NA NERKĘ

ANNA STIEPANOW-TRZECIAK
UDZIAà RECEPTORÓW PURYNOWYCH
W DZIAàANIU NUKLEOTYDÓW
- Ap4A i ATP - NA NERKĉ
Praca doktorska
Praca wykonana
W Katedrze Analityki Klinicznej
Akademii Medycznej w GdaĔsku
Promotor:
Dr hab. Mirosáawa SzczepaĔska-Konkel
Profesor Nadzwyczajny
GDAēSK 2005
Mojemu Promotorowi,
Pani Profesor Mirosáawie SzczepaĔskiejKonkel, skáadam serdeczne podziĊkowania
Za wielką ĪyczliwoĞü, ogromną pomoc
i cenne rady podczas wykonywania tej
pracy.
Serdecznie dziĊkujĊ
Pani dr n.farm. Gabrieli Langner
Panu dr med. Maciejowi Jankowskiemu
za ĪyczliwoĞü oraz pomoc wykonywaniu
tej pracy
SPIS TREĝCI
1. STRESZCZENIE
5
2. WSTĉP
7
2.1 Wprowadzenie
7
2.2 Receptory purynowe P1 i P2 i ich lokalizacja w nefronie
8
2.3 Filtracja káĊbuszkowa i transport kanalikowy - potencjalna rola
nukleotydów adeninowych
12
2.4 Rola ukáadu wspóáczulnego w regulacji funkcji nerek
19
3. CEL PRACY
21
4. MATERIAà I METODY
22
4.1 Odnerwienie nerek
22
4.2 DoĞwiadczenia w klatkach metabolicznych
23
4.3 DoĞwiadczenia klirensowe
23
4.3.1 Metody analityczne
27
4.3.2 Obliczenia i symbole uĪyte w badaniach klirensowych
29
4.4 DoĞwiadczenia na izolowanych káĊbuszkach
33
4.4.1 Izolacja káĊbuszków nerkowych
34
4.4.2 Ocena jakoĞciowa i iloĞciowa otrzymanego preparatu
35
4.4.3 Inkubacja káĊbuszków nerkowych z testowanymi związkami
35
4.4.4 Pomiar objĊtoĞci wewnatrzkapilarnej káĊbuszków nerkowych 36
4.5 Obliczenia statystyczne
37
4.6 Odczynniki
37
5. WYNIKI
38
6. DYSKUSJA
62
7. WNIOSKI
71
8. PIĝMIENNICTWO
72
1. STRESZCZENIE
W pracy tej badano dziaáanie nukleotydów adeninowych – Ap4A
i ATP – naturalnych aktywatorów receptorów purynowych na funkcjĊ
wydalniczą nerek. DoĞwiadczenia przeprowadzono na znieczulonych
szczurach (Wistar, samce 200 – 250g), którym w infuzji doĪylnej
podawano Ap4A oraz analogi ATP: ȕ,Ȗ-metylenoATP (ȕ,Ȗ-MeATP) oraz
2-metylotioATP (2-MeSATP). Dodatkowo wykonano doĞwiadczenia na
izolowanych káĊbuszkach celem okreĞlenia wpáywu Ap4A na objĊtoĞü
wewnątrzkapilarną (GIS). DoĞwiadczenia wykazaáy, Īe:
1. Infuzja Ap4A (2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg) obniĪa GFR, RPF,
nie zmieniając Ğredniego ciĞnienia tĊtniczego krwi (MAP).
Wyliczono, Īe Ap4A zwiĊksza opór naczyĔ krwionoĞnych w
nerkach (RVR) z wartoĞci 7,0 ± 0,3 do 10,4 ± 0,6 mmHg/ml min
(p < 0,05). Natomiast Ap4A dodany do zawiesiny izolowanych
káĊbuszków nerkowych (w stĊĪeniu 10 nM) redukuje przestrzeĔ
wewnątrzkapilarną káĊbuszków (GIS) o okoáo 18 ± 2,6%
2. Infuzja Ap4A zwiĊksza wydalanie jonu sodowego (okoáo
5-krotnie) i diurezĊ (okoáo 2-krotnie), a dziaáanie to znosi
suramina - antagon receptorów P2.
3. Natriuretyczne i diuretyczne dziaáanie obserwowano równieĪ gdy
zwierzĊta otrzymywaáy ȕ,Ȗ-MeATP (agon receptorów P2X) lub
2-MeSATP (agon receptorów P2Y). Frakcyjne wydalanie sodu
wzrosáo okoáo 2-krotnie.
4. Infuzja Ap4A oraz testowanych analogów ATP powoduje
obniĪenie klirensu litu (CLi), wskaĨnika proksymalnej reabsorpcji
sodu.
5. Odnerwienie nerek zmienia odpowiedĨ nerek na dziaáanie Ap4A
i analogów ATP: natriuretyczne dziaáanie Ap4A i 2-MeSATP byáo
5
zniesione, podczas gdy dziaáanie ȕ,Ȗ-MeATP byáo okoáo 4-krotnie
zwiĊkszone.
DoĞwiadczenia te wskazują na potencjalną rolĊ receptorów P2X
i P2Y w regulacji diurezy i natriurezy oraz prĊdkoĞci przesączania
káĊbuszkowego. Ponadto wskazują na istnienie zaleĪnoĞci miĊdzy
aktywnoĞcią receptorów purynowych a ukáadem wspóáczulnym w
nerkach.
6
2. WSTĉP
2.1 Wprowadzenie
Nerki odgrywają kluczową rolĊ w utrzymaniu homeostazy
wodno-elektrolitowej organizmu. Podstawową czynnoĞcią nerek,
która zapewnia staáoĞü skáadu chemicznego i objĊtoĞü páynu
pozakomórkowego
jest
ich
funkcja
wydalnicza.
Funkcja
ta
uwarunkowana jest szeregiem procesów zachodzących w nerkach,
przede wszystkim sprawną hemodynamiką, tj. przepáywem krwi przez
nerki i filtracją káĊbuszkową oraz aktywnoĞcią kanalikowego systemu
transportowego. U zdrowego dorosáego czáowieka przez obie nerki
w ciągu jednej minuty przepáywa okoáo 1200 ml krwi (ok. 600 ml
osocza), z tego 100 ml osocza ulega przesączeniu i ostatecznie
powstaje okoáo 1 ml/min moczu, którego gáównymi skáadnikami są:
woda, koĔcowe produkty przemiany azotowej, nadmiar elektrolitów
(jony sodowe, potasowe, chlorkowe, fosforanowe) oraz inne zbĊdne
dla organizmu substancje. Zarówno nerkowa hemodynamika, jak
i kanalikowy transport jonów i wody podlegają regulacji endokrynnej
i parakrynnej. CzynnoĞü nerki, narządu bogato unerwionego,
w znacznym stopniu jest kontrolowana przez neurotransmitery ukáadu
sympatycznego [17].
Podstawową jednostką czynnoĞciową nerek jest nefron.
W początkowym jego odcinku – káĊbuszku nerkowym – zachodzi
proces filtracji osocza krwi przepáywającej przez sieü naczyĔ
kapilarnych do torebki Bowmana. W dalszych odcinkach nefronu –
kanaliku bliĪszym (proksymalnym) poáączonym poprzez pĊtlĊ
Henlego z kanalikiem dalszym (dystalnym i zbiorczym) – zachodzą
procesy wcháaniania zwrotnego (reabsorpcja) wody, elektrolitów,
7
metabolitów tj. aminokwasów, glukozy oraz sekrecja jonów
wodorowych,
i
potasowych
nieorganicznych.
W
i
anionów
warunkach
kwasów
organicznych
fizjologicznych,
dziĊki
mechanizmom równowagi káĊbuszkowo-kanalikowej i sprzĊĪeniu
kanalikowo-káĊbuszkowemu tempo filtracji káĊbuszkowej jest stale
dostosowywane do zdolnoĞci transportowych kanalika i odwrotnie,
wcháanianie zwrotne dostosowuje siĊ do tempa filtracji káĊbuszkowej
[7,27].
