Dynamiczny NMR - BIOL

Wyznaczanie energii aktywacji inwersji pierścienia cykloheksanu
za pomocą dynamicznej spektroskopii NMR
Obraz widm NMR, licznych związków chemicznych, zarejestrowanych w różnych
temperaturach zmienia się. Jest to spowodowane przebiegiem szeregu procesów dynamicznych
zachodzących w badanych substancjach. Kompleks zagadnień związanych z tą podstawową
obserwacją określa się mianem dynamicznej spektroskopii NMR.
Aby łatwiej zrozumieć omawiane zagadnienia rozpatrzmy przykład DMF (N,N-dimetyloformamidu). W widmie protonowym zarejestrowanym w temperaturze
pokojowej występują dwa sygnały pochodzące od protonów dwóch
H٣C
O
nierównocennych grup metylowych. Natomiast w widmie
N C
zarejestrowanym w podwyższonej temperaturze (powyżej 120 °C)
H٣C
H
obserwujemy jeden sygnał pochodzący od protonów obydwu grup
metylowych.
Dzieje się tak, gdyż podana wyżej struktura nie w pełni opisuje budowę cząsteczki DMF.
Wskutek mezomerii wiązanie C-N ma
w znacznym stopniu charakter wiązania
H٣C
O
H٣C
O
podwójnego. Strukturze b odpowiada
N C
niższa energia i jej udział w hybrydzie
N C
mezomerycznej jest zdecydowanie
H٣C
H
H٣C
H
większy. Rotacja wokół wiązania N–
CO, która umożliwia
a
b
wewnątrzcząsteczkową wymianę grup
metylowych, jest w temperaturze pokojowej praktycznie zahamowana ze względu na znaczną
barierę energetyczną (88,0 kJ/mol). A zatem protony obydwu grup metylowych znajdują się w
różnym otoczeniu (są nierównocenne) i możemy zaobserwować dwa oddzielne sygnały w widmie.
W podwyższonej temperaturze sygnały te poszerzają się i w końcu zlewają powyżej temp.
120 °C w jedną linię. Powyżej tej temperatury nie ma już możliwości rozróżnienia grup
metylowych w pozycji cis i trans względem grupy karbonylowej. W podwyższonej temperaturze
rotacja wokół wiązania N–CO przebiega znacznie szybciej i w związku z tym czas przebywania
grupy metylowej w jednej z pozycji skraca się. Gdy czas ten ulegnie skróceniu poniżej wartości
granicznej, wyznaczonej przez zasadę nieoznaczoności Heisenberga, sygnały protonów grup
metylowych stają się nierozróżnialne.
Jedno ze sformułowań zasady nieoznaczoności Heisenberga brzmi: nie można zmierzyć
dowolnie małej różnicy energii w dowolnie krótkim czasie, Można to zapisać następująco:
∆Ε∗∆τ
h
2π
Podczas rejestracji widma NMR następuje absorpcja promieniowania elektromagnetycznego, które
niesie ze sobą odpowiednią energię ( E = h ٠ ν ; h - stała Planka, ν - częstotliwość). Gdy
zarejestrujemy sygnał na widmie NMR, to można powiedzieć, że zmierzyliśmy energię
promieniowania pochłoniętego przez pewną grupę protonów. Z kolei, jeśli zaobserwowaliśmy dwa
sygnały w widmie NMR, to znaczy, że zmierzyliśmy różnicę energii promieniowania pochłoniętego
przez dwie grupy protonów. Natomiast czas pomiaru w powyższym wzorze jest limitowany czasem
przebywania cząsteczki substancji, dla której rejestrujemy widmo NMR, w poszczególnej formie
strukturalnej.
W przypadku DMF w temperaturze pokojowej czas przebywania cząsteczki w jednej z form
strukturalnych jest stosunkowo długi i możemy zaobserwować dwa sygnały. W podwyższonej zaś
temperaturze czas ten ulega znacznemu skróceniu i sygnały obydwu grup metylowych stają się
nierozróżnialne.
