Ocena wydzielania cytokin prozapalnych IL-6 i IL

-
ed
.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
K. Starska i inni
tio
np
roh
ibit
Ocena wydzielania cytokin prozapalnych IL-6 i IL-8
przez limfocyty T krwi obwodowej w hodowli in vitro
z komórkami raka płaskonabłonkowego krtani*
-
Otolaryngologii, Klinika Laryngologii Onkologicznej UM w Łodzi
Kierownik: prof. dr hab. med. M. Łukomski
2Zakład Immunologii Klinicznej ICZMP w Łodzi
Kierownik: prof. dr hab. med. H. Tchórzewski
-d
istr
1Katedra
ibu
Katarzyna Starska1, Marek Łukomski1,
Magdalena Józefowicz-Korczyńska1, Ewa Głowacka
on
al
us
eo
nly
Summary
Aim. The most important mechanism of host humoral immunity in antitumor response is cytokines activity produced by
T lymphocytes. The aim of this preliminary study was estimation of IL-6 and IL-8 serum concentration in patients with
squamous cell laryngeal carcinoma and analysis of indirected influence of neoplasm cells to the function of T lymphocytes
and modification of proinflammatory cytokines profile. Materials and methods. 7 patients with squamous celi carcinoma
of the larynx treated at ENT Department Medical University of Lodź between 2003–2005 were analyzed. For estimation
of proinflammatory cytokine secretion the cocultures of isolated peripheral blood lymphocytes, centrum and margin
neoplasm cells and noncancerous cells were established. Production of cytokines in supernatants was detected by Elisa.
Results. Authors reported that in vitro epithelial cells of the larynx is able to secrete of IL-8, but not IL-6. The presence of
normal epithelial cells and carcinoma cells in lymphocyte culture may increase concentration of IL-6 and IL-8 especially
with normal laryngeal epithelium cells. Conclusion. Laryngeal squamous carcinoma cells could modified T lymphocytes
activity and production of proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8.
pe
rs
Hasła i n de kso we : rak krtani, limfocyty T, cytokiny prozapalne
Ke y wo rds: laryngeal carcinoma, lymphocytes T, proinflammatory cytokines
for
Otolaryngol Pol 2007; LXI (4): 626–632 © 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
WSTĘP
is c
op
y is
Rola komórek układu immunologicznego w przebiegu choroby nowotworowej nie jest do końca
wyjaśniona. Mimo braku bezpośrednich dowodów,
iż komórki nadzoru immunologicznego chronią
przed rozwojem nowotworu, pośrednie obserwacje
kliniczne oraz badania doświadczalne wskazują
na ich aktywność w odpowiedzi immunologicz-
nej skierowanej przeciwko komórkom nowotworowym różnego pochodzenia. Zrozumienie interakcji
zachodzących między komórkami „gospodarza” a
komórkami nowotworowymi może mieć zasadnicze
znaczenie w ocenie przebiegu choroby nowotworowej i rokowania oraz warunkować postęp m.in.
w rozwoju immunoterapii nowotworów, stworzeniu szczepionek przeciwnowotworowych, a stan
odporności pacjenta może być jednym z czynników
* Praca finansowana z funduszy Komitetu Badań Naukowych. Projekt KBN nr 3P05 C 017 25
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
Production of proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8
by peripheral blood lymphocytes T under influence
in vitro of squamous cell carcinoma of the larynx
626
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 4
MATERIAŁ I METODY
is c
op
y is
for
Badaniami wstępnymi zostało objętych 7 chorych
na raka płaskonabłonkowego krtani, którzy zostali
poddani leczeniu chirurgicznemu (laryngektomii całkowitej i operacji usunięcia węzłów chłonnych szyi)
lub leczeniu skojarzonemu, tj. chirurgicznemu i radioterapii. Chorzy byli operowani w Klinice Laryngologii
Onkologicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w
latach 2003–2005, a leczenie uzupełniające zostało
przeprowadzone w Zakładzie Radioterapii Szpitala
Zespolonego im. M. Kopernika w Łodzi. Rozległość
zmian nowotworowych określono wg kryteriów WHO
klasyfikacji TNM (2001) International Classification of
Diseases for Oncology i stopnia klinicznego zaawansowania nowotworu S (stage).
