Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015 Ćwiczenie 9

Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015
Ćwiczenie 9 Enzymatyczna hydroliza skrobi
PODSTAWY TEORETYCZNE
Skrobia stanowi najcenniejszy materiał zapasowy roślin (pełni rolę nośnika energii niezbędnego w większości procesów
metabolicznych) oraz jest bardzo istotnym składnikiem żywieniowym w diecie ludzi i zwierząt. Analizując jej budowę można
stwierdzić, że jest ona homopolimerem polisacharydowym zbudowanym z cząsteczek D-glukozy, które są połączone wiązaniami
alfa-glikozydowymi. Nie stanowi ona jednak jednorodnego związku lecz jest mieszaniną rożnych strukturalnie polimerów: amylozy
i amylopektyny.
Amyloza tworzy proste, długie łańcuchy o masie cząsteczkowej od 4 do 15 kDa. Reszty glukozowe są przyłączane w niej wyłącznie
wiązaniami alfa-1,4-glikozydowymi.
W rzeczywistości jest to mieszanina liniowych i bardzo słabo rozgałęzionych łańcuchów glukanowych. Łańcuchy amylozy występują
w formie lewoskrętnej helisy (każdy zwój takiej helisy zawiera 6 reszt D-glukozy), stabilizowanej wiązaniami wodorowymi,
wewnątrz której może ulegać wiązaniu jod dając w efekcie skrobi charakterystyczne ciemnoniebieskie zabarwienie. Kilka nici
amylozy (6 lub 7) może łączyć się w tzw. „wiązki” tworzące coś na kształt rury z kanałem w środku. Zwykle skrobia pochodząca z
ziaren zbóż w wiązce zbudowanej z sześciu helis zawiera siódmą helisę w środku. Z kolei w skrobi ziemniaczanej wiązki amylozy
złożone są z 6 helis i w środku mają pustą przestrzeń zdolną do inkludowania mniejszych cząstek.
Amylopektyna jest tworem rozgałęzionym, w którym łańcuch centralny tworzą cząsteczki D-glukozy połączone wiązaniem alfa1,4-glikozydowym, od którego odchodzą liczne odgałęzienia tworzone przez wiązania alfa-1,6-glikozydowe. Dla przykładu, w skrobi
ziemniaczanej wiązania alfa-1,6-glikozydowe stanowią około 4% wszystkich wiązań glikozydowych obecnych w polimerze. Dzięki
obecności tych wiązań jednym z produktów hydrolizy amylopektyny jest izomaltoza. Długość łańcuchów bocznych jest
zróżnicowana i średnio wynosi od 13 do 45 reszt glukozowych (mogą jednak występować znacznie dłuższe łańcuchy boczne).
Wśród łańcuchów bocznych wyróżnia się tzw. łańcuchy typu A (nie posiadające dalszych odgałęzieni) oraz łańcuchy typu B (z co
najmniej jednym bocznym odgałęzieniem). Masa cząsteczkowa amylopektyny jest znacznie większa niż amylozy
i przekracza 500 kDa, a sięga nawet do 100000 kDa.
Roztwory wodne amylopektyny bardziej opalizują, a w reakcji z jodem wykazują zabarwienie fioletowe, podczas gdy amyloza barwi
się z jodem na kolor ciemnoniebieski.
Skrobia występuje w ziemniakach, ziarnie zbóż i w owocach, pestkach, bulwach oraz kłączach wielu innych roślin. Tworzy rożnego
rodzaju granulki różniące się w zależności od źródła pochodzenia oraz sposobu wydzielania. Większość granulek składa się z
kolejnych warstw, które ulegają asocjacji mając postać ziarenek widocznych pod mikroskopem. Stosunek amylozy i amylopektyny
jest zasadniczą cechą poszczególnych gatunków skrobi. W tablicy podano przeciętne zawartości amylozy w zależności od źródła
skrobi.
Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015
Ćwiczenie 9 Enzymatyczna hydroliza skrobi
Skrobia znalazła różnorakie zastosowania, szczególnie w przemyśle spożywczym. Wykorzystuje się ją głównie do produkcji
syropów maltodekstrynowych, maltozowych, glukozowych i fruktozowych.
Poszczególne syropy różnią się stopniem hydrolizy skrobi i najczęściej charakteryzuje się je poprzez tzw. ekwiwalent dekstrozowy
DE (ang. dextrose equivalent). Ekwiwalent ten wyrażony jest w procentowej zawartości cukrów redukujących (zwykle
równoważników glukozy) na jednostkę suchej masy produktów. Zwykło się przyjmować, że dla skrobi DE jest w przybliżeniu równy
zero, podczas gdy przeprowadziłoby się pełną hydrolizę skrobi do glukozy DE wynosiłby 100.
