1 RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr inż. Marty Wagner pt

GDAŃSKI UNIWERSYTET ME DYCZNY
Wydział Lekarski
Katedra i Zakład Fizjopatologii
ul. Dębinki 7, 80-211 Gdańsk
tel./ fax. 058 349-15-10
Kierownik: Prof. dr hab. med. Jacek M. Witkowski
e-mail: [email protected]
RECENZJA
rozprawy doktorskiej mgr inż. Marty Wagner pt. „Wybrane czynniki genetyczne warunkujące
podatność na stwardnienie rozsiane i przebieg choroby”.
Rozprawa doktorska mgr Marty Wagner, której tematem jest poszukiwanie istotnych
czynników genetycznych podatności na stwardnienie rozsiane (SM), jest bardzo na czasie. W Polsce, z
racji naszej przynależności do obszarów wysokiego ryzyka, na stwardnienie rozsiane cierpi około 40
osób na 100 000 i corocznie pojawia się od 1,5 do ponad 3 przypadków na 100 000 mieszkańców.
Wprawdzie choroba, którą zdefiniowano już w połowie XIX wieku, jest zdefiniowana jako choroba
autoimmunologiczna prowadząca do procesów demielinizacyjnych i związanych z nimi objawów
neurologicznych, to jednak jej etiopatogeneza jest daleka od zrozumienia. Powoduje to, że chorych
na tę dramatycznie pogarszającą jakość życia chorobę leczymy w miarę standardową
immunosupresją, a nie lekami celującymi w jej przyczyny. Autorka zresztą, w obszernym Wstępie
rozprawy, bardzo szczegółowo omawia charakterystykę kliniczną (objawy i przebieg) choroby, a
następnie wykazuje się szeroką i aktualną wiedzą na temat jej (ciągle niejasnej) etiopatogenezy,
uwzględniając dość szeroko informację o udziale zaburzeń funkcjonowania układu odpornościowego.
Ze względu na od dawna znany fakt etnicznego, a także geograficznego zróżnicowania
zapadalności i chorobowości, podłoże genetyczne stwardnienia rozsianego wydaje się być oczywiste,
a należące do obrazu choroby zjawiska immunologiczne sugerują, że elementem zmian genetycznych
predysponujących lub do pewnego stopnia chroniących przed SM muszą być warianty lub mutacje
genów, których produkty zaangażowane są w te zjawiska. Oczywiście doktorantka nie jest pierwszym
badaczem, który zajmuje się genetyką SM ; we Wstępie (str 20-34) szczegółowo omawia związki
między chorobą a licznymi genami o takowe podejrzewanymi, m.in. zwłaszcza HLA-DRB1*15:01,
IL2RA, IL7R, CLEC16A itd., a także genów, których genetycznymi wariantami zajmie się szerzej w
rozprawie, czyli ALCAM/CD166/CD6L, CD6, CD80, CD86, CD28 oraz CTLA-4 i wreszcie CD40 i
CD40L/CD154. Już ta ostatnia lista 8 genów wskazuje, że Autorka kompleksowo podeszłą do
zagadnienia. Oczywiście dobór genów do badań wpływu zróżnicowania ich wariantów
polimorficznych na ryzyko wystąpienia i przebieg SM jest jak najbardziej właściwy w szczególności
dlatego, że produkty wszystkich z nich uczestniczą w regulacji interakcji pomiędzy komórkami
prezentującymi antygeny (APC) i limfocytami T lub B, a w konsekwencji kontrolują aktywność tych
ostatnich.
1
Trzeba tu powiedzieć, że praca recenzenta jest wielce ułatwiona przez fakt opublikowania
przez Doktorantkę większości zawartych w rozprawie wyników w trzech publikacjach: dwóch w
Journal of Neuroimmunology (2013 i 2014) i jednej w Human Immunology (również w bieżącym
roku). Wskaźniki oddziaływania (IF) tych pism za rok 2013 to odpowiednio 2.786 i 2.282. Należy więc
uznać, że publikacja wyników w tych periodykach, poprzedzona rygorystyczną oceną w ramach „peer
review”, zwalnia recenzenta rozprawy z konieczności ich recenzowania, wręcz wskazując na wysoką
(bo wartą opublikowania) klasę tych badań. W skrócie, autorka wykazała statystycznie istotne
zależności pomiędzy posiadaniem w genomie określonych polimorfizmów ww. genów a wzrostem
ryzyka zachorowania na SM (ALCAM, CD86 i CD40), a także ochronne działanie (zmniejszające ryzyko
SM) polimorfizmów CD6 i CD80. Wykazała również istnienie znaczących dla podatności, wieku
zachorowania i przebiegu SM interakcji pomiędzy ALCAM i CTLA-4 a jednej strony, a allelem HLADRB1*15:01. Według Autorki, wiek zachorowania zależy także od polimorfizmu CD40, CD28, CD86 i
CD80; natomiast łagodniejszy bądź bardziej agresywny przebieg choroby związany jest także z
polimorfizmami CD6 i CD40. Wydaje się więc (co samo w sobie nie jest zresztą nowością i było
wielokrotnie postulowane, natomiast co Autorka bardzo elegancko wykazała w swoich badaniach), że
tło genetyczne choroby jest wielogenowe i bardzo złożone.