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 4
-
pe
rs
on
ed
.
nly
-d
istr
ibu
tio
np
roh
ibit
Celem izolacji limfocytów krwi obwodowej
(PBMCs), krew pełna była pobierana od pacjentów
w trakcie rutynowych badań kontrolnych w ilości
10 ml jednorazowo na antykoagulant – heparynę
litową (10 U/ml). Zgodę na wykonanie badań wyraziła Komisja Bioetyczna Uniwersytetu Medycznego
w Łodzi (Nr RNN/15/03/KN). Limfocyty krwi obwodowej były izolowane przez wirowanie na gradiencie gęstości – Ficoll-Paque (ciężar właściwy 1,077
g/cm3). Komórki z centrum i obrzeża guza (tumor
centrum cells – TcC, tumor margin cells – TmC) oraz
komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka
krtani (Noncancerous cells – NCC) były izolowane
z materiału pooperacyjnego pobranego aseptycznie, z co najmniej czterech różnych miejsc guza i
z dwóch różnych miejsc niezmienionego nabłonka
krtani, do jałowego podłoża z dodatkiem penicyliny, streptomycyny i gentamycyny w stężeniu
1%V/V, natychmiast po wykonaniu laryngektomii.
Po mechanicznym rozdrobnieniu fragmenty tkanki
płukano trzykrotnie płynem Hanksa (Biomed Lublin,
Poland), a następnie zalewano roztworem enzymów
kolagenazy i hialuronidazy o stężeniu 1 mg/ml
(Sigma-AIdrich) z dodatkiem 2%V/V penicyliny i
streptomycyny (Sigma-Aldrich, Germany) i inkubowano 18 godz. w temp. 37°C w atmosferze 5% CO2
(Cellstar Incubator). Po inkubacji fragmenty tkanki
płukano trzykrotnie w PBS bez jonów Ca+ i Mg++
(300xg, 20 minut, w temp. 8°C), a następnie zalewano roztworem dyspasy w stężeniu 2,4 U/ml, inkubowano w 30 minut w temp. 37°C w atmosferze 5%
CO2, następnie komórki płukano jeden raz w PBS
bez jonów Ca++ i Mg++, zawieszano w 1 rnl PBS
i przecierano przez sitko o mesh 50 (Sigma-Aldrich,
Germany). Uzyskaną zawiesinę komórkową płukano
trzykrotnie w PBS bez jonów Ca++ i Mg++ (300xg,
14 min, w temp. 8°C). Gęstość komórek liczono przy
użyciu komory Burkera. Komórki martwe usuwano
za pomocą zestawu Dead Cell Removal (Miltenyi
Biotec). Czystość hodowli komórek nowotworowych
w zawiesinie komórkowej oceniana była z zastosowaniem obiektywnych metod immunomorfologicznych
(oznaczanie ekspresji filamentów cytokeratynowych
metodą immunohistochemiczną – badania zostały
wykonane w Zakładzie Patomorfologii Klinicznej
ICZMP w Łodzi). W celu określenia wpływu komórek raka płaskonabłonkowego krtani na funkcję limfocytów T przeprowadzono następujące interakcje:
autologiczne limfocyty T krwi obwodowej i autologiczne komórki guza (MLTcC, MLTmC), autologiczne
limfocyty T krwi obwodowej i autologiczne komórki
niezmienionego nowotworowo nabłonka (MLNCC),
eo
al
us
prognostycznych branych pod uwagę przy wyborze
optymalnej metody leczenia.
Cytokiny produkowane przez komórki nowotworowe mogą modulować odpowiedź komórek immunokompetentnych gospodarza m.in. przez wpływ na
wydzielanie przez nie cytokin prozapalnych (IL-1,
TNFa, TGFb, IL-6, IL-8), immunoregulatorowych
(IL-2, IL-12, INFg, IL-4, IL-10) oraz angiogennych
(VEGF) i w ten sposób mieć znaczenie w progresji guza [1–22]. Chociaż nie do końca poznano
mechanizmy interakcji między komórkami immunokopetentnymi a nowotworowymi, wyniki badań
oceniających poziom cytokin wytwarzanych przez
te komórki (limfocyty T, B, komórki NK i in. w
surowicy krwi pacjentów z nowotworami różnego
pochodzenia i obecne w mikrośrodowisku guza
nowotworowego, jak i w hodowlach pierwotnych
komórek nowotworowych i linii komórkowych)
wskazują na znaczenie tych zjawisk w onkogenezie,
powstawaniu przerzutów, odpowiedzi na leczenie u
pacjentów z chorobą nowotworową oraz rokowaniu
[1–22].
