pobierz plik - Wydział Biologii UW

Oskar Siemianowski Zakład Anatomii i Cytologii Roślin Instytut Biologii Eksperymentalnej i Biotechnologii Roślin, Wydział Biologii UW Autoreferat rozprawy doktorskiej pod tytułem: Mechanizmy zmiany pobierania, dystrybucji i tolerancji na cynk i kadm w wyniku ekspresji AtHMA4 w tytoniu Promotor: prof. dr hab. Danuta Maria Antosiewicz Promotor Pomocniczy: dr Anna Barabasz AtHMA4 z A. thaliana koduje białko z rodziny P1B-­‐ATPaz. Białko to zlokalizowane w plazmolemie odpowiedzialne jest za usuwanie jonów Zn i Cd z cytoplazmy do apoplastu. AtHMA4 jest obecne w korzeniach w miękiszu ksylemowym, gdzie poprzez załadunek naczyń, bierze udział w kontroli translokacji obu metali z korzenia do pędu. Założono, że heterologiczna ekspresja AtHMA4 w wybranych gatunkach roślin może przyczynić się do zwiększenia poziomu translokacji Zn i Cd z korzenia do pędu i w efekcie doprowadzić do wzrostu akumulacji tych metali w częściach nadziemnych. Taka modyfikacja mogłaby zostać wykorzystana w biotechnologii, do usuwania metali z gleby (fitoremediacja Cd i Zn) lub wzbogacania w mikroelementy (biofortyfikacja Zn) nadziemnych części jadalnych roślin. W związku z powyższym celem badań w ramach niniejszej pracy doktorskiej była ocena przydatności genu AtHMA4 (AtHMA4-­‐F) i jego wariantów (AtHMA4-­‐T -­‐ bez końca C oraz AtHMA4-­‐C -­‐ koniec C bez domen transbłonowych) dla modyfikacji genetycznych roślin prowadzących do zmiany dystrybucji Zn i Cd pomiędzy korzeniem i pędem dla potrzeb fitoremediacji. Zastosowane podejście doświadczalne zostało oparte o porównawczą analizę tytoniu (Nicotiana tabacum) typu dzikiego i po transformacji badanymi genami (eksprymowanymi pod konstytutywnym promotorem CaMV 35S), pod względem pobierania i akumulacji Zn i Cd, dystrybucji komórkowej i tkankowej tych metali, a także zmiany wzoru ekspresji genów endogennych w tytoniu z ekspresją AtHMA4. W pierwszym etapie badań, przy wykorzystaniu ekspresji białka fuzyjnego 35S:AtHMA4-­‐
F::GFP potwierdzono, że białko AtHMA4-­‐F lokalizuje się w transgenicznym tytoniu w błonie komórkowej. Zatem AtHMA4-­‐F, tak jak u rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana), może przenosić Zn do apoplastu w komórkach tytoniu. W następnym etapie badań przeprowadzono analizę poziomu akumulacji, translokacji korzeń/pęd oraz tolerancji roślin z ekspresją AtHMA4-­‐F, hodowanych przy różnych stężeniach Zn (0,5 -­‐ 200 μM) i Cd (0,25 i 5 μM). W ramach tego etapu wykazano, iż w wyniku ekspresji AtHMA4 w tytoniu zachodzi zmiana nie tylko dystrybucji Zn i Cd pomiędzy korzeniem a pędem, ale także pobierania obu metali (od hamowania do stymulacji), przy czym rodzaj modyfikacji był zależny od ich stężenia w pożywce. Jest to zaskakujące gdyż AtHMA4-­‐F nie bierze udziału w pobieraniu metali. Wyniki wskazywały, iż wprowadzenie białka AtHMA4 do tytoniu prowadzi do zaburzenia homeostazy metali, co skutkuje indukcją procesów regulacji endogennych mechanizmów odpowiadających za pobieranie Zn i Cd. W oparciu o otrzymane wyniki wysunięto hipotezę, iż jednym z możliwych powodów zaburzenia homeostazy metali w tytoniu z ektopową ekspresją AtHMA4-­‐F jest