Z mojego punktu widzenia jako immunologa i patofizjologa istotna jest rzeczywista siła
predykcyjna posiadania takiej czy innej konfiguracji SNP dla zmiany prawdopodobieństwa
zachorowania. Autorka precyzyjnie wylicza parametry tego ryzyka i wykazuje gdzie to możliwe
statystyczną istotność jego wzrostu lub redukcji z wystąpieniem określonej konfiguracji genetycznej,
jednak z punktu widzenia populacji dwu- czy nawet trzykrotny wzrost ryzyka to wystąpienie nie 3, a 9
nowych przypadków rocznie na 100 000 Polaków. Interesujące byłoby policzenie, jakie
prawdopodobieństwo wystąpienia choroby w ciągu np. najbliższego roku czy też w skali całego życia
ma osoba o określonym, scharakteryzowanym przez Doktorantkę jako znaczący, genotypie, u której
żadne objawy choroby jeszcze nie wystąpiły. Taka informacja mogłaby mieć znaczenie, prowokując
zachowania i działania profilaktyczne. Czy możliwe jest dokonanie takich obliczeń na podstawie
uzyskanych przez Doktorantkę wyników w kontekście (metaanalitycznym) innych opublikowanych
prac na ten temat? W miarę możności proszę o odpowiedź przy okazji publicznej obrony.
Drugim interesującym dla mnie zagadnieniem byłoby przełożenie obserwowanych wariantów
genetycznych nie tylko i nie tyle na poziom transkrypcji badanych genów (co Autorka zresztą zrobiła)
ale na poziom i ewentualnie właściwości ich ostatecznego produktu, czyli odpowiednich białek.
Oczywiście rozumiem, że nie było to przedmiotem rozprawy, ale w tego typu badaniach trzeba
uważać na interpretację – w ludzkich (czy ogólnie eukariotycznych) komórkach przełożenie poziomu
transkrypcji (czyli ilości mRNA) na ilość produktu białkowego nie jest liniowe. Czy takie badania są
planowane? Pytanie to sprowokowane jest podrozdziałem na str. 201 rozprawy, zatytułowanym
„Planowana kontynuacja badań”, w którym Autorka planuje „badania prowadzące do wyjaśnienia
funkcjonalnego znaczenia polimorfizmu rs12360861G w genie CD6”, ale chyba zamierza jedynie
określić wpływ tego polimorfizmu na poziom metylacji jego promotora. Podobnie, w ostatnim zdaniu
tego podrozdziału Autorka sugeruje zbadanie poziomu ekspresji genów CTLA-4, CD80, CD86 i CD28,
ale chyba znowu (niestety) tylko na poziomie mRNA. A to właśnie na poziomie białek „dzieje się” coś
naprawdę ciekawego i istotnego dla zrozumienia mechanizmu SM, jak wynika np. z niedawnych prac:
Pinto-Medel MJ i wsp., The CD4+ T-cell subset lacking expression of the CD28 costimulatory
molecule is expanded and shows a higher activation state in multiple sclerosis. J Neuroimmunol.
