Zapisz jako PDF

Ultrawirowanie analityczne należy do grupy technik umożliwiających badanie zachowania się
makrocząsteczek w roztworze. Podczas ultrawirowania analitycznego biomolekuły są
charakteryzowane w stanie natywnym w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, bez
zaburzających oddziaływań ze złożami.
Spis treści
1 Zjawisko sedymentacji
2 Historia
3 Podstawy fizyczne ultrawirowania analitycznego
3.1 Wyznaczanie masy cząsteczkowej
3.1.1 Uwaga:
3.1.2 Równanie Svedberga
3.1.3 Jak wyznaczamy stałą sedymentacji i masę cząsteczkową substancji
rozpuszczonej?
4 Wirówki i ultrawirówki
5 Systemy detekcji
5.1 System detekcji oparty na interferencji Rayleigha
5.2 System detekcji absorpcyjnej
6 Eksperymenty ultrawirowania analitycznego
6.1 Wymagania
6.2 Typy eksperymentów
6.2.1 Eksperyment prędkości sedymentacji
6.2.2 Eksperyment równowagi sedymentacyjnej
6.3 Zalety pomiarów techniką ultrawirowania analitycznego
6.4 Analiza danych uzyskanych podczas wirowania
6.5 Czym się kierować analizując dane?
Zjawisko sedymentacji
W trakcie ultrawirowania biomolekuł zachowują się podobnie jak cząsteczki zawiesin
makroskopowych w procesie sedymentacji, czyli osiadania w polu grawitacyjnym wywołanego
różnicą gęstości fazy rozproszonej i ośrodka dyspersyjnego.
Proces sedymentacji zawiesin makroskopowych w polu grawitacyjnym wygląda następująco:
bezpośrednio po zakończeniu mieszania stężenie zawiesiny jest jednakowe w każdym naczyniu,
na skutek opadania cząstek zawiesiny górna część płynu nie zawiera zawiesiny, a na dnie
pojawia się osad,
w miarę upływu czasu granica ta przesuwa się ku dołowi, rośnie również grubość osadu na
dnie,
proces osiadania cząstek można przyspieszyć poprzez wirowanie.
Na szybkość sedymentacji ma wpływ:
różnica gęstości pomiędzy cząstkami zawiesiny a cieczą,
lepkość płynu decydująca o tarciu pomiędzy cząstkami zawiesiny a płynem.
W przypadku zawiesiny makrocząsteczek biologicznych w polu grawitacyjnym nie obserwujemy
zjawiska sedymentacji. Dopiero gdy poddamy próbkę działaniu sił odśrodkowych setki lub tysiące
razy większych niż siła grawitacyjna przeciwdziałających siłom wyporu, dyfuzji i flotacji, ulegają one
osadzaniu.
Historia
W 1877 roku szwedzki inżynier, Gustaf Carl de Laval wynalazł ręczną wirówkę do uzyskiwania
śmietany z mleka i następnie opatentował wynalazek.
W 1908 roku Perrin odkrył zjawisko równowagi sedymentacyjnej w roztworach cząstek gumiguty,
rozdzielanych wg rozmiarów poprzez uważne wirowanie, a w 1909 roku opublikował pracę o
wyznaczeniu liczby Avogadro metodą pomiarów dyfuzji mikrocząstek. W 1926 roku otrzymał
Nagrodę Nobla "for his work on the discontinuous structure of matter, and especially for his
discovery of sedimentation equilibrium".
Ultrawirówka zbudowana przez Theodora Svedberga (lata 1920-ste) okazała się jednym z najbardziej
owocnych, odpowiednich urządzeń do badań makromolekuł. Svedberg udowodnił, że białka składają
się z dużej liczby atomów połączonych wiązaniami kowalencyjnymi i w 1926 roku otrzymał Nagrodę
Nobla w zakresie chemii za prace nad układami rozproszonymi.
W 1923 roku pojawiła się pierwsza wirówka z optycznym systemem detekcji.
W 1926 roku wykonano pierwszy pomiar masy cząsteczkowej hemoglobiny i ovalbuminy metodą
równowagi sedymentacyjnej.
W 1929 roku Ole Lamm podał równanie opisujące przesuwanie się granicy w polu siły odśrodkowej.
W latach 30-tych XX wieku skonstruowano system optyczny umożliwiający obserwacje gradientu
stężenia w funkcji odległości w kuwecie pomiarowej i powiązano parametry wirowania z kształtem i
uwodnieniem makrocząsteczek. Od lat 40-tych do końca 60-ych udoskonalano urządzenie, lata 70-te
nazwano „złotymi latami” tej techniki pomiarowej.