Procesy
te
mogą
byü
regulowane
m.in.
przez
zewnątrzkomórkowe nukleotydy adeninowe i adenozynĊ, które
oddziaáywują na komórki nefronu poprzez receptory purynowe
[46,51,52]. ObecnoĞü receptorów purynowych wykazano na caáej
dáugoĞci nefronu [76], jednak ich rola w regulacji funkcji nerek nie
jest w peáni wyjaĞniona.
2.2 Receptory purynowe P1 i P2 i ich lokalizacja w nefronie
Badania ostatnich kilkunastu lat dostarczają wiele danych na
temat roli pozakomórkowych nukleotydów – gáównie ATP i ADP,
a takĪe dinukleotydów adeninowych i ich produktu degradacji –
adenozyny
–
w
sygnaáowaniu
miĊdzykomórkowym.
Obecnie
wiadomo, Īe wiele róĪnych komórek i tkanek moĪe reagowaü na
pojawiające siĊ w Ğrodowisku zewnątrz-komórkowym nukleotydy i
nukleozydy.
W
1972
r.
Burnstock
zaproponowaá
istnienie
specyficznych báonowych receptorów dla ATP, a kilka lat póĨniej, na
podstawie kolejnych dowodów farmakologicznych nazwaá tĊ grupĊ
receptorów purynergicznymi i dokonaá ich pierwszego podziaáu [11].
Receptory purynergiczne, dla których naturalnym agonem jest
adenozyna, tworzą grupĊ receptorów P1, natomiast receptory dla ATP
tworzą grupĊ receptorów P2. PóĨniejsze badania wykazaáy, Īe do
8
grupy P2 naleĪą równieĪ receptory nukleotydów pirymidynowych,
takich jak UTP oraz UDP [23].
Receptory P1 - na podstawie badaĔ farmakologicznych
i biochemicznych, jak równieĪ w oparciu o analizĊ sekwencji
aminokwasów, receptory P1 - podzielono na cztery podtypy: A1, A2A,
A2B oraz A3 [34]. Receptory A1 i A2A cechują siĊ wysokim
powinowactwem do adenozyny (nM) natomiast receptory A2B oraz A3
cechują siĊ niskim powinowactwem do adenozyny (µM). Receptory
A1 związane są z podrodziną wraĪliwych na toksynĊ krztuĞca biaáek
G: Gi (hamujących aktywnoĞü cyklazy adenylanowej) oraz Go.
Gáównym efektem aktywacji receptorów A1 jest zahamowanie
aktywnoĞci cyklazy adenylanowej i obniĪenie poziomu cyklicznego
AMP w komórce. Receptory A1 mogą równieĪ hamowaü aktywnoĞü
fosfolipazy
C
typu
ȕ.
Z
kolei
receptory
typu
A2A
o wysokim powinowactwie do adenozyny oraz receptory typu A2B
o niskim powinowactwie do adenozyny związane są z podrodziną
biaáek G - Gs (stymulujące), które są wraĪliwe na toksynĊ cholery.
Wynikiem aktywacji tych biaáek jest stymulacja aktywnoĞci cyklazy
adenylanowej i zwiĊkszenie wytwarzania cyklicznego AMP –
wewnątrz-komórkowego przekaĨnika informacji. Z kolei receptor
typu A3, podobnie jak A1, jest związany gáównie z biaákiem Gi, czyli
biaákiem hamującym cyklazĊ adenylanową [28, 30].
Receptory P2 - na podstawie róĪnic w wewnątrzkomórkowym
mechanizmie przekazywania sygnaáu – podzielono na dwa podtypy:
P2X i P2Y [1]. Receptory P2X są kanaáami jonowymi bramkowanymi
ligandami
takimi
jak
ATP,
ADP.
Związanie
liganda
z receptorem prowadzi do otwarcia kanaáu jonowego i transportu
jonów Na+, K+, Ca2+ przez báonĊ komórkową. Receptory P2X
wystĊpują na komórkach pobudliwych, takich jak komórki miĊĞni
9
gáadkich, czy neurony oraz na komórkach glejowych [49].
Są odpowiedzialne za skurcz miĊĞni gáadkich, szczególnie w ukáadzie
naczyniowym oraz w pĊcherzu moczowym. Biorą udziaá w procesach
neurotransmisji [10]. Obecnie wyodrĊbniono 7 podtypów receptorów
P2X
(1-7).
Wiele z nich zlokalizowano na komórkach kanalików
nerkowych [62,63]. Receptory P2Y, tzw. metabotropowe, naleĪą do
grupy receptorów związanych z biaákiem G. Aktywacja receptorów
P2Y prowadzi do uruchomienia kaskady wtórnych przekaĨników
informacji. Za poĞrednictwem biaáek G zostaje uruchomiona
fosfolipaza C (PLC), która hydrolizuje fosfatydylo-inozytolo-(4,5)difosforan (PIP2) do diacyloglicerolu (DAG) i inozytolo-(1,4,5)trifosforanu (IP3). DAG z kolei aktywuje kinazĊ biaákową C,
natomiast IP3 dziaáa na receptory znajdujące siĊ w báonie siateczki
Ğródplazmatycznej. W wyniku dziaáania IP3 dochodzi do uwalniania
wapnia z wewnątrz-komórkowych magazynów, co w konsekwencji
prowadzi do wzrostu stĊĪenia jonów wapnia w cytoplazmie.
W nerkach receptory P2Y wystĊpują zarówno na komórkach
mikronaczyĔ oraz komórkach kanalików [62,63]. Badania ostatnich
lat wykazaáy, Īe w nerkach aktywacja receptorów P2Y prowadzi do
skurczu, bądĨ rozkurczu naczyĔ doprowadzających i naczyĔ
kapilarnych káĊbuszka nerkowego [32,67], co w konsekwencji rzutuje
na prĊdkoĞü przesączania káĊbuszkowego.
10
TĊtniczka
odprowadzająca:
P2Y1
Kanalik proksymalny:
S2: P2Y1,2,4,6,P2X1,4-6
S3: P2Y1, P2X5
Kanalik dystalny:
P2Y2, P2X4-6
KáĊbek
nerkowy:
P2Y1,2,6,
P2X2,4
Gruba czĊĞü
wstĊpującej
pĊtli Henlego:
P2Y2, P2X5-6
TĊtniczka
doprowadzająca:
P2Y1,2,11, P2X1-2
Cienka czĊĞü
zstĊpującej
pĊtli Henlego:
P2Y1-2,6, P2X6
Kanalik
zbiorczy:
P2Y1,2,4,6,
P2X3-6
Cienka czĊĞü
wstĊpującej
Petli Henlego:
P2Y2,4, P2X6
PĊtla Henlego
Schemat 1. Lokalizacja receptorów P2 (X i Y) w obrĊbie nefronów
Na komórkach káĊbuszka nerkowego i tĊtniczki doprowadzającej są
obecne receptory P2X i P2Y, a na tĊtniczce odprowadzającej – P2Y.
Na komórkach kanalika proksymalnego – gáównie w odcinku drugim
(S2) i odcinku trzecim (S3) wystĊpują receptory P2X i P2Y.
Receptory te wystĊpują równieĪ na komórkach pĊtli Henlego –
cienkim ramieniu zstĊpującym i wstĊpującym, grubej czĊĞci ramienia
wstĊpującego oraz dalszych odcinkach – tj. kanaliku dystalnym i
kanaliku zbiorczym. (ħródáo: Unwin R., Bailey M., Burnstock G.:
Purinergic Signaling Along the Renal Tubule: The Current State of
Play; News Physiol Sci 18: 237-241, 2003)
11
2.3 Filtracja káĊbuszkowa i transport kanalikowy - potencjalna
rola nukleotydów adeninowych
Pierwszy etap tworzenia moczu zachodzi w káĊbuszkach
nerkowych. KáĊbuszek wchodzi w skáad sieci naczyĔ tĊtniczych nerki.