wynikająca z aktywności kodowanego przez transgen białka (eksportującego Zn/Cd poza komórkę) zmiana dystrybucji Zn/Cd pomiędzy symplastem a apoplastem w komórkach wszystkich tkanek badanych roślin. W celu weryfikacji postawionej hipotezy określono dystrybucję Zn w komórkach i tkankach: a) poprzez analizę stężenia Zn w symplaście (w izolowanych protoplastach) i w apoplaście (metodą infiltracji i wirowania); b) poprzez analizę stężenia Zn w symplaście (w protoplastach) z zastosowaniem indykacyjnego dla Zn barwnika fluorescencyjnego -­‐ Zinpyr-­‐1; c) poprzez analizę lokalizacji Zn w tkankach na przekrojach poprzecznych korzeni i liści. Wyniki przeprowadzonych badań pokazały, iż rzeczywiście u transformantów stężenie Zn/Cd w apoplaście jest wyższe, zaś w symplaście niższe w stosunku do typu dzikiego, zmieniona jest także lokalizacja Zn na poziomie tkankowym. W dalszych badaniach wykazano, że obserwowane zmiany w dystrybucji/lokalizacji Zn na poziomie komórkowym/tkankowym przyczyniają się do powstania na liściach transformantów objawów toksyczności Zn – nekroz, co wskazuje, że w wyniku ekspresji AtHMA4 następuje obniżenie poziomu tolerancji na ten metal. Otrzymane wyniki skłaniają jednak do zmiany paradygmatu myślenia o nekrozach, wskazując, że za ich powstawaniem kryje się specyficzny mechanizm tolerancji, który polega na ochronie przed nadmiarem Zn całej blaszki liściowej. Mechanizm ten polega na załadunku wysokich ilości metalu jedynie do grup komórek, które pod wpływem toksyczności dużych stężeń Zn, zamierając tworzą nekrozy, jednocześnie chroniąc pozostałe komórki w blaszce liściowej. Podwyższony poziom Zn w apoplaście wydaje się być związany z inicjacją tego procesu. Analizując pobieranie metali w roślinach tytoniu hodowanych w obecności Cd wykazano, iż ekspresja AtHMA4 prowadzi do zahamowania pobierania Cd. W związku z tym, celem kolejnego etapu pracy była identyfikacja mechanizmów odpowiedzialnych za obniżenie akumulacji Cd w transformantach. W oparciu o analizę z użyciem mikromacierzy DNA udało się ustalić, iż ekspresja transgenu ingeruje w metabolizm roślin transformowanych zmieniając wzór ekspresji genów odpowiedzialnych za regulację homoeostazy metali (NtIRT1, NtNAS1, HMA3, MTP1a), brak jednak było obniżenia poziomu transkrytpu potencjalnych transporterów Cd. Wzrosła natomiast ekspresja genów istotnych w szlaku biosyntezy lignin. Na tej podstawie oraz wykorzystując badania histologiczne ustalono, że za obniżenie pobierania/akumulacji Cd w tytoniu z ekspresją AtHMA4 odpowiada wzrost lignifikacji ściany komórkowej pomiędzy epidermą a korą pierwotną korzenia. Dodatkową przesłanką wskazującą, że u roślin z ekspresją AtHMA4-­‐F powstaje „mechaniczna” bariera w formie zlignifikowanej ściany komórkowej pomiędzy epidermą a korą pierwotną, była analiza profilu jonowego korzeni i pędów transformantów, u których w porównaniu do roślin typu dzikiego, wykazano ograniczenie pobierania nie tylko Cd, ale także Zn, Ni, Mo, Cu, Co, B i Fe. Badania w tej części pracy doktorskiej wykazały, że wprowadzenie genu do rośliny jest tylko pierwszym etapem generowania zmian w transformancie, prowadzących do modyfikacji procesów