Streszczenie pracy
Transkrypt
Streszczenie pracy
Justyna Mazurek Rozprawa doktorska: Podłoże genetyczne lekooporności u komensalnych Escherichia coli izolowanych od zdrowych zwierząt, w trakcie prewencyjnej antybiotykoterapii i po jej zakończeniu. Streszczenie pracy Antybiotykooporność u bakterii jest globalnym problemem zdrowia publicznego. Zakłady hodowli trzody chlewnej należą do szczególnych środowisk, w których efekt ekonomiczny i cykl produkcyjny wymuszają periodyczne stosowanie antybiotyków. Zatem komensalna flora jelitowa trzody chlewnej jest istotnym rezerwuarem cech opornych. W dążeniu do pełnego zrozumienia zagrożeń wynikających z możliwości transferu bakterii opornych, od produktów spożywczych pochodzenia zwierzęcego do człowieka, istotne jest poznanie zróżnicowania i stopnia rozpowszechnienia genetycznych determinant oporności na antybiotyki wśród komensalnych Escherichia coli od trzody chlewnej. Materiał do badań pochodził z zakładu hodowli trzody chlewnej, w którym młode zwierzęta po odstawieniu od matki podlegały programowi leczenia metafilaktycznego. Program ten realizowany był w okresie ok. 50 dni i obejmował antybiotykoterapię złożoną z amoksycykliny, trimetoprimu, i sulfonamidów. Próbki kału pobrano od 4 grup warchlaków, na różnym etapie realizacji programu metafilaktyki oraz od dwóch grup dorosłych zwierząt (loch i macior) będących 10 i 18 tygodni po zakończonej metafilaktyce. Od każdego z badanych zwierząt pobrano jedną próbkę. Próbki posiewano na podłoża selekcyjne a następnie identyfikowano biochemicznie E. coli. Po identyfikacji wybierano losowo jedną reprezentatywny izolat dla osobnika. Utworzono zbiór liczący łącznie 382 izolaty. W pierwszym etapie badań przeprowadzono analizy wrażliwości szczepów na 11 antybiotyków. Dla każdego z testowanych antybiotyków oznaczono minimalne stężenia hamujące wzrost badanych szczepów (MIC) i w oparciu o epidemiologiczne wartości odcięcia (ang. cut-off) określono liczbę opornych E. coli. Oporność na antybiotyki wykazano zarówno wśród szczepów od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii jak i po jej zakończeniu, i dotyczyła ona najczęściej: sulfametoksazolu, trimetoprimu, ampicyliny oraz streptomycyny i tetracykliny. Oporność na cefalosporyny i chinolony występowała z niską częstością. Większość szczepów (81%) wykazywała wielolekooporność. W kolejnym etapie badań, wykorzystując metodę PCR, poszukiwano 26 genów związanych z zidentyfikowaną opornością fenotypową. Wśród 382 szczepów stwierdzono obecność genu oporności na ampicylinę: blaTEM-1, a jego rozpowszechnienie korelowało z częstością fenotypowej oporności na ten antybiotyk. Wykryto obecność dwóch genów oporności na streptomycynę: aadA1 oraz strA/B. Gen aadA1 występował częściej, a liczne szczepy niosły oba geny. Zidentyfikowano cztery geny oporności na tetracyklinę tetA, tetB, tetC, tetM. Najczęściej identyfikowanym genem był gen tetA, następnie tetC i tetB. W licznych szczepach występowały dwa geny jednocześnie. Wykryto cztery geny związane z opornością na trimetoprim: dfrA1, dfrA5, dfrA7, dfrA12. Gen dfrA1 przeważał liczebnie nad pozostałymi genami dfrA wśród szczepów od warchlaków. W licznych szczepach od każdej grupy zwierząt stwierdzono współwystępowanie od 2 do 3 genów dfrA. Oporności na sulfametoksazol była związana z genami: sul1, sul2, sul3. Gen sul3 był równomiernie rozpowszechniony wśród szczepów w każdej grupie zwierząt, a sul1 występował częściej wśród E. coli od warchlaków, niż u dorosłych zwierząt. Liczne szczepy od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii zawierały więcej niż jeden gen sul. W nielicznych szczepach od warchlaków stwierdzono obecność genów oporności na chinolony: qnrS i qnrB. W kolejnym etapie badań identyfikowano obecność integronów klasy 1 i 2. Stwierdzano występowanie zarówno pełnych integronów klasy 1 jak i ich fragmentów (nietypowe integrony klasy 1- bez kaset genowych i/lub genów końca 3’). Pełne integrony klasy 1 częściej występowały u szczepów od warchlaków i zawierały 4 zestawy kaset genowych: dfrA1-aadA1; aadA1; dfrA12-aadA2; dfrA7. Nietypowe integrony klasy 1 były identyfikowane częściej wśród szczepów od zwierząt po zakończeniu metafilaktyki. W integronach klasy 2 zidentyfikowano dwa zestawy kaset genowych: dfrA1-sat2-aadA1 oraz estX- sat2-aadA1. Szczepy niosące oba typy integronów częściej pochodziły od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii. W dalszych badaniach