TĊtniczka doprowadzająca káĊbka rozwidla siĊ w przestrzeni
ograniczonej torebką Bowmana, tworząc pĊczek naczyĔ kapilarnych,
które ponownie áączą siĊ w tĊtniczkĊ odprowadzającą káĊbuszka,
dając początek naczyniu okoáo-kanalikowemu. PrzestrzeĔ torebki
káĊbuszka
w
swoim
biegunie
przeciwlegáym
do
bieguna
naczyniowego, przechodzi w kanalik. Osocze krwi páynącej
naczyniami wáosowatymi káĊbuszków nerkowych ulega przesączaniu
przez ĞcianĊ tych naczyĔ do torebki Bowmana. PrĊdkoĞü filtracji
káĊbuszkowej
(ang,
glomerular
filtration
rate;
GFR)
jest
determinowana przez efektywne ciĞnienie filtracyjne, które stanowi
róĪnicĊ miĊdzy ciĞnieniem hydrostatycznym w Ğwietle naczyĔ
kapilarnych káĊbuszka, a przeciwstawnym ciĞnieniem onkotycznym
osocza i hydrostatycznym przesączu. Tempo filtracji zaleĪy teĪ od
efektywnej wielkoĞci powierzchni sączącej i jej przepuszczalnoĞci,
liczbowo wartoĞci te opisuje wspóáczynnik filtracyjny (Kf) [2].
W warunkach doĞwiadczalnych wykazano, Īe zarówno efektywne
ciĞnienie filtracyjne, jak i wielkoĞü powierzchni filtracyjnej oraz jej
przepuszczalnoĞü podlegają regulacji. W regulacji tempa filtracji
káĊbuszkowej uczestniczą komórki, które są efektorami skurczu
i relaksacji. Do nich naleĪą komórki miĊĞniówki gáadkiej tĊtniczek
doprowadzających i odprowadzających káĊbuszka, które poprzez
skurcz i relaksacjĊ zmieniają opornoĞü naczyniową. DziĊki temu
regulują przepáyw krwi przez káĊbuszki i ciĞnienie hydrostatyczne w
Ğwietle naczyĔ kapilarnych – gáówną siáĊ napĊdzającą przesączanie.
12
Odpowiednikiem tych komórek w káĊbuszku są mezangiocyty, które
wraz z macierzą pozakomórkową tworzą mezangium [36]. Efektorami
skurczu są równieĪ podocyty [48]. Mezangiocyty i podocyty wraz z
Ğródbáonkiem naczyĔ i báoną podstawną tworzą ĞcianĊ naczyĔ
kapilarnych káĊbuszka. Mezangiocyty poprzez moĪliwoĞü skurczu
i relaksacji regulują przepáyw krwi przez naczynia kapilarne oraz
zmniejszają i zwiĊkszają powierzchniĊ filtracyjną. Podocyty w Ğwietle
ostatnich badaĔ są komórkami zdolnymi do skurczu izomerycznego,
co umoĪliwia utrzymanie kulistego ksztaátu káĊbuszka nerkowego
[37]. Na powierzchni komórek kurczliwych káĊbuszka wykazano
szereg receptorów dla substancji naczynioruchowych (obkurczających
i rozkurczających) takich jak angiotensyna II [8,21], wazopresyna [4],
endotelina [64], peptydy natriuretyczne [68,78], prostaglandyny [19],
dopomina [12], ATP [60], adenozyna [50]. Wykazano równieĪ, Īe
stopieĔ obkurczenia komórek mezangialnych i podocytów jest
regulowany
aktywnoĞcią
komórek
Ğródbáonkowych
káĊbuszka,
zdolnych do produkcji i wydzielania związków o wáaĞciwoĞciach
parakrynnych.
Komórki
te
pod
wpáywem
sygnaáów
zewnątrzkomórkowych wydzielają miĊdzy innymi tlenek azotu [65],
prostacyklinĊ [26], czynniki dziaáające rozkurczająco na komórki
kurczliwe káĊbuszka. DziĊki powyĪszym wáaĞciwoĞciom komórek
tworzących
strukturĊ
káĊbuszka
nerkowego
oraz
tĊtniczki
doprowadzającej i odprowadzającej, káĊbuszki obdarzone są swoistym
aparatem kurczliwym, który stanowi podstawowy system regulujący
tempo przepáywu krwi przez káĊbuszki i filtracji.
Filtracja káĊbuszkowa na poziomie pojedynczego nefronu
podlega autoregulacji dziĊki mechanizmowi zwrotnego sprzĊĪenia
kanalikowo – káĊbuszkowego. Anatomiczną strukturĊ sprzĊĪenia
kanalikowo
–
káĊbuszkowego
stanowi
aparat
przykáĊbkowy,
13
skáadający siĊ z zespoáu komórek prostego odcinka kanalika
dystalnego,
zwanego
plamką
gĊstą,
komórek
mezangium
zewnĊtrznego oraz komórek Ğciany tĊtniczki doprowadzającej
i czĊĞciowo odprowadzającej káĊbka. W warunkach zwiĊkszonego
áadunku sodu przepáywającego przez kanalik, plamka gĊsta odbiera
sygnaá ze Ğwiatáa kanalika i w odpowiedzi na ten sygnaá dochodzi do
obkurczenia naczynia doprowadzającego i/lub mezangium káĊbka.
Efektem
tego
jest
obniĪenie
przesączania
káĊbuszkowego.
Postulowany jest pogląd, Īe substancjami sygnalnymi mogą byü
adenozyna [51] i ATP [46]. AktywnoĞü systemu sprzĊĪenia
kanalikowo – káĊbuszkowego moĪe ulegaü modyfikacji pod wpáywem
róĪnych czynników fizjologicznych, np. dieta niskosodowa aktywuje
mechanizm sprzĊĪenia, przypuszczalnie poprzez stymulacjĊ produkcji
angiotensyny II [73]. Wiele czynników farmakologicznych - tj.
teofilina - niespecyficzny antagon receptorów P1 - [53], saralazyna
[55], werapamil [41] – blokują mechanizm ujemnego sprzĊĪenia
kanalikowo – káĊbuszkowego.
W ostatnich kilkunastu latach wiele uwagi poĞwiĊcono roli
receptorów purynowych w regulacji przepáywu krwi i filtracji
káĊbuszkowej, ze wzglĊdu na to, Īe naturalne ligandy tych receptorów
(ATP, ADP, adenozyna) mogą byü uwalniane przez wszystkie typy
komórek wystĊpujących w nefronie i oddziaáywaü na te komórki na
drodze auto-/parakrynnej.
W doĞwiadczeniach na znieczulonych szczurach wykazano, Īe
adenozyna pojawiająca siĊ w páynie pozakomórkowym hamuje
filtracjĊ káĊbuszkową stymulowaną przedsionkowym czynnikiem
natriuretycznym (ANF) [3,72]. Z kolei adenozyna dodana do
zawiesiny izolowanych káĊbuszków nerkowych silnie je obkurcza
poprzez aktywacjĊ receptorów A1 [73]. PóĨniejsze badania wykazaáy,
14
Īe ATP - poprzez aktywacjĊ receptorów P2Y, a nastĊpnie aktywacjĊ
syntazy tlenku azotu i cytoplazmatycznej cyklazy guanylanowej rozkurcza izolowane káĊbuszki, uprzednio obkurczone angiotensyną II
[31]. Z kolei, gdy káĊbuszki byáy rozkurczone, ATP – za
poĞrednictwem receptorów P2X i P2Y - wywoáywaá ich skurcz.
Autorzy pracy postulują, Īe dwukierunkowe dziaáanie ATP na
dynamikĊ káĊbuszków nerkowych wynika z zaangaĪowania komórek
sródbáonka naczyĔ (odpowiedzialnych za rozkurczanie) oraz komórek
kurczliwych káĊbuszka (mezangiocyty, podocyty) [32].