Z kolei w latach 80-tych ultrawirowanie zaczęło traci popularność ze względu na zastosowanie
elektroforezy i chromatografii żelowej wymagających mniejszych ilości materiału, oraz trudną
analizę danych na wolno pracujących komputerach.
W latach 90-tych wprowadzono nowy model ultrawirówki, zautomatyzowano sposób zbierania
danych i ich analizy. Zainstalowano dwa systemy detekcji (rozpraszanie i absorpcja) w jednej
wirówce.
Od 2000 roku ultrawirowanie analityczne przeżywa renesans. Stosuje się je w przypadku różnych
badań (czystość próbki, masa, kształt, oddziaływanie z innymi makromolekułami) dla obiektów o
szerokim zakresie mas cząsteczkowych (od kilkuset do dziesiątek milionów).
Podstawy fizyczne ultrawirowania analitycznego
Podczas wirowania z prędkością kątową ω na cząsteczkę o masie m działają następujące siły:
1. siła odśrodkowa
gdzie: r – odległość od osi obrotu, a- przyspieszenie odśrodkowe, V – objętość cząsteczki, ρ –
gęstość cząsteczki.
2. tarcie dynamiczne
gdzie: f – współczynnik tarcia, zależny od właściwości cząsteczki oraz lepkości roztworu
3. siła wyporu
gdzie:
— gęstość cieczy.
Warunek równowagi: cząsteczka porusza się ruchem jednostajnym jeśli siła tarcia i siła wyporu
równoważą siłę odśrodkową
czyli:
Definiujemy stałą sedymentacji S jako
Stała sedymentacji wielkością charakteryzującą ruch cząsteczki w rozpuszczalniku równą
prędkości sedymentacji na jednostkę przyspieszenia odśrodkowego. Jednostką stałej
sedymentacji jest
Dalej otrzymujemy:
.
gdzie: M — masa cząsteczkowa makrocząsteczki,
cząsteczki jest równa
.
Szybkość ruchu cząsteczki opisuje zależność:
— liczba Avogadro, a masa pojedynczej
Wyznaczanie masy cząsteczkowej
Korzystając z zależności:
oraz ze wzoru Einsteina na współczynnik dyfuzji:
gdzie: R — stała gazowa, T — temperatura [K], otrzymujemy:
.
Uwaga:
Często, definiując cząstkową objętość właściwą cząsteczki jako:
, w powyższych równaniach
zastępujemy
przez
.
odpowiada zwiększeniu objętości w wyniku dodania 1 grama
makromolekuł do wody (białka
, zdenaturowane DNA
).
Równanie Svedberga
,
M zależy od:
właściwości fizycznych cząsteczki: S, ,
warunków eksperymentalnych: D, T, ρ,
stałej fizycznej: R.
Stąd można bezpośredniego wyznaczyć masę M w przeciwieństwie do innych metod
doświadczalnych takich jak elektroforeza i chromatografia, które bazują na porównaniu masy
cząsteczki z wzorcem (cząsteczkami o znanych masach).
Jak wyznaczamy stałą sedymentacji i masę cząsteczkową substancji rozpuszczonej?
1. Korzystając z definicji stałej sedymentacji, po rozdzieleniu zmiennych i obustronnym
scałkowaniu otrzymujemyzależność:
gdzie r — położenie środka granicy pomiędzy roztworem klarownym i zawiesiną,
zależy
liniowo od czasu ze współczynnikiem nachylenia równym
.
2. Korzystając z równania Lamma
Strumień przez powierzchnię wycinka cylindra zawartego we wnętrzu naczynka wirówki
opisuje równanie:
Równanie Lamma, wyprowadzone w 1929 roku, opisuje rozkłady stężenia uzyskiwane w czasie
wirowania:
Rozwiązywanie równania Lamma — metoda pochodnej czasowej (program DCDT+ dostępny w
sieci) pozwala na wyznaczenie pochodnych czasowych rozkładów stężenia na podstawie
radialnych dystrybucji otrzymanych w eksperymencie.
Następnie, po przeskalowaniu równania i uniezależnienia od czasu otrzymujemy rozkład
mówiący o populacji cząsteczek o danym współczynniku sedymentacji.
3. Metoda równowagi sedymentacyjnej
Stan równowagi sedymentacyjnej występuje przy niewielkiej liczbie obrotów (zwykle poniżej
20 000 obr/min). W stanie równowagi sedymentacyjnej substancja rozpuszczona wypełnia całą
kuwetę, a jej stężenie wzrasta od menisku do dna kuwety. Z warunków równowagi
termodynamicznej można wyprowadzić wzór na masę cząsteczkową substancji rozpuszczonej:
gdzie: i stężenia makrocząsteczki w odległości i od osi obrotu w stanie równowagi
sedymentacyjnej, uzyskiwanej zwykle po kilkudziesięciu godzinach wirowania.