W celu lepszego zrozumienia tego efektu można podać analogiczną zjawisko obserwowane
w fotografii. Robimy zdjęcie obracającej się kuli (w połowie białej i w połowie czarnej). Jeśli
obraca się ona powoli to na zdjęciach widać kolory biały i czarny. Jeśli zaś obraca się ona szybko,
to na zdjęciach kula jest szara. Ogólnie mówiąc, gdy jakiś obiekt zbyt szybko zmienia swoją formę,
to nie można w nim zauważyć szczegółów.
Wyżej omawiany efekt obserwuje się tylko w widmach NMR, gdyż energia promieniowania
używana w spektroskopii NMR jest znacznie mniejsza (kilka rzędów wielkości) w porównaniu z
innymi technikami spektroskopowymi. Dla przykładu, jeżeli w widmie NMR są dwa sygnały
różniące się częstotliwością 100 Hz (0,5 ppm; bardzo wyraźna różnica), to różnica energii
odpowiadająca tym sygnałom wynosi 4,2 · 10-7 J/mol. Jeśli zaś w widmie IR są dwa pasma różniące
liczbą falową 10 cm-1, to różnica energii odpowiadająca tym sygnałom wynosi 120 J/mol. Skoro
różnice energii mierzone spektroskopii NMR są tak małe, to czas pomiaru czyli czas przebywania
cząsteczek badanej substancji poszczególnej formie strukturalnej musi być odpowiednio długi, aby
możliwe było zarejestrowanie tak małej różnicy energii. Czas przebywania cząsteczek w
poszczególnej formie strukturalnej jest ściśle związany z kinetyką badanych procesów. Jeżeli jakiś
proces przebiega szybciej, to czas przebywania cząsteczek w poszczególnej formie strukturalnej
ulega skróceniu i odwrotnie ( jeżeli przebiega wolniej - ulega wydłużeniu).
Za pomocą dynamicznej spektroskopii NMR można badać procesy fizykochemiczne
odwracalne, szczególnie takie, w których nie zachodzą zmiany właściwości fizykochemicznych
substancji. Można badać takie procesy których stała szybkości jest w zakresie od 1/10 s-1 do 105 s-1,
co odpowiada energii aktywacji od 20 do 110 kJ/mol. Skoro nie zmieniają się właściwości badanej
substancji, to jedynym dowodem, że przebiegają jakiekolwiek procesy są zmiany w widmach
NMR rejestrowanych w różnych temperaturach. Najistotniejszą zmianą jest zmiana liczby
sygnałów ( w niższej temperaturze jest ich więcej niż w wyższej). Liczba sygnałów w widmie NMR
jest ściśle związana ze strukturą cząsteczek badanej substancji i skoro ona się zmienia musi to być
spowodowane przebiegiem jakiegoś procesu.
Korzystając z widm NMR zarejestrowanych w różnych temperaturach można wyliczyć
energię aktywacji badanego procesu. Energia aktywacji jest wielkością występująca w kinetyce
chemicznej i nie jest bezpośrednio mierzalna z widma NMR. Są jednak zależności wiążące dane
uzyskiwane z widma NMR ze stałą szybkości procesu np.:
k = π √[(Δν)2 – (Δν')2]/2
gdzie Δν - maksymalna różnica przesunięć chemicznych obydwu sygnałów
Δν' - różnica zmierzona z widma
Z kolei energię aktywacji można obliczyć korzystając z równania Arrheniusa:
ln k = – Ea/RT + ln A
Podstawowe typy procesów fizykochemicznych odwracalnych, które można badać za
pomocą dynamicznej spektroskopii NMR:
I. Zahamowanie rotacji wewnętrznej
a) występowanie wiązania o częściowym charakterze wiązania podwójnego W cząsteczkach o
ogólnej strukturze, gdzie D oznacza donora elektronów (atom azotu, pierścień aromatyczny) i
A oznacza akceptora elektronów (atom tlenu, siarki), obserwuje się zahamowanie rotacji
wokół wiązania D – C lub D – N, gdyż staje się
A
częściowo wiązaniem podwójnym. W
A ono
związkach
takich jak amidy, tioamidy,
D C
D N
karbaminiany, protonowane ketony, aldehyd
benzoesowy i furylowy oraz ich pochodne,
nitrozoaminy i azotyny często obserwuje się efekty podobne jak w przypadku DMF.