WiedzĊ na temat potencjalnej roli systemu purynergicznego w
regulacji mikrokrąĪenia w nerkach wzbogacają ostatnio publikowane
dane na temat dziaáania dinukleotydów adeninowych tj. diadenozynopolifosforanów (ogólny wzór APnA, gdzie n = liczba reszt
fosforanowych). Związki te uwalniane z komórek (w wiĊkszych
iloĞciach z ziarnistoĞci gĊstych páytek krwi [22] i zakoĔczeĔ
nerwowych [44]) są naturalnymi ligandami receptorów P2, a takĪe
potencjalnym
Ĩródáem
pozakomórkowych
mononukleotydów
i nukleozydów. Wysoka aktywnoĞü w káĊbuszkach nerkowych
ektoenzymów hydrolizujących dinukleotydy do naczynioaktywnych
mononukleotydów (ATP i ADP), i dalej do adenozyny, wskazuje na
unikatowy charakter purynergicznego sygnaáowania w tej czĊĞci
nefronu. W naszym laboratorium wykazano, Īe dinukleotydy tj. Ap3A,
Ap4A i Ap5A zmieniają - za poĞrednictwem receptorów P2 - objĊtoĞü
wewnątrzkapilarną káĊbuszków [69]. Autorzy sugerują, Īe związki te
mogą modyfikowaü funkcjĊ nefronów per se i/lub poprzez uwalniane
w wyniku hydrolizy ATP. Gáówny pod wzglĊdem iloĞciowym
przedstawiciel tej grupy Ap4A podany do ogólnego krąĪenia krwi
znieczulonych szczurów w iloĞciach mikromolarnych - podobnie do
NAD (prekursor adenozyny) – hamuje prĊdkoĞü przesączania
15
káĊbuszkowego i przepáyw krwi przez nerki. JednakĪe Ap4A
przeciwnie do NAD wybiórczo stymuluje natriurezĊ i diurezĊ, co
sugeruje dziaáanie tego związku na system transportu kanalikowego
[38].
AktywnoĞü záoĪonego systemu transportowego w kanalikach
nerkowych decyduje o objĊtoĞci i skáadzie ostatecznie wydalanego
moczu. Intensywna reabsorpcja przesączu zachodzi w pierwszym
odcinku kanalika proksymalnego na drodze transcelularnej (transport
przezkomórkowy) i paracelularnej (transport miĊdzykomórkowy).
Wraz z jonami sodu do komórki są transportowane: jony chlorkowe,
glukoza,
aminokwasy,
wodorowĊglany
oraz
reszty
kwasów
(fosforowego, octowego, cytrynowego, mlekowego). Kation sodu
zastĊpuje teĪ w komórce wychodzący z niej jon wodorowy (transport
wymienny). Transport jonu sodowego do komórki zachodzi dziĊki
gradientowi stĊĪenia Na+ utrzymywanemu przez Na+, K+-ATP-azĊ
(pompa sodowo-potasowa), która aktywnie wyrzuca sód z komórki.
Wysoką
aktywnoĞü
pompy
sodowo-potasowej
stwierdzono
w kanaliku proksymalnym, w ramieniu wstĊpującym pĊtli Henlego
oraz w kanaliku dystalnym, gdzie jej aktywnoĞü jest regulowana przez
aldosteron. Páyn opuszczający kanalik proksymalny jest izotoniczny w
stosunku do osocza, co oznacza, Īe w tej czĊĞci nefronu nie dochodzi
do
zagĊszczania
ani
rozcieĔczania przesączu
káĊbuszkowego,
a jedynie do redukcji jego objĊtoĞci. W dalszej czĊĞci nefronu,
gáównie w kanaliku zbiorczym, zachodzi proces zagĊszczania moczu,
jako wynik transportu wody, który jest uwarunkowany z jednej strony
hiperosmią páynu ĞródmiąĪszowego rdzenia nerki, a z drugiej strony –
obecnoĞcią wazopresyny (hormon antydiuretyczny - ADH). Na
komórkach kanalików zbiorczych znajdują siĊ receptory V2 dla ADH,
umiejscowione na báonie przypodstawno – bocznej. Interakcja ADH
16
z receptorem prowadzi do aktywacji cyklazy adenylanowej i wzrostu
wytwarzania wewnatrz-komórkowego mediatora - cyklicznego AMP,
a ten z kolei aktywuje kinezĊ biaáczanową odpowiedzialną za
fosforylacjĊ biaáek. Fosforylacja biaáek báony luminalnej kanalików
dalszych i zbiorczych czyni báony przepuszczalne dla wody.
Wykazano, Īe ADH - za poĞrednictwem cyklicznego AMP stymuluje translokacjĊ akwaporyn (AQP2) – do báon komórkowych
kanalika, poprzez które są transportowane cząsteczki wody [63]. W
2003r. Peter Agre oraz Roderick MacKinnon otrzymali nagrodĊ Nobla
w
dziedzinie
chemii,
za
odkrycie
akwaporyn
w
báonach
komórkowych, specyficznych biaáek tworzących kanaáy w báonie.
Transport elektrolitów i innych substancji przez báony
plazmatyczne komórek epitelialnych kanalików nerkowych równieĪ
zachodzi za poĞrednictwem specyficznych biaáek. IloĞü biaáek
transportowych w báonie jest czynnikiem warunkującym wielkoĞü
transportu. Z kolei wielkoĞü transportu jest regulowana przez
hormony i substancje parakrynne. Czynniki te wiąĪą siĊ z
odpowiednimi
komórkowe
receptorami
stĊĪenie
báonowymi
cyklicznego
zmieniając
wewnątrz-
AMP/cyklicznego
GMP,
a przez to wpáywają na aktywnoĞü kinaz biaákowych A/C. Np.
parathormon
(PTH)
wewnatrzkomórkową
poprzez
degradacjĊ
cykliczny
AMP
biaáka-transportującego
indukuje
Na-Pi,
czego efektem jest zahamowanie reabsorpcji fosforanów z moczem
[56]. Jak wspomniano powyĪej, ADH – za poĞrednictwem
cyklicznego AMP zwiĊksza iloĞü biaáek transportowych dla wody
(akwaporyn) w báonie luminalnej komórek kanalika zbiorczego.
W doĞwiadczeniach in vitro ATP hamuje dziaáanie wazopresyny
w kanalikach zbiorczych rdzenia wewnĊtrznego nerek szczura [20].
Wykazano, Īe adenozyna zmniejsza indukowaną wazopresyną
17
przepuszczalnoĞü hydrauliczną w izolowanych kanalikach zbiorczych,
prawdopodobnie poprzez receptory A1 [18]. W doĞwiadczeniach in
vitro na komórkach kanalików zbiorczych, pochodzących z hodowli
komórkowej, wykazano obecnoĞü receptorów dla angiotensyny IV,
związanych z cyklazą adenylanową [16]. Z kolei w kanaliku
proksymalnym adenozyna – za poĞrednictwem receptorów A1 –
podobnie jak angiotensyna II – za poĞrednictwem receptorów AT1
stymuluje wcháanianie zwrotne sodu [14].