2012 Feb 29;243(1-2):1-11, czy Broux B i wsp., CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into
the brain of multiple sclerosis patients. J Autoimmun. 2012 Feb;38(1):10-9. Połączenie tych informacji
2
z opisanymi przez Autorkę zależnościami genetycznymi byłoby fascynujące. Warto by było się także
przyjrzeć opisanym przez grupę pod kierownictwem Davida H. Wagnera komórkom Th40, które, jak
nazwa sugeruje, wykazują ekspresję cząsteczki CD40 (której gen był badany przez autorkę) i
równocześnie mają silną zdolność do produkcji cytokin prozapalnych; ich rola została już wykazana w
patogenezie cukrzycy typu 1, a niedawno także ta sama grupa opisała ich zachowanie w stwardnieniu
rozsianym, sugerując rolę w patogenezie (Waid DM, Schreiner T, Vaitaitis G, Carter JR, Corboy JR,
Wagner DH Jr. Defining a new biomarker for the autoimmune component of Multiple Sclerosis: Th40
cells. J Neuroimmunol. 2014 May 15;270(1-2):75-85). I tu jedyna chyba naprawdę krytyczna uwaga
wobec podejścia metodycznego. Otóż, w celu uzyskania RNA do celu określenia poziomu transkrypcji
badanych genów, Autorka użyła pełnej krwi. O dziwo, takie podejście nie zostało zakwestionowane
także przez recenzentów opublikowanej pracy (M.Wagner et al. Journal of Neuroimmunology 276
(2014) 98–103)! A przecież, jeśli oceniamy wielkość transkrypcji z jakiegoś genu, to powinniśmy
oceniać ją w czystych populacjach komórek o których wiemy, że ta ekspresja tam występuje. W
innym wypadku ryzykujemy, że zaobserwowana zróżnicowana ekspresja będzie skutkiem np. różnych
proporcji komórek wyrażających dany gen w materiale od osób zdrowych i chorych, przy możliwej
takiej samej ekspresji tegoż genu w przeliczeniu na pojedynczą komórkę, co może zakłócić naszą
interpretację – na przykład – wpływu wykrytych polimorfizmów na tę że ekspresję. (Np. zmiana
proporcji wspomnianych wyżej komórek Th40 we krwi osób chorych, przy takiej samej ekspresji CD40
przez pojedynczą komórkę Th40 osoby zdrowej i chorej, musi spowodować zmianę globalnego
poziomu ekspresji CD40 w RNA izolowanym z pełnej krwi. Podobnie, zmiana odsetka komórek
CD4+CD28- (wspomniana praca Pinto-Medel i wsp.) może (choć nie musi) skutkować zmienionym
„globalnym” poziomem ekspresji genu CD28 u chorych. Możliwe zresztą, że właśnie opisane w
powyższych pracach zmiany odsetków komórek wykazujących ekspresję CD40 czy CD28 u chorych na
SM zależą od (lub są związane z) wykrytych przez Autorkę rozprawy istotnych polimorfizmów tych
genów! To oczywiście nie krytyka rozprawy, a sugestia „dalszego ciągu”.
Od strony „techniczno-edytorskiej” praca napisana jest poprawnie, względnie przejrzyście,
posiada typowy układ. Recenzenta zastanowiło umieszczenie szczegółowej listy użytych skrótów n
początku rozprawy w sytuacji, gdy każdy z nich jest rozwinięty w tekście przy pierwszym użyciu;
wydaje się to nadmiarowe, ale może wynikać z formalnych wymogów stawianych rozprawom
doktorskim w macierzystej jednostce Autorki. Obszerna dyskusja opiera się na znajomości bardzo
szerokiego wachlarza publikacji dotyczących tematyki udziału genów w rozwoju SM. Cenne jest
parostronicowe podsumowanie uzyskanych wyników, zwłaszcza w kontekście pokaźnej jak na
rozprawę doktorską objętości pracy. Wnioski poprawnie sformułowane i odpowiadające na pytania
postawione na początku (w rozdziale „Założenia i cele pracy”).
Podsumowując, rozprawa doktorska mgr inż. Marty Wagner ma walor interesującego,
ważnego poznawczo i potencjalnie klinicznie tematu, została zasadniczo poprawnie wykonana od
strony metodycznej i pozwoliła na poczynienie nowych i interesujących obserwacji, co potwierdza
fakt opublikowania większości z nich. Praca spełnia wymogi ustawowe stawiane rozprawom na
stopień doktora nauk.
Dlatego zwracam się do Wysokiej Rady Naukowej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej
im. Ludwika Hirszfelda PAN o dopuszczenie mgr inż. Marty Wagner iej do dalszych etapów
przewodu doktorskiego.
3
Równocześnie, ze względu na jakość naukową rozprawy oraz fakt opublikowania większości
zawartych w niej wyników w trzech publikacjach, w których Doktorantka jest pierwszym autorem,
wnioskuję o jej wyróżnienie.
Prof. dr hab. Jacek M. Witkowski
4