b) zawada przestrzenna
Rotacja wokół wiązania C – C w etanie nie jest zupełnie swobodna. Rozpatrując konformację
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
a
b
a'
naprzemianległą (a) trzeba przy obrocie wokół wiązania C – C pokonać pewną barierę
energetyczną, zanim dojdzie się do identycznej konformacji (a'). Stanem przejściowym jest
konformacja naprzeciwległa (b). Bariera energetyczna wynosi 12,5 kJ/mol, czyli jest dość niska i
jakikolwiek efekty w widmach NMR można obserwować w bardzo niskich temperaturach. W
bardzo wielu przypadkach rotacja grupy tert-butylowej jest zahamowana tak dalece, że w niskich
temperaturach grupy metylowe stają się nierównocenne. Tak jest np. w tert-butylocykloalkanach, w
których widmach sygnał grupy tert-butylowej rozpada się na dwa sygnały w proporcji
intensywności 2:1. odpowiada to konformacji naprzemianległej, w której dwie grupy metylowe są
równocenne.
II. Tautomeria walencyjna
Dynamiczna spektroskopia NMR jest szczególnie przydatna do badań szybkiej i odwracalnej
tautomerii walencyjnej. Pierwszym zaobserwowanym tego typu procesem była tautomeria
3,4-homotropylidenu:
2
1
3
C
C7
8
4
6
5
Jest to zdegenerowane przegrupowanie Cope'a, w którym przesuwanie się wiązań podwójnych
powoduje otwarcie pierścienia cyklopropanowego między C-3 i C-4 i ponowne zamknięcie między
C-1 i C-6 (przesunięcie 3,3-sigmatropowe). Ponieważ substrat i produkt są identyczne, ten rodzaj
przegrupowania określa się mianem reakcji identyczności lub reakcji "niewidzialnej". Dzięki
spektroskopii NMR procesy tego rodzaju są wykrywalne eksperymentalnie, ponieważ pozwala ona
zidentyfikować otoczenie poszczególnych jąder w cząsteczce i śledzić możliwe zmiany tego
otoczenia np. atom C-7 zmienia swoja pozycję z allilowej na "cyklopropylową" W temperaturze
pokojowej zmiana pozycji jest bardzo szybka i stąd homotropyliden nazywany jest cząsteczką o
fluktuujacej strukturze. Widmo "unieruchomionej" cząsteczki można obserwować w temperaturze
poniżej -30 ºC.
III. Inwersja konfiguracji
Innym zjawiskiem zbadanym dokładniej za pomocą dynamicznej spektroskopii NMR jest
inwersja konfiguracji wokół atomu azotu. Zaobserwowano ją pierwotnie w przypadku amoniaku:
H
H
H
H
N
H
N
H
Podobne zjawisko występuje w aminach. Jeśli jest to amina drugorzędowa z różnymi
podstawnikami, to atom azotu staje się centrum stereogenicznym. A zatem protony przy
sąsiadującym atomie węgla powinny być diastereotopowe czyli nierównocenne.
R
N
H C
R
R'
H
H
H
H
C
N
R'
H
Jednakże z powodu szybkiej inwersji konfiguracji w temperaturze pokojowej sygnały te są
nierozróżnialne. Aby zarejestrować dwa oddzielne sygnały nie jest konieczne obniżanie
temperatury lecz wystarczy obniżyć pH badanej próbki, gdyż protonowanie wolnej pary
elektronowej azotu równie efektywnie hamuje proces inwersji.
IV. Inwersja pierścienia
Inwersja pierścienia cykloheksanu jest typowym przykładem przemian konformacyjnych
nasyconych układów pierścieniowych. W cząsteczce cykloheksanu są dwie grupy nierównocennych
protonów: aksjalne i ekwatorialne. Jednakże w temperaturze pokojowej widmo NMR cykloheksanu
zawiera tylko jeden sygnał. Spowodowane jest to szybką inwersją pierścienia:
Dzięki spektroskopii NMR możliwe było wyznaczenie dokładnej wartości energii aktywacji tego
procesu.