Hormon
natriuretyczny
(ANF)
wydzielany
przez
komórki
przedsionków serca - w sytuacjach związanych z retencją sodu
w organizmie i zwiĊkszoną objĊtoĞcią krwi krąĪącej – hamuje
reabsorpcjĊ sodu w kanalikach nerkowych. Receptory dla ANF są
zlokalizowane na komórkach kanalika dystalnego, a ich aktywacja
zwiĊksza syntezĊ cyklicznego GMP w komórkach, który z kolei
hamuje kanaáy sodowe wraĪliwe na amylorid [66]. Wykazano równieĪ
w doĞwiadczeniach na perfundowanych kanalikach zbiorczych nerek
myszy, Īe amylorido-wraĪliwe kanaáy sodowe są równieĪ hamowane
przez analogi ATP – agony receptorów P2Y2 [40]. Z kolei w innych
doĞwiadczeniach
prowadzonych
na
hodowlach
komórek
linii
A6-NHE3 wykazano, Īe pozakomórkowe nukleotydy adeninowe
hamują wymianĊ jonu sodowego na jon wodorowy [5]. W innych
doĞwiadczeniach wykazano, Īe zewnątrzkomórkowe nukleotydy
hamują dziaáanie PTH na komórki kanalików nerkowych, przez co
zmniejszają fosfaturiĊ [39]. Z powyĪszych doĞwiadczeĔ wynika, Īe
pozakomórkowe
nukleotydy
za
poĞrednictwem
receptorów
purynowych mogą regulowaü kanalikowy transport jonów i wody. Jak
do tej pory niewiele jest danych na temat dziaáania tych związków w
warunkach in vivo na funkcjĊ wydalniczą nerek.
18
2.4 Rola ukáadu wspóáczulnego w regulacji funkcji nerek
Jednym
z
istotnych
czynników
regulujących
funkcjĊ
wydalniczą nerek jest aktywnoĞü ukáadu wspóáczulnego nerek. Nerki
szczura są narządem dobrze unerwionym wáóknami wywodzącymi siĊ
gáównie ze zwojów wspóáczulnych. W nerkach, nerwy towarzyszą
sieci naczyĔ tĊtniczych, a zatem gĊstoĞü zakoĔczeĔ nerwowych jest
najwyĪsza w najbardziej ukrwionych czĊĞciach nerki tj. czĊĞci
korowej i warstwie rdzenia zewnĊtrznego. NajwiĊkszą gĊstoĞü
zakoĔczeĔ nerwowych stwierdzono przy tĊtniczce doprowadzającej
i odprowadzającej, aparacie przykáĊbkowym, kanaliku proksymalnym,
czĊĞci grubej ramienia wstĊpującego pĊtli Henlego, kanaliku krĊtym
dalszym. Zmiany aktywnoĞci nerkowego ukáadu sympatycznego
bezpoĞrednio wpáywają na funkcjĊ poszczególnych, unerwionych
struktur nefronu. AktywnoĞü ukáadu sympatycznego nerek moĪe byü
doĞwiadczalnie regulowana. Wykazano, Īe jednym z czynników
modulujących
aktywnoĞü
ukáadu
wspóáczulnego
nerek
jest
angiotensyna II lokalnie powstająca w oĞrodkowym ukáadzie
nerwowym [33]. Pobudzenie ukáadu sympatycznego nerek prowadzi
do wzrostu wcháaniania zwrotnego sodu i wody, a jednym
z mechanizmów tego dziaáania jest aktywacja systemu reninaangiotensyna. W wyniku wzrostu wydzielania reniny z aparatu
przykáĊbuszkowego wzrasta aktywnoĞü ukáadu renina-angiotensyna,
co równieĪ przyczynia siĊ do retencji jonów sodu. W sytuacji silnego
stresu czy bardzo duĪego wysiáku fizycznego moĪe nawet dojĞü do
spadku przepáywu krwi przez nerki, jak równieĪ i filtracji
káĊbuszkowej. Z drugiej strony obniĪenie aktywnoĞci ukáadu
sympatycznego skutkuje tylko wzrostem wydalania sodu i spadkiem
19
wydzielania reniny, bez uchwytnych zmian w przepáywie krwi przez
nerki
czy
filtracji
káĊbuszkowej.
Jest
to
wynikiem
niskiej
podstawowej aktywnoĞci ukáadu wspóáczulnego nerek i braku
tonicznego wpáywu na ukáad naczyniowy nerek.
W zakoĔczeniach ukáadu sympatycznego naturalnym przekaĨnikiem
sygnaáu jest noradrenalina. Wykazano, Īe towarzyszy jej ATP oraz
neuropeptyd Y. Z innych przekaĨników biorących udziaá w
sygnaáowaniu w nerkach wymieniü naleĪy: dopaminĊ, substancjĊ P,
wazoaktywny peptyd jelitowy i peptyd zaleĪny od genu kalcytoniny
[17]. ZakoĔczenia nerwowe są równieĪ Ĩródáem Ap4A, który po
hydrolizie w przestrzeni pozakomórkowej jest Ĩródáem ATP oraz
adenozyny, które zwiĊkszają aktywnoĞü nerwów czuciowych oraz
modyfikują
uwalnianie
neurotransmiterów
[44].
Tak,
wiĊc
zakoĔczenia nerwowe są bogate w noradrenalinĊ oraz związki
purynowe, a to z kolei implikuje moĪliwoĞü wystĊpowania szeregu
wzajemnych oddziaáywaĔ pomiĊdzy sygnaáowaniem adrenergicznym
i purynergicznym. Podczas pobudzenia neuronów cholinergicznych
acetylocholina uwalnia siĊ z zakoĔczeĔ synaptycznych razem z ATP
oraz dinukleotydami adeninowymi [57]. Aktywacja neuronów
adrenergicznych
i
noradrenergicznych
równieĪ
prowadzi
do
uwolnienia ATP i diadenozynopolifosforanów wraz z adrenaliną lub
noradrenaliną. W doĞwiadczeniach, w których mierzono zmiany
potencjaáu báonowego wykazano, Īe uwalniane z zakoĔczeĔ
nerwowych dinukleotydy (gáównie Ap5A) powodują depolaryzacjĊ
báony neuronu [58].
Dlatego teĪ w obecnej pracy oceniano dziaáanie nukleotydów
purynowych na funkcjĊ nerek w warunkach obniĪonej aktywnoĞci
ukáadu wspóáczulnego (poprzez odnerwienie).
20
3. CEL PRACY
Gáównym celem pracy byáa ocena potencjalnej roli receptorów
purynowych naleĪących do grupy P2 w regulacji funkcji nefronów w
warunkach
(Ap4A)
we
podwyĪszonego
krwi,
stĊĪenia
prekursora
ATP
diadenozynotetrafosforanu
i
adenozyny
w
páynie
pozakomórkowym.
Ponadto podjĊto próbĊ ustalenia wzajemnej relacji miĊdzy
systemem purynergicznym a ukáadem adrenergicznym w nerkach,
wykorzystując model nerki odnerwionej.
W doĞwiadczeniach klirensowych – umoĪliwiających pomiar
parametrów funkcji nerek tj. filtracjĊ i przepáyw krwi przez nerki,
diurezĊ i reabsorpcjĊ sodu w kanalikach nerkowych – badano
dziaáanie Ap4A w obecnoĞci antagonów receptorów P: teofiliny
(antagon receptorów P1) i suraminy (antagon receptorów P2), a
nastĊpnie dziaáanie Ap4A porównano z dziaáaniem swoistych agonów
receptorów
P2:
ȕ,Ȗ-metylenoATP
(agon
receptorów
P2X)
i
2-metylotioATP (agon receptorów P2Y).
21
4. MATERIAà I METODY
DoĞwiadczenia przeprowadzono na szczurach samcach Wistar,
waĪących od 200 do 250g; zwierzĊta pochodziáy z hodowli z Instytutu
Centrum Medycyny DoĞwiadczalnej i Klinicznej PAN (Warszawa).
ZwierzĊta przed doĞwiadczeniami przebywaáy, przez co najmniej
siedem
dni,
w
pomieszczeniu
dla
zwierząt
laboratoryjnych,
z klimatyzacją cieplną i oĞwietleniem 12-godzinnym na dobĊ oraz
z nieograniczonym dostĊpem do paszy Labofeed H (Wytwórnia pasz
i koncentratów, Kcynia) i wody wodociągowej. DoĞwiadczenia na
zwierzĊtach wykonywano za zgodą Komisji Etycznej do Spraw
DoĞwiadczeĔ na ZwierzĊtach Akademii Medycznej w GdaĔsku.
