streszczenie(PL)

Deoksyrybozymy aktywne w obecności jonów kadmu oraz w środowisku o niskiej
wartości pH otrzymane metodą selekcji in vitro
Aleksandra Kasprowicz
Niniejsza rozprawa doktorska poświęcona jest katalitycznym cząsteczkom DNA –
DNAzymom, które podobnie jak enzymy białkowe, wykazują właściwości katalityczne w
szeregu
reakcji
biochemicznych.
Jak
dotychczas
nie
zidentyfikowano
naturalnie
występujących DNAzymów, a wszystkie dotychczas poznane otrzymano na drodze selekcji in
vitro. DNAzymy znalazły swoje zastosowanie w medycynie jako potencjalne terapeutyki, a
także w biochemii i biotechnologii jako specyficzne narzędzia molekularne. Obecnie,
największy obszar ich wykorzystania stanowi analityka ilościowa i jakościowa. Ze względu
na to, że większość DNAzymów do swojej aktywności katalitycznej wymaga kofaktorów w
postaci jonów metali dwuwartościowych, z powodzeniem wykorzystuje się je do konstrukcji
biosensorów wykrywających jony metali.
Celem niniejszej pracy było otrzymanie DNAzymów aktywnych w obecności jonów
kadmu. Kadm jest zaliczany do głównych zanieczyszczeń chemicznych środowiska. Jest
pierwiastkiem o dużej toksyczności, nawet w bardzo małych stężeniach w organizmie. Ze
względu na wysoką toksyczność stanowi on poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt.
Do poszukiwania DNAzymów przecinających wiązanie fosfodiestrowe RNA w obecności
jonów kadmu zastosowana została metoda selekcji in vitro z wykorzystaniem biblioteki
kombinatorycznej oligonukleotydów z 23-nukleotydowym regionem typu random.
Niespodziewanie, w wyniku pierwszej selekcji otrzymano DNAzymy aktywne w
niskim pH środowiska, z optimum działania przy pH 4,0–4,5. Eksperymenty selekcji in vitro
związane są zawsze z ryzykiem, że nie otrzymamy wariantów o pożądanych właściwościach
lub otrzymamy warianty o szerszym spektrum aktywności niż przez nas zakładane. Jak
dotychczas, większość doniesień literaturowych odnoszących się do katalitycznych
cząsteczek DNA dotyczy wariantów, które do aktywności katalitycznej wymagają kofaktorów
w postaci jonów metali dwuwartościowych oraz fizjologicznego pH środowiska. Z uwagi na
interesujące właściwości otrzymanych DNAzymów pH-zależnych, przeprowadzono szereg
doświadczeń pozwalających na szczegółową charakterystykę ich właściwości katalitycznych.
Co ciekawe, otrzymane DNAzymy do aktywności katalitycznej nie wymagają obecności
jonów Cd2+ ani innych jonów metali. Wyniki przeprowadzonych badań spektroskopowych
techniką CD i UV-vis sugerują, że w środowisku o pH 4,0–4,5 dochodzi do protonacji grup
funkcyjnych nukleotydów tworzących centum katalityczne DNAzymów oraz zwinięcia
cząsteczek w odpowiednią strukturę drugorzędową, umożliwiającą katalizę reakcji cięcia. Jest
wielce prawdopodobne, że to zasady azotowe łańcucha fosfo-cukrowego deoksyrybozymów
ulegając protonacji, odgrywają zarówno rolę strukturalną, jak i uczestniczą bezpośrednio w
katalizie. W oparciu o wyniki mapowania struktur drugorzędowych DNAzymów pHzależnych za pomocą nukleazy S1 i siarczanu dimetylu zidentyfikowano elementy
DNAzymów o zasadniczym znaczeniu dla reakcji katalizy. Wykazano, iż dystalne fragmenty
z końca 5’ i 3’ cząsteczek, nie wpływają na ich właściwości katalityczne. Zaprojektowno
również
aktywne
katalitycznie
warianty
pH-zależne
działające
w
układzie
dwucząsteczkowym (in trans).
W wyniku drugiego eksperymentu selekcji in vitro uzyskano DNAzymy aktywne w
obecności jonów Cd2+, niemniej jednak otrzymane warianty wykazują szersze spektrum
specyficzności i są również aktywne wobec niektórych innych jonów metali. Najwyższą
aktywność katalityczną wykazują w obecności jonów Cd2+, a niższą w obecności jonów Co2+,
Mn2+ i Zn2+. Sugeruje to, że tworzenie kompleksu jon–DNAzym nie wymaga wysoce
specyficznego sposobu koordynacji jonu metalu. Na podstawie wyników z chemicznego i
enzymatycznego mapowania struktury drugorzędowej jednego z wybranych DNAzymów
oraz porównania sekwencji wszystkich otrzymanych wariantów stwierdzono, iż należą one do
DNAzymów typu 8-17. Do zachowania wysokiej aktywności katalitycznej otrzymane
DNAzymy wymagają temperatury 25°C, co może być związane z odpowiednim zwinięciem
cząsteczek w katalitycznie aktywną konformację. Badania z wykorzystaniem ukierunkowanej
mutagenezy wykazały, że obecność zasady purynowej w pozycji 12 regionu katalitycznego
jest niezbędna dla zachowania aktywności katalitycznej. Natomiast skład nukleotydowy
trzonu spinki obecnej w regionie katalitycznym wpływa na poziom aktywności katalitycznej
otrzymanych DNAzymów oraz ich preferencje wobec jonów metali. Podjęto próbę uzyskania
DNAzymów Cd2+-zależnych działających w układzie dwucząsteczkowym (in trans), niemniej
jednak żaden spośród 6 zaprojektowanych wariantów nie wykazywał aktywności
katalitycznej.