Celem przeprowadzonych badań wstępnych
była:
1) ocena wydzielania wybranych cytokin prozapalnych (IL-6, IL-8) przez limfocyty T krwi obwodowej u pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym
krtani,
2) próba odpowiedzi, czy bezpośrednie oddziaływanie komórek nowotworowych raka krtani na limfocyty T modyfikuje profil wydzielanych cytokin.
Proponowane badania stają się obecnie wiodącymi w immunopatologii klinicznej chorób nowotworowych.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
Ocena wydzielania cytokin prozapalnych
627
60
60
40
40
20
20
49,5±26,6
TmC
48,0±46,1
TcC
Hodowla:
41,6±32,0
TmC
58,8±55,4
NCC
50,9±44,6
TcC
ibu
52,5±44,8
NCC
tio
np
roh
ibit
80
IL-8 [pg]
80
IL-8 [pg]
100
100
ns
p<0,02
90
250
ns
IL-6 x 103 [pg]
80
70
200
60
bez PHA
p<0,01
p<0,05
150
50
40
100
eo
30
20
50
10
Hodowla:
p<0,02
nly
IL-6 x 103 [pg]
300
bez PHA
-d
istr
Ryc. 1. Średnie stężenia IL-8 wydzielanej przez komórki nabłonka prawidłowego krtani oraz komórki guza nowotworowego w
układach bez stymulacji i po stymulacji PHA
PMBCs
MLNCc
MLTmC
us
-
MLTCc
on
al
Ryc. 2. Średnie stężenie IL-6 w badanych układach komórkowych (hodowlach mieszanych) bez stymulacji PHA
is c
op
y is
for
pe
rs
autologiczne limfocyty T krwi obwodowej i autologiczne komórki nowotworowe guza w obecności
PHA (MLTCCPHA, MLTmCPHA), autologiczne limfocyty T krwi obwodowej i autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka w obecności
PHA (MLNCCPHA). Oceniono również wydzielanie
cytokin przez limfocyty niestymulowane i stymulowane PHA (PBMCs, PBMCSPHA) oraz autologiczne
komórki guza (TmC, TcC) i autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka (NCC).
Komórki były inkubowane przez 21 godzin w temp.
37°C, w atmosferze 5% CO2. W nadsączach komórkowych (1 x 106 komórek PBMCs i 1 x 105 komórek
nowotworowych) oceniono wydzielanie wybranych
cytokin: IL-6 i IL-8. Stężenie cytokin określone zostało metodą Elisa (Enzyme Linked Immuno Absorbent
Assay) – z zastosowaniem zestawu BD optEIA firmy
Pharmingen, zgodnie z procedurą podaną przez
Hodowla:
PMBCs
MLNCc
MLTmC
MLTCc
Ryc. 3. Średnie stężenie IL-8 w badanych układach komórkowych (hodowlach mieszanych) bez stymulacji PHA
producenta. Absorbancję próbek odczytywano przy
użyciu czytnika Elx808, Bio-Tek Instruments, USA.
Badania immunologiczne wykonano w Zakładzie
Immunologii Klinicznej Instytutu Centrum Zdrowia
Matki Polki w Łodzi. W analizie statystycznej uzyskanych wyników zastosowano nieparametryczny
test rangowanych znaków U Manna-Withney’a, przy
poziomie istotności p = 0,05.
WYNIKI
W badanej grupie chorych było 6 mężczyzn
(85,7%) i jedna kobieta (14,3%). Wiek wahał się od
50 do 72 lat (śr. 58 + 3 lata). Ustalenie pierwotnej
lokalizacji nowotworu możliwe było u 4 badanych
(57,1%). Największą grupę stanowili pacjenci z
rakiem płaskonabłonkowym krtani wywodzącym
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
z PHA
100
Hodowla:
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
120
bez PHA
0
-
ed
.