Materiaáem badanym byáa krew tĊtnicza pobrana z Īyáy udowej oraz
mocz pobrany bezpoĞrednio z pĊcherza (w doĞwiadczeniach
klirensowych), a takĪe mocz zebrany w klatkach metabolicznych.
W jednej serii doĞwiadczeĔ materiaáem badanym byáy káĊbuszki
izolowane z nerek szczura.
DoĞwiadczenia klirensowe przeprowadzono na trzech grupach
szczurów:
I grupa – szczury (normalne) nie poddawane Īadnym zabiegom
(n=90)
II grupa – szczury po obustronnym odnerwieniu nerek (n = 15)
III grupa – szczury po zabiegu pozorowanym (n = 15)
4.1. Odnerwienie nerek
Zabieg odnerwienia nerek wykonano na zwierzĊtach (n = 15) po
uprzednim znieczuleniu Inaktyną w dawce 100 mg/kg ciĊĪaru ciaáa
22
(c.c.) Po naciĊciu skóry po stronie grzbietowej szczura rozchylano
tkanki i wypreparowano nerki tak, aby uwidoczniü tĊtnice nerkowe.
Od tĊtnicy nerkowej lewej i prawej odpreparowano nerwy, które
nastĊpnie przeciĊto. PrzeciĊte nerwy przyĪegano 10% roztworem
fenolu w etanolu. GrupĊ kontrolną stanowiáy zwierzĊta, którym
wykonano zabieg pozorowany, polegający na uwidocznieniu tĊtnic
nerkowych bez przecinania nerwów i przyĪegania. NastĊpnie ranĊ
zaopatrzono chirurgicznie.
4.2. DoĞwiadczenia w klatkach metabolicznych
Ósmego dnia po zabiegu odnerwienia nerek oraz zabiegu
pozorowanym przeprowadzono dobową zbiórkĊ moczu. W tym celu
zwierzĊta umieszczono na 24 godziny w klatkach metabolicznych,
zapewniając im dostĊp do paszy i wody. W iloĞciowo zebranym
moczu oznaczono stĊĪenie sodu i potasu. Wyliczono, Īe dobowe
wydalanie sodu u zwierząt po zabiegu pozorowanym wynosiáo 1,45 ±
0,2 mmol, a w grupie po obustronnym odnerwieniu nerek 2,46 ± 0,3
mmol.
4.3. DoĞwiadczenia klirensowe
W
dniu
doĞwiadczenia
zwierzĊta
znieczulano
podając
dootrzewnowo InaktynĊ w dawce 100 mg/kg c.c.. Znieczulone
zwierzĊta umieszczano na podgrzewanym stoliku operacyjnym
(JWElectronic) umoĪliwiającym utrzymanie staáej temperatury ciaáa
37qC.
W
celu
przeprowadzono
zapewnienia
tracheostomiĊ,
swobodnej
umieszczając
wentylacji
w
páuc
tchawicy
dopasowaną rurkĊ polietylenową o Ğrednicy 2 mm. W prawym dole
23
udowym odsáaniano ĪyáĊ i tĊtnicĊ udową. Do Īyáy wprowadzano dren
polietylenowy o Ğrednicy 0,3 mm, przez który podawano páyn
infuzyjny o nastĊpującym skáadzie: 140 mmol/l NaCl z dodatkiem
[3H] inuliny (5 PCi/ml) oraz p-aminohipuranu sodu (PAH; 1mg/ml)
i heparyny (5 U/ml). W doĞwiadczeniach, w których badano
wydalanie litu páyn infuzyjny dodatkowo zawieraá chlorek litu w
stĊĪeniu 10 mM. Páyn infuzyjny podawano ze staáą prĊdkoĞcią, 45
Pl/min, przy uĪyciu pompy (ATI Orion). Do tĊtnicy udowej
wprowadzono dren polietylenowy o Ğrednicy 0,3 mm, który poáączony
z urządzeniem sáuĪącym do pomiaru ciĞnienia (Stoelting) umoĪliwiaá
bezpoĞredni pomiar Ğredniego ciĞnienia tĊtniczego krwi. InfuzjĊ ciągáą
páynu poprzedzono jednorazowym dotĊtniczym podaniem 0,5 ml
páynu w ciągu 1minuty. Po upáywie 30 minut od momentu
rozpoczĊcia infuzji odsáaniano pĊcherz moczowy przez naciĊcie
powáok brzucha. Do nakáutego na szczycie pĊcherza wprowadzano
dren polietylenowy o Ğrednicy 3 mm. PĊcherz podwiązywano na
drenie. Poprzez dren swobodnie spáywaá mocz do kalibrowanej
probówki typu Eppendorf. Po ustaleniu diurezy na staáym poziomie
(po okoáo 90 minutach od wáączenia infuzji) zbierano mocz w
5 przedziaáach 20 minutowych. W czasie kaĪdej zbiórki moczu,
z tĊtnicy udowej pobierano krew tĊtniczą (po okoáo 100Pl). Pierwsze
dwie kolejne zbiórki moczu i próbki krwi traktowano jako materiaá
kontrolny. BezpoĞrednio po tym okresie kontrolnym kontynuowano
infuzjĊ páynu wáączając badane związki - zgodnie z odpowiednim
protokoáem
przedstawionym
poniĪej.
W
pobranych
próbkach
oznaczano stĊĪenie PAH, radioaktywnoĞü [3H] inuliny oraz stĊĪenie
sodu, potasu, chlorku oraz fosforanów, a w doĞwiadczeniach,
w których, uĪyto LiCl, w moczu i we krwi oznaczono stĊĪenie Li.
24
Protokóá doĞwiadczeĔ klirensowych:
Dziaáanie Ap4A na hemodynamikĊ i czynnoĞü wydalniczą nerek
BezpoĞrednio po okresie kontrolnym zwierzĊta otrzymywaáy Ap4A
w dwóch dawkach:
(I) pierwsza grupa (n = 5) 0,2 Pmol/kg jednorazowo i 2 nmol/min/kg
w infuzji ciągáej,
(II) druga grupa (n = 8) 2 Pmol/kg jednorazowo i 20 nmol/min/kg
w infuzji ciągáej.
Dziaáanie Ap4A (2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg) na funkcjĊ nerek w
obecnoĞci antagonów receptorów P1 (teofiliny) i P2 (suraminy)
Po okresie kontrolnym jednej grupie szczurów (n = 8) wáączono w
infuzjĊ doĪylną teofilinĊ (0,8 µmol/kg + 0,2 Pmol/min/kg c.c.),
a drugiej (n = 6) suraminĊ (12 mg/kg c.c. + 0,18 mg/min/kg c.c.). Obu
grupom po 20 minutach dodatkowo wáączono Ap4A.
Dziaáanie analogów ATP (E,J-MeATP i 2-MeSATP) – specyficznych
agonów receptorów P2 na funkcjĊ nerek
BezpoĞrednio po okresie kontrolnym jednej grupie zwierząt (n = 8)
podawano doĪylnie E,J-Me-ATP, a drugiej (n = 8) 2-MeSATP. KaĪdy
ze związków podawano w dawce jednorazowej 2Pmol/kg c.c. oraz w
dawce podtrzymującej 20 nmol/min/kg c.c. przez 60 minut.
25
Wpáyw odnerwienia na dziaáanie Ap4A i analogów ATP (E,J-MeATP i
2-MeSATP) na funkcjĊ nerek
DoĞwiadczenia przeprowadzono na grupie zwierząt po uprzednim
odnerwieniu nerek oraz grupie kontrolnej (po zabiegu pozorowanym).
BezpoĞrednio po okresie kontrolnym podawano testowane związki -
Ap4A, E,J-MeATP oraz 2-MeSATP - w dawce po 2 Pmol/kg +
20 nmol/min/kg przez 60 minut. W kaĪdej grupie n = 5.