molekularnych, a w efekcie metabolicznych, niezwiązanych z funkcją fizjologiczną, jaką pełni kodowane przez transgen białko. Dla przypomnienia, aktywność AtHMA4 w Arabidopsis warunkuje translokację Zn/Cd do pędu, podczas gdy ekspresja AtHMA4 w tytoniu prowadzi do opisanych wyżej bardzo zróżnicowanych zmian w pobieraniu metali lub ich tolerancji. W ramach pracy doktorskiej wykonano także badania modyfikacji stężeń Zn i Cd w korzeniach i pędach tytoniu z ekspresją AtHMA4-­‐T (kodującego białko bez C-­‐końca) oraz AtHMA4-­‐C (kodującego cytoplazmatyczny C-­‐koniec). Przeprowadzone badania wykazały, że pobieranie, translokacja i tolerancja na Zn i Cd u roślin z ekspresją AtHMA4-­‐T w niewielkim stopniu różniły się od typu dzikiego. Jak opisano powyżej, zmiany pobierania, translokacji i tolerancji na Zn i Cd obserwowano u roślin z ekspresją pełnej kopii AtHMA4-­‐F, ich brak u tytoniu z ekspresją AtHMA4-­‐T wskazuje, że obecność końca C białka AtHMA4 ma kluczowe znaczenie dla jego aktywności. U roślin z ekspresją AtHMA4-­‐C obserwowano wyższy w stosunku do typu dzikiego poziom akumulacji Zn i Cd oraz zwiększoną translokację tych pierwiastków do pędu. Przeprowadzone analizy wykazały, że białko fuzyjne 35S:AtHMA4-­‐C::GFP w tytoniu zlokalizowane jest w cytoplazmie. Koniec C białka AtHMA4 zawiera 11 końcowych histydyn oraz 13 par cystein, natomiast oba aminokwasy mają grupy tiolowe, silnie wiążące Zn i Cd. Wysunięto więc hipotezę, że wzrost akumulacji i translokacji Zn u transformantów AtHMA4-­‐C, może być następstwem wiązania Zn i zaburzenia jego homeostazy komórkowej. Wyniki badań roślin z ekspresją AtHMA4-­‐C wskazały na możliwość wykorzystania ekspresji tego genu w roślinach dla potrzeb fitoremediacji, jednak potrzebne są dalsze badania. Należy podkreślić, że wykonana praca doktorska wskazała wiele nowych aspektów wynikających z ekspresji transgenu (kodującego białko eksportujące Zn do apoplastu) w roślinie, wpisując się w istniejące zapotrzebowanie na badania mające na celu określenie nie tylko skutków transformacji, ale także mechanizmów, które odpowiadają za generowanie fenotypu transformantów. Wyniki badań rzuciły także nowe światło na mechanizmy tolerancji na Zn, wskazując na istotną rolę apoplastu oraz pozwoliły na nowe spojrzenie na proces powstawania nekroz u roślin hodowanych na pożywce z nadmiarem Zn. Badania dotyczące tego zagadnienia są obecnie z powodzeniem kontynuowane w Zakładzie Anatomii i Cytologii Roślin UW. Tym niemniej odnosząc się do celu pracy, uwzględniając wszystkie otrzymane wyniki opisane powyżej, należy stwierdzić, że przydatność badanych konstruktów dla celów modyfikacji dystrybucji pęd/korzeń Zn i Cd dla potrzeb biotechnologii (fitoremediacji) jest niska. Wykazano bowiem, że modyfikacja pobierania, akumulacji i tolerancji na Zn i Cd w tytoniu wynikająca z wprowadzenia AtHMA4-­‐F i jego mutantów jest zależna od stężenia pierwiastków w pożywce. Nieprzewidywalność fenotypu roślin transgenicznych w odniesieniu do np. zmienności warunków glebowych (profilu jonowego roztworu glebowego zależnego od poziomu opadów, zakwaszenia, nawożenia itp.) wyklucza więc na tym etapie ich praktyczne zastosowanie.