Syropy maltodekstrynowe powstają w wyniku tzw. „upłynniania skrobi”. Stosuje się je jako regulatory wilgotności przetworów
spożywczych, zagęszczacze, inhibitory krystalizacji, nośniki leków, wypełniacze lub plastyfikatory żywności.
Syropy maltozowe lub glukozowe uzyskuje się w tzw. procesie „scukrzania skrobi” po jej uprzednim upłynnieniu. Syropy
maltozowe stosuje się głownie w przemyśle cukierniczym do zapobiegania krystalizacji sacharozy, polepszania konsystencji
przetworów spożywczych i przedłużania ich trwałości. Syropy o dużej zawartości maltozy stosuje się do produkcji lodów, mrożonej
żywności (ograniczają powstawanie kryształków lodu), napojów bezalkoholowych oraz żywności dla diabetykow. Syropy powstałe
ze skrobi stosuje się też jako substytuty tłuszczów w żywności „fat free”. Syropy glukozowe znajdują głownie zastosowanie w
przemyśle browarniczym, gorzelniczym oraz piekarniczym. Otrzymuje się z nich również syropy fruktozowe dodawane do konfitur,
syropów i napojów takich jak Pepsi, Mirinda, Coca Cola. Syropów fruktozowych używa się również do produkcji żywności dla
diabetyków.
Początkowo, na przełomie XIX i XX wieku otrzymywano już znaczące ilości syropów skrobiowych z zastosowaniem kwasów
nieorganicznych do przeprowadzania hydrolizy kwasowej skrobi. Po odkryciu enzymów amylolitycznych i opracowaniu sposobów
ich pozyskiwania zaczęto stosować metodę mieszaną hydrolizy skrobi (hydrolizę kwasową połączoną z hydrolizą enzymatyczną).
Pod koniec XX wieku stosowano już właściwie enzymatyczne metody hydrolizy skrobi.
Enzymy stosowane do hydrolizy skrobi są zaliczane do podklasy hydrolaz. W roztworach wodnych katalizują one przede wszystkim
hydrolizę wiązań glikozydowych. Typowymi enzymami trawiennymi, występującymi w ślinie i wydzielinie trzustki kręgowców są
amylazy, które katalizują rozkład skrobi i glikogenu. Są one również obecne w roślinach, zwłaszcza w zarodkach ziarna zbóż, gdzie
w procesie kiełkowania następuje ich gwałtowna synteza, mająca na celu szybkie uruchomienie energetycznego materiału
zapasowego; znalazło to zastosowanie przy otrzymywaniu słodu.
W procesach technologicznych amylazy pochodzenia roślinnego i zwierzęcego zostały stopniowo zastąpione przez tańsze enzymy
grzybowe i bakteryjne.
Znane są rożne rodzaje amylaz, a podzielić je można w wieloraki sposób.
Z punktu widzenia możliwości hydrolizy rożnych wiązań glikozydowych można je sklasyfikować na atakujące wiązania:
1. afa-1,4-glikozydowe (alfa-amylazy, beta-amylazy),
2. alfa-1,6-glikozydowe (izoamylazy),
3. alfa-1,4-glikozydowe i alfa-1,6-glikozydowe (glukoamylazy).
Biorąc pod uwagę miejsce cięcia wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi można je podzielić na:
1. endoamylazy (alfa-amylazy, amylazy znoszące rozgałęzienia)
2. egzoamylazy (glukoamylazy i beta-amylazy).
Z punktu widzenia zachodzących procesów możemy je podzielić na:
1. enzymy upłynniające (alfa-amylazy, izoamylazy)
2. scukrzające (beta-amylazy, glukoamylazy).
Spośród licznych znanych amylaz głównymi są:
1. alfa-amylaza zaliczana do endoamylaz,
2. beta-amylaza i glukoamylaza zaliczane do grupy egzoamylaz.
Wszystkie katalizują hydrolizę wiązań alfa-1,4-glikozydowych, a zgodnie z nazwą endoamylazy, alfa-amylaza atakuje wiązania
znajdujące się wewnątrz łańcucha (prowadząc do upłynniania skrobi i powstawania oligosacharydów), natomiast beta-amylaza i
glukoamylaza, jako egzoamylazy, rozrywają odpowiednio co drugie (beta-amylaza) lub kolejne (glukoamylaza) wiązania
glikozydowe, poczynając od nieredukującego końca łańcucha.
Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015
Ćwiczenie 9 Enzymatyczna hydroliza skrobi
Skrobia obok stosunkowo prostej do zhydrolizowania frakcji amylozy zawiera również frakcję amylopektyny złożoną z łańcuchów
rozgałęzionych. Ponieważ wiązania alfa-1-6-glikozydowe, występujące przy rozgałęzieniach w amylopektynie, stanowią barierę dla
działania beta-amylazy, rozkład tej frakcji skrobi jest inny: boczne łańcuchy są rozkładane przez beta-amylazę do maltozy,
podobnie jak prosty łańcuch amylozy, po czym reakcja zatrzymuje się w odległości trzech jednostek glukozy od miejsca
rozgałęzienia (wiązania alfa-1,6-glikozydowego). Powstaje więc nierozłożona, wielkocząsteczkowa dekstryna graniczna, która
stanowi około 40-45% masy amylopektyny i wykazuje znaczną lepkość w roztworze i fioletową barwę kompleksu z jodem.
Rozkładowi ulega ona dopiero przy łącznym działaniu obu enzymów, gdyż alfa-amylaza jest w stanie „przeskakiwać” przez wiązania
alfa-1,6-glikozydowe (bez ich hydrolizy), tworząc nowe, proste łańcuchy, które mogą już być dalej rozkładane przez b-amylazę. Tak
więc, w wyniku łącznego działania alfa- i beta-amylaz skrobia ulega hydrolizie do maltozy i izomaltozy oraz niewielkiej ilości wolnej
glukozy.
Najlepiej radzi sobie z amylopektyną (i glikogenem) glukoamylaza występująca w grzybach oraz u zwierząt. Rozkłada ona zarówno
wiązania alfa-1,4- jak i aalfa-1,6-glikozydowe (o ile te ostatnie znajdują się przy nieredukujacej jednostce glukozy) i dlatego przy
jej udziale amylopektyna i glikogen ulegają rozkładowi do glukozy.
Zarówno sok jelitowy, jak i ziarna zbóż zawierają również alfa-1,4-glukozydazę i alfa-1,6-glukozydazę (izomaltazę). Enzymy te
rozkładają wytworzone w wyniku działania beta-amylazy disacharydy do cząsteczek glukozy, która jest końcowym produktem
rozkładu enzymatycznego skrobi.
Większość amylaz do osiągnięcia aktywności wymaga obecności jonów wapnia. Należy również pamiętać, że amylazy różnią się
między sobą wartością optymalnego pH oraz temperatury przy których wykazują maksymalną aktywność.
Wybrane metody oznaczania aktywności amylaz
Metody wykorzystujące przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej.
Metoda Bernfelda. W metodzie Bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku
zasadowym redukują grupę nitrową soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 do grupy aminowej. Powstałe
pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują świtało przy długości fali w zakresie od 450-540 nm.
Intensywność powstałej barwy zależy od ilości w próbie cukrów redukujących uwalnianych podczas działania enzymów, dlatego
reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczenia fotometrycznego.
Metoda Somogyi i Nelsona. W tej metodzie podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, wykorzystuje się właściwości
redukujące sacharydów (głównie mono- i disacharydów), które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi (II) do jonów
miedzi (I) w obecności winianu sodowopotasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO w postaci ceglastego
osadu. Po dodaniu kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do utworzonego tlenku miedzi zachodzi redukcja tego
kwasu do odpowiedniego barwnika o kolorze błękitnym, intensywność otrzymanej barwy można mierzyć w zakresie długości fali
od 500-620 nm i jest ona proporcjonalna do ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych.
Metoda wykorzystująca zdolność skrobi do tworzenia kompleksu z jodem.
Cząsteczki skrobi zależnie od ilości zawartej w nich amylozy i amylopektyny adsorbują jod na swojej powierzchni, dając zabarwienie
niebieskie lub niebieskofioletowe. Natomiast produkty częściowej degradacji skrobi zależnie od wielkości ich cząsteczek dają
zabarwienie fioletowe (dekstryny wysokocząsteczkowe), czerwone i czerwonobrunatne (dekstryny o średniej masie
cząsteczkowej). Z kolei dekstryny niskocząsteczkowe nie dają zabarwienia z jodem.