26
4.3.1 Metody analityczne
[3H] Inulina - pomiar radioaktywnoĞci w moczu i w surowicy
oznaczano
metodą
páynnej
scyntylacji
przy
uĪyciu
licznika
scyntylacyjnego Wallac 1409. Do naczyĔ scyntylacyjnych dodawano
20 µl próby badanej i 0,5 ml páynu scyntylacyjnego (Ultima Gold
Sigma). NastĊpnie próbki inkubowano w temperaturze pokojowej w
zaciemnionym miejscu. Po 30 minutach dokonywano pomiaru
radioaktywnoĞci, wyniki wyraĪono w cpm / próbkĊ badaną.
p-Aminohipuran sodu – stĊĪenie w moczu i odbiaáczonej surowicy
oznaczono metodą Brattona i Marshala [9]. 0,1% azotyn sodowy
przechowywany w temp. < 0 ºC jest trwaáy przez tydzieĔ,
0,1% N-(1-naftylo)-etylenodwuamina przechowywana w ciemnej
butelce w temp. < 0 ºC jest trwaáa miesiąc. Pozostaáe odczynniki
przechowywane w temp. pokojowej są trwaáe nieograniczenie.
Kalibracji metody dokonywano w oparciu o krzywą wzorcową z
uĪyciem wzorca p-Aminohipuranu sodu (Sigma) w zakresie stĊĪeĔ od
5,75 – 230 nmol/l. AbsorbancjĊ próby badanej i wzorcowej odczytano
wzglĊdem próby Ğlepej przy Ȝ = 546 nm. Wspóáczynnik zmiennoĞci
oznaczeĔ w serii niejednoczesnej wynosiá ± 8% dla caáego zakresu
stĊĪeĔ.
Fosforany – stĊĪenie w moczu i surowicy oznaczano zmodyfikowaną
metodą Gomoriego [25]. Modyfikacja metody polegaáa na dodaniu do
100 ml odczynnika molibdeno-siarkowego 0,3 ml Tweenu 80,
zastĊpując inny reduktor, jakim jest metol. TrwaáoĞü odczynnika
molibdenowo-siarkowego wynosi okoáo 7 dni. TrwaáoĞü pozostaáych
odczynników jest nieograniczona. Kalibracji metody dokonywano w
27
oparciu o krzywą wzorcową z uĪyciem wzorca K2HPO4 (POCh
Gliwice) w zakresie stĊĪeĔ od 0,15 – 0,5 mmo/l. Jako wzorca
roboczego uĪyto 1 mmol/l roztworu Pi. AbsorbancjĊ próby badanej i
wzorcowej odczytano wzglĊdem próby Ğlepej przy Ȝ = 360 nm.
Wspóáczynnik zmiennoĞci oznaczeĔ w serii niejednoczesnej wynosiá
± 6% dla caáego zakresu stĊĪeĔ.
Sód, potas, chlorek – stĊĪenie w moczu i surowicy oznaczano przy
uĪyciu
elektrody
jonoselektywnej.
Oznaczenia
wykonano
w
Centralnym Laboratorium Akademickiego Centrum Klinicznego
SPSK AM w GdaĔsku na analizatorze Architekt c 8000 wedáug
rutynowych procedur.
Lit – stĊĪenie w moczu i surowicy oznaczono metodą absorpcyjnej
spektrometrii atomowej. Oznaczenia wykonano w Centralnym
Laboratorium Akademickiego Centrum Klinicznego SPSK AM w
GdaĔsku na spektrometrze Philips PU 9100X wedáug rutynowych
procedur.
28
4.3.2 Obliczenia i symbole uĪyte w badaniach klirensowych.
Pobrane próbki moczu i krwi tĊtniczej posáuĪyáy do okreĞlenia filtracji
káĊbuszkowej, przepáywu osocza i krwi przez nerki, opornoĞci naczyĔ
nerkowych, diurezy oraz wydalania elektrolitów. W tym celu
zastosowano standardowe wzory:
Diureza (V) – objĊtoĞü wydalonego moczu w ciągu jednej minuty
okreĞlano w nastĊpujący sposób:
ObjĊtoĞü moczu [µl]
V [µl/min] =
czas zbiórki [min]
Filtracja káĊbuszkowa (GFR) – przesączanie káĊbuszkowe okreĞlono
na podstawie klirensu inuliny (Cin)
Uin · V
Cin [ml/min] =
Pin
gdzie: Uin - stĊĪenie inuliny w moczu [cpm]
V - diureza [µl/min]
Pin - stĊĪenie inuliny w osoczu [cpm]
29
Przepáyw osocza przez nerki (RPF) – wyznaczono na podstawie
klirensu p-amionohipuranu (PAH).
UPAH · V
CPAH [ml / min] =
PPAH
gdzie: Uin - stĊĪenie PAH w moczu [nmol/l]
V - diureza [µl/min]
Pin - stĊĪenie PAH w osoczu [nmol/l]
Przepáyw krwi przez nerki (RBF)
RPF
RBF [ml/min] =
(1 – Ht)
gdzie: Ht -hematokryt krwi tĊtniczej
OpornoĞü naczyĔ nerkowych (RVR)
MAP
RVR [mmHg / ml · min] =
RBF
gdzie: MAP -Ğrednie ciĞnienie krwi tĊtniczej [ mmHg]
RBF – przepáyw krwi przez nerki [ml/min]
30
FF– frakcja filtracyjna wyliczona na podstawie wzoru:
GFR
FF [%] =
100%
RPF
FENa – frakcyjne wydalanie sodu z moczem wyliczono stosując
nastĊpujący wzór:
CNa
FENa [%] =
· 100 %
Cin
gdzie: CNa – klirens sodu
UNa V
CNa [ml/min] =
PNa
gdzie: UNaV– minutowe wydalanie sodu z moczem
[µmol/min]
PNa – stĊĪenie sodu w osoczu [mmol/l]
Frakcyjne wydalanie pozostaáych elektrolitów tj.: potasu, chlorków,
fosforanów, litu liczono w oparciu o klirens potasu, klirens chlorków,
klirens fosforanów, klirens litu oraz klirens inuliny.
31
WskaĨniki funkcji kanalików nerkowych
Wykorzystując nastĊpujące parametry funkcji nerek okreĞlono
reabsorpcjĊ sodu i wody w kanalikach nerkowych: klirens inuliny
(Cin) – wskaĨnik filtracji káĊbuszkowej, klirens sodu (CNa) – wskaĨnik
caákowitego wydalania sodu z moczem, klirens litu (CLi) – wskaĨnik
objĊtoĞci izotonicznego páynu opuszczającego kanalik, a wiĊc i iloĞci
sodu opuszczającego kanaliki nerkowe.
Frakcyjne wydalanie páynu z kanalików proksymalnych okreĞlono na
podstawie ilorazu klirensu litu i klirensu inuliny (CLi / Cin).
ObjĊtoĞü páynu ulegającego reabsorpcji w kanaliku proksymalnym
okreĞlono na podstawie róĪnicy pomiĊdzy klirensem inuliny
a klirensem litu (Cin – CLi).
ReabsorbcjĊ wody w dalszych czĊĞciach nefronów okreĞlono na
podstawie róĪnicy pomiĊdzy klirensem litu a diurezą (CLi – V).
Frakcyjne wydalanie wody z dalszych czĊĞci nefronów okreĞlono na
podstawie ilorazu diurezy i klirensu litu (V / CLi).
ReabsorbcjĊ sodu w dalszych czĊĞciach nefronów okreĞlono na
podstawie róĪnicy klirensu litu i klirensu sodu (CLi – CNa).
Frakcyjne wydalanie sodu z dalszych czĊĞci nefronów okreĞlono w
oparciu o iloraz klirensu sodu i klirensu litu (CNa / CLi).