120
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
K. Starska i inni
628
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 4
Układ bez stymulacji
średnie stężenie [pg]
±SD [pg]
25593,0
22617,0
54452,6
27933,9
42025,7
32357,2
50627,6
41404,6
Układ ze stymulacją PHA
średnie stężenie [pg]
±SD [pg]
86295,9
57269,6
152097,9
123689,8
57737,6
29806,2
93493,1
55761,5
Tabela II. Średnie stężenia IL-8 w nadsączach komórkowych w badanych układach
is c
op
y is
for
pe
rs
on
-d
istr
oraz 239248,6 ± 112893,7 pg dla limfocytów stymulowanych PHA. W przeprowadzonych badaniach
stwierdzono brak wydzielania IL-6 przez komórki
nabłonka prawidłowego, jak i komórki guza nowotworowego. Średnie wartości stężeń IL-8 w nadsączach komórkowych autologicznych komórek guza
(TmC, TcC) i autologicznych komórek niezmienionego nowotworowo nabłonka (NCC) przedstawiono na ryc. 1. Analiza statystyczna nie wykazała
występowania istotnych różnic (p > 0,05) między
stężeniami badanych cytokin wydzielanych przez
komórki NCC, TmC i TcC dla IL-8.
Przeprowadzone badania wstępne pozwoliły na
oznaczenie stężeń IL-6 i IL-8 w wybranych układach
bez stymulacji i po stymulacji PHA. W badanych
układach z wykorzystaniem komórek nabłonka krtani, stężenia analizowanych cytokin różniły się w
zależności od tego, czy limfocyty krwi obwodowej
zostały poddane inkubacji z komórkami niezmienionego nabłonka krtani (MLNCC), komórkami nowotworowymi obrzeża (MLTmC) czy centrum (MLTcC)
guza, zarówno w układach bez stymulacji, jak i pod
wpływem działania PHA. Średnie wartości stężeń
IL-6 i IL-8 w nadsączach komórkowych w badanych
układach bez stymulacji i po stymulacji PHA przedstawiono w tab. I i II.
Ocena statystyczna stężeń wydzielanych cytokin
przez limfocyty T pod wpływem obecności komórek
nabłonka krtani w poszczególnych układach komórkowych wykazała:
– istotny statystycznie wzrost wydzielania IL-6
przez limfocyty T krwi obwodowej w hodowli z
komórkami nabłonka prawidłowego krtani w porównaniu ze stężeniem IL-6 w nadsączach hodowli
samych limfocytów T (PBMCs v MLNCC) (p < 0,02)
w układzie bez stymulacji;
nly
al
us
się z okolicy nadgłośniowej i jednocześnie zajmującym wszystkie piętra krtani – 6 chorych (85,7%).
Rozległość zmian nowotworowych, określonych
zgodnie z kryteriami klasyfikacji TNM, przedstawiała się następująco: guzy T4 – 3 chorych (42,8%), T3
– 4 (57,2%), NO – 3 (42,8%), N1 – 2 (28,6%), N2 – 1
(14,3%) oraz N3 – 1 pacjent (14,3%). Najliczniejszą
grupę stanowili chorzy z IV stopniem zaawansowania procesu nowotworowego S – 4 pacjentów
(57,2%). Wszyscy pacjenci zostali zakwalifikowani do całkowitego usunięcia krtani. Radioterapia
jako leczenie uzupełniające była zastosowana u 5
pacjentów (71,4%) ze względu na rozległość guza
pierwotnego. W analizowanej grupie 7 chorych
laryngektomię całkowitą poszerzono o wykonanie
operacji węzłowej, w tym u 4 chorych (57,4%)
wykonano jednostronną limfadenektomię, a u 2
pacjentów (28,6%) obustronną limfadenektomię, u
1 chorego operację Crile’a (14,3%). Na podstawie
badania patomorfologicznego materiału operacyjnego zanotowano, że najczęstszym typem histologicznym raka płaskonabłonkowego krtani były postacie
średnio- i niskozróżnicowane G2 i G3 (85,6%). W
ocenie morfologicznej węzłów chłonnych obecność
przerzutów choćby do jednego węzła przyjmowano jako wykładnik rozprzestrzeniania nowotworu.
Przerzuty do węzłów chłonnych stwierdzono u 4
(57,1%) chorych.