4. Metoda Archibalda
Niezależnie od stanu osiągnięcia równowagi sedymentacyjnej powierzchnia menisku (a) i dno
kuwety (b) to dwa przekroje, przez które nie przemieszczają się sedymentujące cząsteczki.
Czyli:
stąd masa cząsteczkowa biopolimeru odpowiednio przy menisku i przy dnie kuwety:
dla mieszaniny polimerów
.
Wirówki i ultrawirówki
Wirówki można podzielić ze względu na
uzyskiwaną liczbę obrotów:
niskoobrotowe — do 5 000 obr/min,
średnioobrotowe — do 20 000 obr/min,
ultrawirówki — powyżej 20 000 obr/min.
Przeznaczenie:
analityczne,
preparatywne,
specjalnego przeznaczenia.
Wirówki i ultrawirówki wyposażone są w układy termostatujące umożliwiające kontrolę temperatury
z dokładnością do 0,1 stopnia. W ultrawirówkach i wirówkach średnioobrotowych rotor jest
umieszczony w komorze próżniowej, aby wyeliminować jego nagrzewanie się. Jeżeli wirowanie
odbywa się w próżni próbki muszą być hermetycznie zamknięte. Wirowanie w ultrawirówkach może
odbywać się z prędkością 60000 rpm, co odpowiada przyspieszeniu równemu 290 000 g.
Typy rotorów:
rotor horyzontalny,
rotor analityczny,
rotor kątowy.
Mieszaninę poddawaną wirowaniu umieszcza się w odpowiednich pojemnikach. W przypadku
wirówek są to kubki wirownicze, a w przypadku ultrawirówek specjalne kuwety analityczne,
wytrzymujące wysokie przeciążenia, skręcane przed pomiarami.
Kuweta analityczna składa się z metalowego korpusu oraz rdzenia z tworzywa ze zbiorniczkiem
sektorowym zamkniętym z dwóch stron przez okienka kwarcowe. W połowie wysokości kuwety
znajduje się otwór do jej napełniania. Istnieje kilka podstawowych typów kuwet analitycznych, np.:
kuweta jedno- dwu- lub sześciosektorowa. Przykładowo kuweta dwusektorowa złożona jest z dwóch
zbiorniczków, z których jeden jest napełniany badanym roztworem, a drugi rozpuszczalnikiem. Taka
kuweta pozwala rejestrować sedymentację badanego roztworu na tle rozpuszczalnika.
Systemy detekcji
1. System interferencyjny.
2. System detekcji absorpcyjnej.
System detekcji oparty na interferencji Rayleigha
a. Monochromatyczne światło przechodząc przez dwie równoległe szczeliny dwusektorowej
kuwety zawierającej odpowiednio próbkę i bufor odniesienia ulega interferencji dając w
wyniku ciemne i jasne prążki.
b. Jeśli gęstość próbki jest większa niż buforu odniesienia fala przechodząca przez próbkę jest
opóźniona względem fali przechodzącej przez bufor odniesienia.
c. Prążki przesuwają się prostopadle proporcjonalnie do różnicy stężeń pomiędzy próbką a
buforem odniesienia.
System detekcji oparty o interferencję Rayleigha umożliwia:
a.
b.
c.
d.
e.
Pomiar stężenia próbki na podstawie zmian współczynnika odbicia.
Nieselektywny, pomiar całości materiału we wiązce.
Analizę makrocząsteczek nie zawierających chromoforów (np. polisacharydy, węglowodory).
Analizę próbek, które zawierają silnie absorbujące składniki buforu (np. ATP / GTP, DTTutleniony).
Jest to dobry system optyczny w przypadku bardzo stężonych próbek t.j. 100 mg/ml i dużych
kompleksów.
System detekcji absorpcyjnej
a. Wykorzystuje zjawisko absorpcji promieniowania o określonej długości fali przez cząsteczki
posiadające właściwości absorpcyjne.
b. Lampa ksenonowa o zakresie 190 – 800 nm błyska z częstotliwością zgodna z prędkością
obrotu rotora.
c. Zmienna intensywność świecenia lampy jest normalizowana poprzez próbkowanie niewielkiej
części światła padającego na detektor.
d. Istnieje możliwość przeskanowania pełnego widma absorpcyjnego próbki dla ustalonego
położenia radialnego.
System detekcji absorpcyjnej
a. Jest dobrym wyborem dla cząsteczek zawierających chromofory np. dla białek, DNA,
etykietowanych i innych.
b. Czułość od ok. 1 µg/ml.
c. System selektywny - wybór długości fali obserwacji.
d. Dla próbek złożonych możliwość monitorowania kilku składników dzięki obserwacjom
absorpcji dla różnych długości fali w tym samym eksperymencie.
