(Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS524

FLEX
Polyclonal Rabbit
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS524
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer
Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus.
Kwaśne białko włókienkowe gleju (Glial fibrillary acidic protein, GFAP) jest głównym filamentem pośrednim dojrzałych
astrocytów (1), a przeciwciało to przydatne jest w identyfikacji astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) w
warunkach prawidłowych i patologicznych (2 – 4). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być
uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być
przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań
diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
GFAP to cytopazmatyczne białko filamentowe o masie 50 kDa tworzące część cytoszkieletu w astrocytach, które
okazało się najbardziej swoistym znacznikiem komórek pochodzenia astrocytarnego. W centralnej domenie
pałeczkowej białko GFAP wykazuje znaczącą homologię strukturalną z innymi filamentami pośrednimi (5). W zakresie
funkcji uwaŜa się, Ŝe GFAP jest waŜne dla ruchomości i kształtu przez zapewnienie stabilności strukturalnej procesu
astrocytarnego (1). Na skutek urazu ludzkiego OUN wywołanego obraŜeniami, zaburzeniami genetycznymi lub
środkami chemicznymi astrocyty proliferują i wykazują rozległą hipertrofię masy komórkowej i procesów, przy
znaczącym zwiększeniu produkcji GFAP. W przeciwieństwie, ze wzrostem złośliwości astrocytów wiąŜe się postępujący
spadek produkcji GFAP. Tym samym złośliwe gwiaździaki posiadają mniej komórek nowotworowych o dodatnim,
intensywnym odczynie dla GFAP niŜ mniej złośliwe gwiaździaki i preparaty prawidłowej tkanki mózgowej (5).
Poza OUN czułe metody detekcji mogą wykazać obecność GFAP w komórkach Schwanna, komórkach gleju jelitowego,
nowotworach ślinianek i przerzutowych rakach nerek. Ponaddo immunoreaktywność GFAP wykazano w chrząsce
nagłośni, komórkach przysakdki, niedojrzałych oligodendrocytach, oponiakach brodawkowatych (1) i komórkach
mięśniowo-nabłonkowych piersi (6).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części
instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia poliklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Immunogen
GFAP izolowane z rdzenia kręgowego krowy.
Swoistość
Przeciwciało było poddawane absorpcji w fazie stałej z białkami surowicy ludzkiej i wołowej.
W immunoelektroforezie krzyŜowej z uŜyciem 50 µL stęŜonego przeciwciała na cm2 powierzchni Ŝelu nie
zaobserwowano reakcji z 2 µL osocza ludzkiego i 2 µL surowicy krowiej. Przeciwciało wykazuje jeden wyraźny
precypitat (GFAP) z ekstraktem krowiego mózgu. Barwnik: Coomassie Brilliant Blue.
W testach wykonywanych pośrednią metodą ELISA nie obserwuje się reakcji z ludzkim osoczem ani surowicą wołową.
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się w
wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x)
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010/K8014).
(117801-003)
Dako Denmark A/S
IS524/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, które zostały odparafinowane, zalecany jest odczynnik Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101).
Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link.
Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target
Retrieval Solution, High pH (10x), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010/K8014). Dla aparatów PT Link
naleŜy stosować następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65 °C; temperatura i czas
odmaskowania antygenu: 97°C przez 20 (±1) minut, oc hłodzić do 65°C. Usun ąć statywy na szkiełka aparatu
Autostainer wraz ze szkiełkami ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np.
PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX Wash Buffer (10x),
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010) o temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash
Buffer na 1 – 5 minut.
Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i
odmaskowanie moŜna wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje moŜna
znaleźć w Instrukcji uŜytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe naleŜy
poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako
Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych
odczynników)
Autoprogram: GFAP (bez barwienia kontrastowego) lub GFAPH (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku
programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy
płukania.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje
zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako
Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny
być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym
nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu
uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować mózg i okręŜnicę,
natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części
„Charakterystyka wydajnościowa” we wszystkich dodatnich preparatach. Zalecana kontrola ujemna to FLEX
Negative Control, Rabbit, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS600).
Interpretacja
wybarwienia
Komórki znakowane przez przeciwciało wykazują odczyn cytoplazmatyczny.
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: Przeciwciało znakuje astrocyty w mózgu (3), komórki gwiaździste przysadki mózgowej (7), komórki
Schwanna i komórki gleju jelitowego. Dodatkowo znakowane są komórki mięśniowo-nabłonkowe piersi (6). W mózgu
astrocyty wykazują odczyn z zakresu od umiarkowanego do silnego. W okręŜnicy komórki zwojów nerwowych w
splocie Auerbacha i Meissnera wykazują odczyn słaby do umiarkowanego. Nie zaobserwowano odczynu w
pęcherzu, tkance łącznej, wątrobie, tkance limfatycznej, mięśniach, trzustce, skórze i moczowodzie.