Analiza wydzielanych cytokin w przeprowadzonych badaniach wstępnych wykazała, że średnie
stężenie IL-6 w nadsączach hodowli limfocytów T
niestymulowanych wynosiło 25593,0 ± 22617,0
pg oraz w hodowli limfocytów stymulowanych
PHA 86295,9 ± 57269,6 pg. Średnie stężenia IL-8
w tych układach wynosiły odpowiednio 50344,3
± 26797,4 pg dla limfocytów T niestymulowanych
Układ ze stymulacją PHA
średnie stężenie [pg]
±SD [pg]
239248,6
112893,7
205342,9
77798,0
142558,6
84786,7
183871,4
56069,0
ibu
Układ bez stymulacji
średnie stężenie [pg]
±SD [pg]
50344,3
26797,4
165557,1
85582,0
122259,3
68371,3
165642,9
64648,3
eo
Hodowle komórkowe
PMBCs
MLNCC
MLTmC
MLTcC
tio
np
roh
ibit
Hodowle komórkowe
PMBCs
MLNCC
MLTmC
MLTcC
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 4
-
ed
.
Tabela I. Średnie stężenia IL-6 w nadsączach komórkowych w badanych układach
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
Ocena wydzielania cytokin prozapalnych
629
is c
op
y is
for
pe
rs
ed
.
ibu
-d
istr
nly
on
al
us
eo
DYSKUSJA
Zgodnie z hipotezą, że komórki nowotworowe
różnego pochodzenia mogą wpływać na funkcję
komórek immunokompetentnych krwi krążącej oraz
mikrośrodowiska guza, jak również modyfikować
mechanizmy immunologiczne w hodowlach pierwotnych i w układach doświadczalnych na liniach
komórkowych, w przeprowadzonych przez nas
badaniach in vitro wykazaliśmy zdolność komórek
raka płaskonabłonkowego krtani do modyfikacji
wydzielania przez limfocyty T wybranych cytokin
prozapalnych II-8 i IL-6. Wielu autorów potwierdza te spostrzeżenia w badaniach przeprowadzonych w guzach różnego pochodzenia, w tym w
nowotworach regionu głowy i szyi [1, 2, 4, 7–10,
12–15, 18–22]. W naszych badaniach potwierdziliśmy wydzielanie przez komórki nowotworowe IL-8,
ale nie IL-6. W wielu pracach badacze wykazali
możliwość wykrycia różnych cytokin prozapalnych
i immunoregulatorowych, m.in. IL-1a, IL-1b, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa w homogenatach guzów
nowotworowych, pierwotnych kulturach komórkowych, a także w surowicy pacjentów [1, 2, 7–22].
Fukuyama i wsp. [1] zanotowali, w badaniach przeprowadzonych na liniach komórkowych raka płuca,
że IL-6 wytwarzana była w 55%, a IL-8 aż w 94%
linii komórkowych. Chen i wsp. [14] również zanotowali wydzielanie cytokin prozapalnych i proan-
giogennych IL-1, IL-6, IL-8, VEGF i GM-CSF przez
komórki hodowli pierwotnych raków regionu głowy
i szyi. Nie potwierdzili jednak wytwarzania cytokin
TNFa, IL-2, IL-12, IL-4, IL-10 w supernatantach
hodowli komórkowych. W analizowanych przez nas
przypadkach, zarówno stężenie prozapalnej IL-6,
jak i IL-8 wydzielanej przez limfocyty T wzrastało w
hodowli pierwotnej z komórkami nowotworowymi.
Rolę cytokin w onkogenezie i supresji odpowiedzi
immunologicznej w nowotworach regionu głowy
i szyi potwierdzili również w swych badaniach
Pries i wsp. [2], oceniając poziom sekrecji IL-6, IL-8,
IL-4 i IL-10 w supernatantach linii komórkowych.
W wielu badaniach analizowano poziom ekspresji
wybranych cytokin w surowicy pacjentów leczonych z powodu nowotworów o różnej lokalizacji,
jako wskaźnika przebiegu procesu nowotworowego.
Lathers i wsp. [9, 12] zanotowali podwyższone stężenie IL-4, IL-6 i IL-10 w zaawansowanych rakach
płaskonabłonkowych regionu głowy i szyi. Podobnie
Pignataro i wsp. [13] zanotowali nadekspresję cytokin, tj. IL-6, IL-10 i IL-12 w grupie pacjentów z
rakiem krtani. Chen i wsp. [14] analizując poziom
cytokin prozapalnych i immunoregulatorowych w
surowicy chorych z rakami głowy i szyi, potwierdzili wysokie stężenia cytokin IL-6, IL-8 i VEGF.
