fruktozę i maltozę.
• Grupa IV - szczepy produkują toksynę typu G.
 nie wykazują zdolności do rozkładu cukrów, rosną w temperaturze 37oC.
• Clostridium butyricum produkuje toksynę typu E,
 fermentuje glukozę, fruktozę, mannozę, maltozę, sacharozę oraz
trehalozę,
 rośnie w temperaturze 30 - 37oC.
• Clostridium baratii wytwarza toksynę typu F,
 fermentuje glukozę, fruktozę, mannozę, maltozę i sacharozę,
 rośnie w temperaturze 30 - 45oC.
• Szczepy Clostridium botulinum rosną w warunkach beztlenowych
w medium TPGY (pH 7,4),
• neurotoksyna typu A wytwarzana jest w medium produkcyjnym TPM
(pH 7,2),
• synteza toksyny w późnej fazie logarytmicznego wzrostu w formie
jednołańcuchowej, która zostaje enzymatycznie rozłożona do
formy aktywnej biologicznie (dwułańcuchowej).
Alternatywne metody badania aktywności i bezpieczeństwa składników kosmetyków –
materiały uzupełniające
Ustawodawstwo unijne (Dyrektywa 2003/15/WE; 7. Poprawka do Dyrektywy
Kosmetycznej 76/768/WE)
• od września 2004 roku
Zakaz testowania na zwierzętach gotowych produktów kosmetycznych.
Zakaz testowania na zwierzętach składników lub kombinacji składników –
jeśli odpowiednia metoda alternatywna została zwalidowana.
• od marca 2009 roku
Zakaz wykonywania testów na zwierzętach składników kosmetycznych
(wyjątek: toksyczność dawki powtarzanej, toksykokinetyka, wpływ na
rozrodczość).
• od marca 2013 roku
Całkowity zakaz wykonywania
zwierzętach.
testów substancji
chemicznych na
http://europa.eu/rapid/press-release_IP-13-210_pl.htm -
METODY ALTERNATYWNE
HODOWLE KOMÓRKOWE
 cytotoksyczność
• testy MTS, MTT oraz LDH
 fototoksyczność – fotouczulacze:
• linia mysich fibroblastów (Balb/c 3T3, klon A31)
• parametr PIF (Photo-Irritation-Factor)
-
PIF = 2-5 – potencjalne zdolności fotouczulające
PIF > 6 – fotouczulacze
 podrażnienia skóry – hodowle keratynocytów
• pomiar poziomu cytokin (IL-1α, IL-6, IL-8, TNF-α)
• Test ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay)
 genotoksyczność - działanie mutagenne, czy kancerogenne
• test Ames’a – szczepy Salmonella typhimurium
-pozytywny wynik – test MLA – zmodyfikowane komórki mysiej białaczki;
test mikrojąder – komórki jajnika chomika chińskiego (CHO-K1)
 podrażnienie i uszkodzenie rogówki oka
• hodowle komórkowe rogówki
• test ELISA
Określenie składników pochodzenia biotechnologicznego w kosmetykach:
 w przypadku związków pochodzenia biotechnologicznego, w których modyfikowane
mikroorganizmy lub potencjalnie toksyczne substancje nie zostały całkowicie usunięte,
dostępne dane muszą zawierać:
•
opis mikroorganizmu: organizm dawcy, organizm biorcy, modyfikowany organizm,
•
patogenność gospodarza,
•
toksyczność, określenie metabolitów i toksyn wytwarzanych przez mikroorganizmy,
•
los organizmów w środowisku: przeżycie, możliwość przeniesienia cech na naturalne
bakterie,
•
właściwości fizyczne i chemiczne,
•
jakość mikrobiologiczna,
•
dodatkowe zewnętrzne zanieczyszczenia,
•
konserwanty i inne dodatki.
Ocena bezpieczeństwa kosmetyków - Komisja Europejska oraz organ doradczy –
Komitet Naukowy ds. Bezpieczeństwa Konsumentów (Scientific Committee on
Consumer Safety – SCCS).
 poziom I – ocena bezpieczeństwa składników kosmetyków
•
•
bezpieczeństwo wszystkich składników, co do których istnieją wątpliwości;
bezpieczeństwo składników regulowanych przepisami prawa, w tym konserwantów,
barwników, filtrów UV i innych substancji, które są stosowane w ograniczonym zakresie.
 poziom II – ocena gotowego produktu kosmetycznego przez
wykwalifikowanego eksperta (safety assessora), przed wprowadzeniem
produktu do obrotu
•
ocena wpływu kosmetyku na bezpieczeństwo zdrowia ludzi przygotowywana jest w oparciu
o charakterystykę toksykologiczną i strukturę chemiczną składników oraz stopień kontaktu
tych substancji z ciałem człowieka, a także innych elementów, takich jak jakość
mikrobiologiczna produktu gotowego, wyniki badań dermatologicznych, badań stabilności
produktu.
Ocena bezpieczeństwa kosmetyków:
W ocenie bezpieczeństwa kosmetyku uwzględnia się:
sposób i miejsce aplikacji, czyli jak i na jaki obszar ciała kosmetyk będzie
•
stosowany,
•
grupę odbiorców, dla których produkt jest przeznaczony,
•
w sposób szczególny ocenia się kosmetyki do higieny intymnej oraz przeznaczone
dla dzieci poniżej trzeciego roku życia.
Zgodnie z prawem ocenę bezpieczeństwa obowiązkowo wykonuje się dla każdego
kosmetyku, który trafia na rynek.
Za zapewnienie tej oceny odpowiada osoba odpowiedzialna, ale wykonuje ją
specjalista – safety assessor.
Ocena bezpieczeństwa kosmetyków zgodnie z wytycznymi SCCP (Komitetu
Naukowego ds. Produktów Konsumenckich przy Komisji Europejskiej) powinna
zawierać dane dotyczące:
•
•
•
•
•
toksyczności ostrej,
własności żrących i drażniących (skórę i oczy),
własności uczulających skórę,
absorbcji przez skórę,
mutagenności/genotoksyczności.
Ponadto ocena bezpieczeństwa może obejmować dane dotyczące:
•
•
•
•
toksyczności przewlekłej,
fototoksyczności,
działania kancerogennego,
toksykokinetyki.
Ocena bezpieczeństwa kosmetyków:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ocena zgodności składu produktu z przepisami prawa.
Ocena toksykologiczna składników kosmetyku.
Ocena ekspozycji lub inaczej ocena narażenia.
Ocena ryzyka dla składników kosmetyku.
Ocena wyników badań gotowego kosmetyku.
Ocena przypadków niepożądanego działania.
Przygotowanie raportu z oceny bezpieczeństwa kosmetyku.