obejmujących analizy transpozonów, regionów wspólnych ISCR (ang. common region) i plazmidów, zbiór szczepów ograniczono do 58 E. coli reprezentatywnych zarówno pod względem obecności wielu determinant oporności fenotypowej i genotypowej jak i pod względem pochodzenia od zwierząt będących w trakcie i po zakończeniu programu metafilaktyki. Obecność transpozonów 7 (Tn7) i 21 (Tn21) oraz regionów wspólnych ISCR identyfikowano w oparciu o metodykę wykorzystującą reakcje PCR. Częstość występowania Tn21 była wyższa niż Tn7 w obu grupach zwierząt (p=0,0001 oraz p=0,0140). Ponadto, zarównoTn21 jak i Tn7 występowały częściej u szczepów od zwierząt po zakończeniu antybiotykoterapii. Spośród poszukiwanych 3 typów regionów wspólnych ISCR1, ISCR2, ISCR3 wykazano obecność regionu ISCR2. Występował on częściej u szczepów od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii niż po jej zakończeniu (p= 0,0017). Plazmidy charakteryzowano określając ich wielkość, przynależność do grupy niezgodności oraz zdolność do transferu koniugacyjnego. Stwierdzono występowanie plazmidów o zróżnicowanej wielkości (100 - 1.5 kpz). U szczepów od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii najczęściej identyfikowano od 2 do 4 plazmidów, a 1 lub 2 plazmidy charakteryzowały większość E. coli od zwierząt po antybiotykoterapii. W zbiorze 58 szczepów zidentyfikowano 11 typów replikonów odpowiadających plazmidowym grupom niezgodności Inc: FIA, FIB, FIC, FIIA oraz K, HI1, I1, Y, P, T, B/O. Do najczęściej identyfikowanych należały replikony plazmidowe należące do grupy niezgodności F: w tym FIB, FIIA, następnie K oraz I1. W poszczególnych szczepach stwierdzano współwystępowanie replikonów różnych grup niezgodności. Wykazano występowanie 31 różnych złożeń replikonów świadczących o licznych zdarzeniach rekombinacji między plazmidami. Większość spośród charakteryzowanych plazmidów wykazywała zdolność do koniugacyjnego transferu. Dowodzi to, że w większości były to plazmidy koniugacyjne i mobilizowane, ponieważ w komórkach transkoniugantów stwierdzano profile plazmidowe w niewielkim stopniu uproszczone w porównaniu do profili zidentyfikowanych w komórkach szczepów dawców. Dla wszystkich otrzymanych transkoniugantów określono wartości MIC antybiotyków, zbadano obecność genów oporności, oraz integronów klasy1 i 2, a takżeTn7 i Tn21 i regionu ISCR2. Integrony klasy 1 i 2, a także Tn7 i Tn21 oraz ISCR2 były przekazywane do szczepu biorcy E. coli J53 NalR z wysoką efektywnością. Wysoką efektywność transferu wykazano dla oporności na sulfametoksazol, tetracyklinę, ampicylinę i streptomycynę. W przypadku oporności na trimetoprim efektywność przenoszenia genów dfrA, w wyniku koniugacji, była niższa w porównaniu do genów związanych z opornością na inne rozpatrywane antybiotyki. Często obserwowano, że transkoniugant był wrażliwy na trimetoprim chociaż w jego komórkach stwierdzono obecność genów dfrA, zarówno związanych ze strukturą integronu klasy1 i/lub 2, jak i występujących poza integronami. Dowodziło to, że oporność wykazana w komórkach dawców była związana z genami innymi niż badane, umiejscowionymi na plazmidzie niepodlegającym transferowi koniugacyjnemu lub na chromosomie. W komórkach transkoniugantów opornych na trimetoprim stwierdzano częste występowanie kasety drfA1 w strukturze integronów klasy 1 i/lub 2 oraz różne złożenia genów dfrA poza strukturami integronowymi. W celu określenia, które z genów dfrA są związane z fenotypem oporności wykonano analizy transkrypcji na poziomie cDNA z wykorzystaniem Real-Time PCR dla transkoniugantów, a następnie szczepów dawców. Wyniki wykazały, że oporność na trimetoprim jest związana z genami dfrA12, dfrA5 lub dfrA7 umiejscowionymi poza strukturami integronów. Brak zdolności do ekspresji kasety genowej drfA1 w strukturze integronowej był dość nieoczekiwany tym bardziej, że takie właśnie struktury powszechnie uważane są za podstawowe dla ekspresji fenotypu oporności na trimetoprim u szczepów od zwierząt. Analizy ekspresji rozszerzono o geny dfrA występujące u szczepów dawców i wyniki były analogiczne do uzyskanych dla transkoniugantów. Przeprowadzono też analizy sekwencji DNA regionów promotorowych dla kaset genowych integronów klasy 1 u badanych szczepów. Ujawniły one występowanie słabych promotorów Pc oraz promotora pomocniczego P2 defektywnego pod względem sekwencji bazowej GGG, co może tłumaczyć brak transkrypcji kaset genowych w tych integronach.