Wielu autorów podkreśla znaczenie cytokin
prozapalnych w regulowaniu mechanizmów związanych z progresją guza i dalszą prognozą u
pacjentów z chorobą nowotworową [2, 4–10, 12,
14, 16–20]. Podwyższone stężenia cytokin IL-6 i
IL-8 w modelu in vivo raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz rolę interleukin prozapalnych jako czynników sprzyjających występowaniu
przerzutów wykazali Wolf i wsp. [4]. Znaczenie
wydzielanych cytokin, w tym prozapalnych (IL-2,
IL-6, IL-8, IL-12 i IFNg), w progresji guza i powstawaniu przerzutów w raku trzustki potwierdzili
również Bellona i wsp. [7]. Pries i wsp. [5, 6] również podkreślili istotne znaczenie cytokin zapalnych i proangiogennych w regulacji agresywności
wzrostu guza nowotworowego oraz odpowiedzi
na leczenie (radio- i chemioterapię). Liczni badacze poszukują związku poziomu wydzielanych
cytokin przez limfocyty krwi obwodowej, jak i
podścieliska nowotworowego z przebiegiem klinicznym choroby oraz rozległością miejscową i
węzłową guza [9, 10, 12, 15–20]. W badanej przez
nas grupie wszyscy pacjenci charakteryzowali się
wysokim stopniem klinicznego zaawansowania
nowotworu (pT3, pT4) i u wszystkich stwierdziliśmy wzmożone wytwarzanie IL-6 i IL-8,
tio
np
roh
ibit
– brak znaczącego statystycznie wzrostu stężenia
IL-6 przez limfocyty T w hodowli z komórkami centrum i obrzeża guza zarówno w układach bez stymulacji, jak i pod wpływem PHA (p > 0,05);
– znamienny wzrost stężenia IL-8 w nadsączach
hodowli limfocytów T z komórkami nabłonka prawidłowego w porównaniu ze stężeniem IL-8 w nadsączach hodowli samych limfocytów T (PBMCs v
MLNCC) (p<0,02) w układzie bez stymulacji.
Porównując wartości stężeń IL-8 w hodowlach
mieszanych limfocytów T z komórkami guza nowotworowego zanotowano istotny statystycznie wzrost
wydzielania IL-8 przez limfocyty T krwi obwodowej
w hodowli z komórkami centrum guza (PBMCs
v MLTcC) (p < 0,05) oraz w hodowli z komórkami obwodu guza (PBMCs v MLTmC) (p < 0,01).
Obecność PHA w badanych układach pozostawała
bez znamiennego wpływu na stężenia wydzielanej przez limfocyty T cytokiny (p > 0,05). Wyniki
analizy statystycznej stężeń IL-6 i IL-8 w badanych
układach przestawiono na ryc. 2.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
K. Starska i inni
630
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 4
ed
.
nly
-d
istr
ibu
tio
np
roh
ibit
1. W przeprowadzonych badaniach in vitro,
komórki nabłonka prawidłowego krtani oraz centrum i obrzeża guza nowotworowego mają zdolność
wydzielania cytokiny prozapalnej IL-8. Nie stwierdzono jednak zdolności komórek nabłonka krtani do
wytwarzania IL-6.
2. W badanych hodowlach mieszanych komórki
raka płaskonabłonkowego krtani wykazują wpływ
na aktywność limfocytów T krwi obwodowej, modyfikując wydzielanie przez nie cytokin prozapalnych
IL-6 i IL-8.
2. Obecność w hodowli limfocytów T komórek
prawidłowego nabłonka krtani oraz komórek centrum i obrzeża guza powoduje zwiększone wydzielanie IL-6 i IL-8, najwyraźniej zaznaczone w kontakcie
z komórkami nabłonka prawidłowego krtani.
3. Stymulacja PHA hodowli komórkowych w
badanych układach nie wpływa na wzrost stężeń
wydzielanych przez limfocyty T krwi obwodowej
IL-6 i IL-8.