Tkanki patologiczne: Przeciwciało oznakowało wszystkie 23 glejaki wielopostaciowe (GBM). Dla 20 z 23 GBM
przynajmniej 50% komórek złośliwych dało wynik dodatni dla GFAP. Oznaczono tylko 3 z 22 przypadków raka z
przerzutami do mózgu. Odczyn był zogniskowany i ograniczony do mniej niŜ 10% komórek złośliwych (3). 5/5
gwiaździaków półkulowych rzadkiego typu ziarnistego wykazało skupiony odczyn dodatni GFAP z przeciwciałem (4),
które znakowało równieŜ 7/7 Ŝółtakogwiaździaków pleomorficznych (8), oraz komórki gwiaździste płata przedniego w
20/20 nowotworów przysadki mózgowej (7). W rdzeniaku (MB) desmoplastycznym przeciwciało oznakowało 8/11
przypadków. Odczyn występował w postaci skupionych obszarów komórek GFAP-dodatnich o mofrologii
nowotworowej. Tylko 4/31 odmiany „klasycznej” wykazało ten rodzaj komórek nowotworowych, ale w klasycznych
MB komórki GFAP-dodatnie o morfologii reaktywnych astrocytów zaobserwowano w 27/31 przypadków (9).
Wykazano równieŜ, Ŝe przeciwciało znakuje 15/38 nerwiaków osłonkowych (38%) i 2 przypadki nerwiakowłókniaków
splotowatych, podczas gdy 16 przypadków nerwiakowłókniaków skórnych dało wynik ujemny (10). W róŜnych
chorobach piersi pochodzenia nowotworowego i pozanowotworowego procent komórek mięśniowo-nabłonkowych
reagujących z przeciwciałem był znacząco zwiększony w stosunku do piersi prawidłowej, podczas gdy odczynu
dodatniego nie stwierdzono w złośliwych komórkach 183 raków piersi róŜnych typów (6). W badaniu, którym objęto
36 pacjentów przeciwciało nie znakowało oponiaków (11).
Piśmiennictwo
(117801-003)
Dako Denmark A/S
1.
Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem
Res 2000;25:1439-51.
2.
Reske-Nielsen E, Oster S, Reintoft I. Astrocytes in the prenatal central nervous system. Acta path microbiol
immunol scand Sect. A 1987;95:339-46.
3.
Oh D, Prayson RA. Evaluation of epithelial and keratin markers in glioblastoma multiforme. An immunohistochemical study. Arch Pathol Lab Med 1999;123:917-20.
IS524/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
4.
Geddes JF, Thom M, Robinson SFD, Revesz T. Granular cell change in astrocytic tumors. Am J Surg Pathol
1996;20:55-63.
5.
Rutka JT, Murakami M, Dirks PB, Hubbard SL, Becker LE, Fukuyama K, et al. Role of glial filaments in cells and
tumors of glial origin: a review. J Neurosurg 1997;87:420-30.
6.
Viale G, Gambacorta M, Coggi G, Dell'Orto P, Milani M, Doglioni C. Glial fibrillary acidic protein
immunoreactivity in normal and diseased human breast. Virchows Arch A Pathol Anat 1991;418:339-48.
7.
Morris CS, Hitchcock E. Immunocytochemistry of folliculo-stellate cells of normal and neoplastic human
pituitary gland. J Clin Pathol 1985;38:481-8.
8.
Powell SZ, Yachnis AT, Rorke LB, Rojiani AM, Eskin TA. Divergent differentiation in pleomorphic xanthoastrocytoma. Evidence for a neuronal element and possible relationship to ganglion cell tumors. Am J Surg
Pathol 1996;20:80-5.
9.
Giangaspero F, Chieco P, Ceccarelli C, Lisignoli G, Pozzuoli R, Gambacorta M, et al. "Desmoplastic" versus
"classic" medulloblastoma: comparison of DNA content, histopathology and differentiation. Virchows Arch A
Pathol Anat 1991;418:207-14.
10. Kawahara E, Oda Y, Ooi A, Katsuda S, Nakanishi I, Umeda S. Expression of glial fibrillary acidic protein
(GFAP) in peripheral nerve sheath tumors. A comparative study of immunoreactivity of GFAP, vimentin, S-100
protein, and neurofilament in 38 schwannomas and 18 neurofibromas. Am J Surg Pathol 1988;12:115-20.
11. Thompson L, Bouffard JP, Sandberg GD, Mena H. Primary ear and temporal bone meningiomas: a
clinicopathologic study of 36 cases with a review of the literature. Mod Pathol 2003;16:236-45 Kawahara.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
(117801-003)
Dako Denmark A/S
IS524/PL/MNI/2009.12.04 str. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17