Metoda Sandstedta, Kneena i Blisha oznaczania aktywności amylaz polega na pomiarze ilości rozłożonej skrobi, na podstawie
zmiany intensywności zabarwienia w mieszaninie reakcyjnej z jodem po określonym czasie działania enzymu w optymalnym pH i
temperaturze. Stosowana w ćwiczeniu jako substrat skrobia ziemniaczana barwi się z jodem na niebiesko (ze względu na znaczną
– ok. 20% zawartość amylozy). Po przerwaniu reakcji enzymatycznej i wprowadzeniu jodu w próbie materiałowej (bez enzymu)
oznacza się pochłanianie barwnego kompleksu powstałego z całą ilością skrobi wprowadzonej do reakcji, natomiast w próbie z
Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015
Ćwiczenie 9 Enzymatyczna hydroliza skrobi
udziałem enzymu oznacza się absorbancję kompleksu skrobi nie rozłożonej i dekstryn. Ilość rozłożonej skrobi znajduje się z różnicy
pomiarów tych dwóch prób.
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest zastosowanie preparatów enzymatycznych do hydrolizy skrobi, ocena właściwości uzyskanych produktów
oraz zbadanie wpływu temperatury i czasu na efektywność procesu hydrolizy skrobi.
Wykonanie ćwiczenia
Oznaczanie aktywności amylaz słodu
1.
Preparat enzymatyczny amylaz otrzymujemy ze słodu jęczmiennego: rozdrobniony w śrutowniku słód mieszamy z wodą w
stosunku 1: 4, po 10 minutach mieszania całość wirujemy przy 2500 rpm przez 5 minut, następnie zlewamy supernatant.
2.
Roztwór skrobi: 2 g skrobi rozpuszczalnej wprowadzamy do zlewki zawierającej 400 ml wody i przenosimy do wrzącej wody
na okres 5 minut intensywnie mieszając zawartość (w celu otrzymania homogenicznego kleiku). Następnie otrzymany kleik
gotujemy przez kolejne 5 minut. Całość schładzamy do temperatury ok. 40oC. Wykonujemy próbę jodową (punkt 4).
3.
Hydroliza skrobi. Roztwór skrobi, w ilości 50 ml wprowadzamy do 3 zlewek (numer 1, 2 i 3). Zlewki inkubujemy przez 20 minut
w odpowiedniej temperaturze – zgodnie z poniższą tabelą.
Numer zlewki
1
2
3
Temperatura inkubacji (oC)
4 (lodówka)
20 (pokojowa)
60 (łaźnia wodna)
3.1. Przygotowujemy 3 statywy z 10 probówkami każdy. Do probówek wprowadzamy po 1 ml odczynnika skrobiowego i 1 ml
buforu fosforanowego o pH 6,0, całość mieszamy.
3.2. Do zlewek wprowadzamy po 5 ml preparatu enzymatycznego amylaz słodu, całość dokładnie mieszamy (bagietka).
3.3. Zlewki ponownie inkubujemy w odpowiednich temperaturach – zgodnie z tabelą. W krótkich odstępach czasu (1 minuta)
do probówek zawierających odczynnik skrobiowy i bufor (umieszczonych w statywie) wprowadzamy 1 ml roztworu
skrobi, całość mieszamy. Obserwujemy przebieg reakcji z jodem. Zapisujemy wynik próby jodowej w tabeli poniżej.
Pobór próbek roztworu skrobi kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu
jodu. Notujemy czas, po którym pobrana próba roztworu skrobi nie zmienia barwy – co oznacza, że osiągnięto tzw. punkt
achromowy.
Wypełnić tabelkę wstawiając do odpowiednich rubryk znak „+” lub „-” mówiący odpowiednio o zmianie barwy lub braku
zmiany barwy w momencie zadozowania roztworu skrobi do odczynnika skrobiowego.
Numer zlewki
1
2
3
Wynik próby jodowej
Czas inkubacji [minuta]
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
4.
Aktywność amylaz słodu podajemy w jednostkach/ml.
Jednostka aktywności amylazy to taka ilość enzymu, która hydrolizuje 1 mg skrobi w czasie 1 minuty, w temperaturze (20, 37
lub 60oC), w pH 6,0 do produktów nie dających barwy z odczynnikiem skrobiowym.
Przykład obliczenia:
Jeżeli punkt achromowy osiągnięto po 4 minutach to aktywność amylazy słodu wynosi: 500/5x6 = 25 jednostek/ml
5.
6.
Wyznaczyć zależność jednostek aktywności amylaz od temperatury. Określić wpływ temperatury na aktywność enzymu.
Literatura
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
- Klimiuk E., Łebkowska M., Biotechnologia w ochronie środowiska. PWN, 2008.