Obydwa systemy detekcji umożliwiają wyznaczenie
, czyli stężenia w funkcji promienia.
Eksperymenty ultrawirowania analitycznego
Wymagania
Próbka w roztworze.
Masa molekularna od setek do kilku milionów daltonów.
Około 20 µl-300 µl objętości próbki.
Stężenie próbki w zakresie od 1µg/ml do 50 mg/ml.
Typy eksperymentów
(prędkości sedymentacji i równowagi sedymentacyjnej)
Eksperyment prędkości sedymentacji
Umożliwia wyznaczenie:
Heterogeniczności próbki.
Kształtu i wielkości cząsteczek lub kompleksów molekularnych oraz ich zmian.
Współczynnika sedymentacji.
Współczynnika dyfuzji.
Współczynnika tarcia.
Masy cząsteczkowej.
Stabilności próbki.
Eksperyment prędkości sedymentacji prowadzi się przy dużych szybkościach rotacji, co prowadzi do
przemieszczania się (sedymentacji) cząsteczek substancji rozpuszczonej w dół komórki pomiarowej i
wytworzenia gradientu stężenia w kierunku radialnym, zwanego granicą (boundary).
Ponieważ istnienie granicy jest związane z gradientem stężenia to również i granica sedymentuje z
upływem czasu. Z uwagi na wzrastające stężenie substancji poniżej granicy, “siły” dyfuzji działają
coraz efektywniej prowadząc do rozmywania się granicy (kolejne rejestrowane profile są bardziej
pochyłe).
Eksperyment równowagi sedymentacyjnej
Pozwala na wyznaczenie:
Masy molekularnej, masy składników słabo oddziałujących kompleksów, masy podjednostek.
Stechiometrii w roztworze.
Stałej asocjacji.
Heterogeniczności próbki.
W eksperymencie równowagi sedymentacyjnej szybkość wirowania jest tak mała, że procesy dyfuzji
skutecznie przeciwstawiają się procesom sedymentacji i ustala się równowagowy rozkład stężenia
molekuł w komórce pomiarowej.
Zalety pomiarów techniką ultrawirowania analitycznego
Zastosowanie do wszystkich nano i mikrocząsteczek.
Brak oddziaływań z matrycami — brak artefaktów.
Technika nie wymaga standardów.
Heterogeniczne układy są dobrze rozseparowywane.
Analiza danych uzyskanych podczas wirowania
Program [http:/www.analyticalultracentrifugation.com/download.htm SEDFIT] Kroki:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Wprowadzić dane.
Ustawić położenie menisku i dna kuwety.
Wybrać model właściwy dla analizy danych.
Wybrać parametry wstępne (najlepiej na podstawie informacji, które dotyczą białka, a są
uzyskane innymi metodami, np. dla białka globularnego współczynnik tarcia = 1.2).
Wykonać obliczenia.
Przyjrzeć się krytycznie wynikom analizy i na tej podstawie dokonać modyfikacji (np. usunąć
ostatnie krzywe).
Uwzględnić poprawki związane z szumem, udokładnić objętość cząstkową, gęstość i lepkość
buforu.
Można powtórzyć p. 6 i 7.
Zanotować wyniki.
Czym się kierować analizując dane?
1. Zgromadzić dostępną wiedzę na temat obiektu.
2. Wykonać kilka niezależnych eksperymentów (np. dla tych samych stężeń biomolekuł,lub dla
różnych znanych stężeń biomolekuł).
3. Wykonać eksperymenty różnymi metodami.
4. Analizować jakość fitu.
5. Dyskutować wyniki z osobami doświadczonymi (jeśli są takie).
6. Kierować się zdrowym rozsądkiem.
Metody ultrawirowania analitycznego znajdują zastosowanie w przemyśle, np. podczas badania
jakości i agregacji białek o znaczeniu terapeutycznym.
Różnica pomiędzy białkami a lekami niskocząsteczkowymi jest związana z tym, że aktywność białek
stosowanych jako leki silnie zależy od ich konformacji cząsteczkowej.
Analizy za pomocą spektrometrii mas, czy krystalografii nie mówią czy białko jest w odpowiedniej,
natywnej konformacji w roztworze, czy dimeryzuje (dimeryzacja może być pożądana lub
przeszkadzać).
Ultrawirowanie umożliwia określenie czy białko jest aktywne biologicznie, czy w próbce są obecne
agregaty i czy stabilna konformacja makromolekuł jest utrzymywana w zmiennych warunkach pH,
temperatury i składu buforu.