eo
PIŚMIENNICTWO
al
on
pe
rs
for
y is
op
is c
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 4
-
WNIOSKI
us
pod wpływem obecności w hodowli mieszanej
komórek nowotworowych. Lathers i wsp. [9, 132]
w badaniach ekspresji cytokin: IL-2, IFNg, IL-4,
IL-6, IL-10 w rakach płaskonabłonkowych regionu głowy i szyi także potwierdzili występowanie
związku stężenia cytokin w surowicy krwi chorych i zaawansowania zmian nowotworowych T
i N. Autorzy zanotowali wzrost wydzielania badanych cytokin wraz z wyższym stopniem zaawansowania zmian. Podobnie, wysokie stężenia IL-6
w surowicy krwi pacjentów z zaawansowanym
rakami płaskonabłonkowymi regionu głowy i szyi
zanotowali Sparano i wsp. [10]. Autorzy potwierdzili wzmożone wydzielanie IL-6 i IL-10 w badanej
grupie chorych, a wzrost stężenia cytokin korelował z wyższym stopniem cechy T i N. Heimdal
i wsp. [16] również stwierdzili znacznie wyższy
poziom INFg i IL-2 w surowicy pacjentów z nowotworami charakteryzującymi się przerzutami do
węzłów chłonnych. Nie potwierdzili jednak takiej
zależności dla IL-4. Inni badacze także zanotowali
związek miejscowej rozległości nowotworu i klinicznego stadium choroby ze stężeniem cytokin
wykrywanych w surowicy pacjentów z chorobą
nowotworową [17–20]. Chora i wsp. [18] zaobserwowali podwyższone poziomy IL-8 i IL-10 w stadium IIS i IIIS inwazyjności nowotworu w badanej grupie chorych, natomiast poziom IL-6 i TNFa
był istotnie podwyższony dla nowotworów IS-IVS.
Podobnie Oka i wsp. [19] zanotowali podwyższony poziom ekspresji IL-6 i korelację stężenia
tej cytokiny ze stopniem zaawansowania zmian
nowotworowych i prognozą u pacjentów z rakiem
płaskonabłonkowym przełyku. Ueda i wsp. [20]
potwierdzili zastosowanie oznaczania stężenia
w surowicy chorych IL-6 i IL-8 jako wskaźników
przebiegu choroby nowotworowej u pacjentów z
rakiem jelita grubego. Badacze zanotowali znamienny związek poziomu IL-8 w surowicy z histologicznym typem guza i stopniem zaawansowania
zmian oraz wykazali korelację wysokiego stężenia
IL-6 i IL-8 z obecnością przerzutów węzłowych.
Należy podkreślić, że w pracy przedstawiono
wyniki badań wstępnych. W celu ustalenia rzeczywistego wpływu komórek nowotworowych na
komórki immunokompetentne gospodarza, tj. funkcję limfocytów T (limfocyty pomocnicze – limfocyty cytotoksyczne) oraz modyfikację wydzielanych
przez nie cytokin konieczna jest izolacja czystych
subpopulacji limfocytów CD4+ i CD8+, a następnie poddanie ich inkubacji z komórkami nowotworowymi w proponowanych układach badawczych.
01. Fukuyama T, Ichiki Y, Hamada S, Shigematsu Y, Baba T,
Nagata Y, i wsp. Cytokine production of lung cancer celil
lines: correlation between their production and the inflammatory/immunological responses both in vivo and in vitro.
Cancer Sci 2007; May 20 [Epub ahead of print].
02. Pries R, Thiel A, Brocks C, Woldenberg B. Secretion of tumorpromoting and immune suppressive cytokines by cell lines of
head and neck squamous cell carcinoma. In Vivo 2006; 20(1):
45-48.
03. Jiang C, Ye D, Qiu W, Zhang X, Zhang Z, He D, i wsp. Response
of lymphocyte subsets and cytokines to Shenyang prescription
in Sprague-Dawley rats with tongue squamous cell carcinomas
induced by 4NQO. BMC Cancer 2007; 5(7): 40.
04. Wolf JS, Li G, Varadhachary A, Petrak K, Schneyer M, Li D, i
wsp. Oral lactoferrin results in T-cell dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo. Clin
Cancer Res. 2007; 13(5): 1601-1610.
05. Pries W, Wollenberg B. Cytokines in head and neck cancer.
Cytokine Growth Factor Rev 2006; 17(3): 141-146.
06. Pries R, Nitsch S, Wollenberg B. Role of cytokines in head and
neck squamous cell carcinoma. Expert Rev Anticancer Ther.
2006; 6(9): 1195-1203.
07. Bellone G, Smirne C, Mauri FA, Tonel T, Carbone A, Buffolino
A, i wsp. Cytokine expression profile in human pancreatic
carcinoma cells and in surgical specimens: implications for
survival. Cancer Immunol Immunother. 2005; 11: 1-15.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
Ocena wydzielania cytokin prozapalnych
631
ed
.
tio
np
roh
ibit
ibu
-d
istr
nly
eo
us
al
on
pe
rs
Adres autora:
dr n. med. Katarzyna Starska
Katedra Otolaryngologii UM
ul. Kopcińskiego 22
90-153 Łódź
Pracę nadesłano: 13.05.2007 r.
Th
is c
op
y is
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
lymphocytes in patients with head and neck carcinoma. Acta
Otoalryngol. 1998; 118(6): 887-891.
17. Karcher J, Reissem C, Daniel V, Herold-Mende C. Cytokine
expression of transforming growth factor-beta2 and interleukin-10 in squamous cell carcinomas of the head and neck.
Comparison of tissue expression and serum levels. HNO 1999;
47(10): 879-884.
18. Chopra V, Dinh TV, Hannigan EV. Circulating serum levels
of cytokines and angiogenic factors in patients with cervical
cancer. Cancer Invest. 1998; 16(3): 152-159.
19. Oka M, Yamamoto K, Takahashi M, Hakozaki M, Abe T, Lizuka
N, i wsp. Relationship between serum levels of interleukin6, various disease parameters and malnutrition in patients
with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res. 1996;
56(12): 2776-2780.
20. Ueda T, Shimada E, Urakawa T. Serum levels of cytokines
in patients with colorectal cancer: possible involvement of
interleukin-6 and interleukin-8 in hematogenous metastasis. J
Gastroenterol. 1994; 29(4): 423-429.
21. Chen Z, Colon I, Ortiz N, Callister M, Dong G, Pegram MY, i
wsp. Effects of interleukin-1a, interleukin-1 receptor antagonist and neutralizing antibody on proinflammatory cytokine
expression by human squamous cell carcinoma lines. Cancer
Res. 1998; 58: 3668-3676.
22. Woods KV, El-Nagger A, Clayman G, Grimm EA. Variable
expression of cytokines in human head and neck squamous
cell carcinoma cell lines and consistent expression in surgical
specimens. Cancer Res. 1998; 58: 3132–3141.
for
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
08. Thomas GR, Chen Z, Leukinova E, Van Waes C, Wen J.
Cytokines IL-1 alpha, IL-6, and GM-CSF constitutively secreted by oral squamous carcinoma induce down-regulation
of CD80 costimulatory molekule’expression: restoration by
interferon gamma. Cancer Immunol Immunother. 2004; 53(1):
3-40.
09. Lathers DM, Young MR. Increased aberrance of cytokine
expression in plasma of patients with more advanced squamous cell carcinoma of head and neck. Cytokine 2004; 7, 25(5):
220-228.
10. Sparano A, Lathers DM, Achilles IM, Petruzzelli GJ, Young
MR. Modulation of Th1 and Th2 cytokine profiles and their
association with advanced head and neck squamous cell carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 2004; 131(5): 573-576.
11. Toutirais O, Chartier P, Dubois D, Bouet F, Leveque J, CatrosQuemener V, i wsp. Constitutive expression of TGF-beta1,
interleukin-6 and interleukin-8 by tumor cells as a major
component of immune escape in human ovarian carcinoma.
Eur Cytokine Netw. 2003; 14(4): 246-255.
12. Lathers DM, Achille NJ, Young MR. Incomplete Th2 skewing
of cytokines in plasma of patients with squamous cell carcinoma of head and neck. Hum Immunol. 2003; 64(12): 11601166.
13. Pignataro L, Corsi MM, Sambataro G, Porcaro L, Tredici P,
Broich G. Plasmatic cytokine network in patients with laryngeal carcinoma after surgical treatment. Anticancer Res. 2001;
21(5): 3621-3625.
14. Chen Z, Malhotra PS, Thomas GR, Ondrey FG, Duffey DC,
Smith CW, i wsp. Expression of proinflammatory and proangiogenic cytokines in patients with head and neck cancer. Clin
Cancer Res. 1999; 5(6): 1369-1379.
15. Ku JL, Kim WH, Lee JH, Park HS, Kim HM, Sung MW, i wsp.
Establishment and characterization of human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines. Larygoscope 1999; 109(6):
976-982.
16. Heimdal JH, Aarstad HJ, Klementsen B, Oloffson J. Disease
stage related in vitro responsiveness of peripheral blood T-
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
K. Starska i inni
632
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 4