32
4.4 DoĞwiadczenia na izolowanych káĊbuszkach
W doĞwiadczeniach na izolowanych káĊbuszkach nerkowych
szczurów mierzono, przy uĪyciu radioaktywnej inuliny [3H], objĊtoĞü
inulinową káĊbuszków (Glomerular Inulin Space - GIS), która
odzwierciedla objĊtoĞü wewnątrzkapilarną. Pomiaru dokonano w
oparciu o wczeĞniej opracowaną metodĊ [24], w znacznej mierze
zmodyfikowaną w naszej pracowni. Zasada metody opiera siĊ na
wáaĞciwoĞciach inuliny, która nieprzemieszczając siĊ przez báony
komórkowe, rozmieszcza siĊ w Ğrodowisku inkubacyjnym, páynie
wewnątrzkapilarnym i páynie miĊdzykomórkowym. W oparciu o
pomiar radioaktywnoĞci w osadzie káĊbuszków nerkowych moĪna
wyliczyü objĊtoĞü przestrzeni inulinowej, której 95 % stanowi
przestrzeĔ
wewnątrzkapilarna,
a
5
%
miĊdzykomórkowa.
WczeĞniejsze badania wykonane m. in. w naszym Zakáadzie dowodzą,
Īe zmiany GIS pod wpáywem badanych związków odzwierciedlają
skurcz lub relaksacjĊ naczyĔ kapilarnych izolowanych káĊbuszków
nerkowych.
Wszystkie czynnoĞci związane z izolacją káĊbuszków i inkubacją
z testowanymi związkami przeprowadzono w Ğrodowisku lodowato –
zimnego wieloelektrolitowego buforu PBS (ice – cold Dulbeco’s
phosphate – buffered saline) o pH 7,4 ± 0,2 i skáadzie (mM): 137
NaCl; 2,7 KCl; 0,49 MgCl2; 8,1 Na2HPO4; 1,5 KH2PO4; 0,9 CaCl2; 5,6
glukozy.
33
4.4.1 Izolacja káĊbuszków nerkowych
W
dniu
doĞwiadczenia
zwierzĊta
znieczulano
eterem
dietylowym, przeprowadzano dekapitacjĊ, a nastĊpnie pobierano
nerki, które umieszczano w scháodzonym do temperatury 0-4qC
buforze (PBS). ĝredni ciĊĪar jednej nerki wynosiá 823r16mg. Z
pobranych nerek usuwano torebkĊ áącznotkankową. NastĊpnie nerki
przecinano w páaszczyĨnie strzaákowej, a widoczny rdzeĔ nerkowy
wycinano noĪyczkami o zakrzywionym ostrzu. KáĊbuszki nerkowe
izolowano
techniką
przesiewową
[45],
zmodyfikowaną
przez
M. SzczepaĔską-Konkel i wspóápracowników [71], stosując sita
metalowe o Ğrednicy oczek (‡): 250, 125, 75 Pm. KorĊ nerek po
rozdrobnieniu przy uĪyciu ostrego noĪyka przenoszono na sito
metalowe o ‡ 250Pm i przecierano za pomocą plastikowego táoka od
strzykawki. NastĊpnie otrzymany homogenat umieszczono na sicie
o ‡ 125Pm, i przepáukano duĪym strumieniem lodowato - zimnego
roztworu PBS. Na sicie o ‡ 125Pm pozostawaáy kanaliki nerkowe,
które odrzucano, a przesącz zawierający káĊbuszki nanoszono na sito
o ‡ 75 Pm. Pozostające na sicie ‡ 75Pm káĊbuszki, przepáukiwano
roztworem PBS w celu usuniĊcia komórek, a nastĊpnie spáukano je
z sita i zawiesinĊ przeniesiono do probówki zawierającej PBS
z dodatkiem albuminy (stĊĪenie koĔcowe - 100mg/10 ml). àączny
czas, jaki upáywaá od dekapitacji zwierząt do zakoĔczenia izolacji
káĊbuszków nerkowych nie przekraczaá 90 minut. Wszystkie
czynnoĞci związane z izolacją káĊbuszków prowadzono w temp.
0-4qC, w plastikowych naczyniach umieszczonych w pojemniku
z lodem.
34
4.4.2 Ocena jakoĞciowa i iloĞciowa otrzymanego preparatu
CzystoĞü zawiesiny káĊbków nerkowych oceniano przy uĪyciu
mikroskopu Ğwietlnego. Zanieczyszczenie elementami morfotycznymi
(kanaliki, komórki) wynosiáo nie wiĊcej niĪ 5 %.
IloĞü káĊbuszków nerkowych w otrzymanym preparacie okreĞlano,
poprzez liczenie káĊbuszków w komorze Fuchs-Rosenthalca pod
mikroskopem Ğwietlnym. W wyniku stosowanej metody izolacji,
z jednej nerki otrzymywano okoáo 10 tysiĊcy káĊbuszków.
DoĞwiadczenia prowadzono na znanej liczbie káĊbuszków nerkowych.
4.4.3 Inkubacja káĊbuszków nerkowych z testowanymi związkami
Do 200Pl zawiesiny zawierającej 2000 ± 150 káĊbuszków
nerkowych w buforze PBS z albuminą woáową (1%) dodawano 0,2
PCi [3H]-inuliny. Tak przygotowane próbki preinkubowano 30 minut
w temp. 36qC w áaĨni wodnej z ciągáym mieszaniem(40obrotów/min).
InkubacjĊ kontynuowano z testowanymi związkami, które dodawano
do poszczególnych próbek w objĊtoĞci 25 µl. Próbki kontrolne
inkubowano z PBS. W ĞciĞle okreĞlonym czasie, inkubacjĊ
przerywano przenosząc 200Pl mieszaniny inkubacyjnej do probówki
wirowniczej zawierającej 100Pl oleju silikonowego AR-200 (Wacker
– Chemie, München), scháodzonego do temperatury okoáo 4qC,
i natychmiast wirowano przez 5 sekund przy przyspieszeniu 5000 g
(Beckman, Microfuge
TM
11). W wyniku wirowania, káĊbuszki
nerkowe przechodzą przez olej, formując na dnie probówki osad
káĊbuszkowy, natomiast Ğrodowisko inkubacyjne pozostaje nad
35
warstwą oleju.
4.4.4
Pomiar
objĊtoĞci
wewnątrzkapilarnej
káĊbuszków
nerkowych
Do naczyĔ scyntylacyjnych przeniesiono po 20 Pl supernatantu
z kaĪdej próbki inkubacyjnej, do kolejnych - odciĊty za pomocą
noĪyka koniec probówki wraz z osadem káĊbuszków. Osad
rozpuszczono
w 500 Pl 0,3% Tritonu X-100 mieszając kaĪdą próbkĊ przy pomocy
vortexu (GenieTM2). NastĊpnie do naczyĔ scyntylacyjnych dodano po
2ml scyntylatora tritonowo-ksylenowego (Ultima Gold – Sigma). Tak
przygotowane próbki pozostawiono na 30 minut w zaciemnionym
miejscu. NastĊpnie umieszczono próbki w liczniku scyntylacyjnym
(Wallac 1409 ).
ObjĊtoĞü wewnątrzkapilarną káĊbuszków GIS, wyraĪoną w pikolitrach
(pl),
wyliczono
radioaktywnoĞü
dla
poszczególnych
(wyraĪoną
w
cpm)
próbek
osadu
uwzglĊdniając
káĊbuszkowego
i
supernatantu oraz iloĞü káĊbuszków nerkowych w osadzie, wg wzoru:
[3H]-radioaktywnoĞü osadu (cpm)
GIS =
[3H]-radioaktywnoĞü 1µl supernatantu (cpm) · iloĞü káĊbuszków w
osadzie
W oparciu o pomiar objĊtoĞci inulinowej káĊbuszków nerkowych,
okreĞlano zmiany objĊtoĞci wewnątrzkapilarnej, które wyraĪono jako
36
procent zmian w odniesieniu do wartoĞci podstawowej (wyjĞciowej).
4.5 Obliczenia statystyczne
Przedstawione w pracy wyniki są Ğrednimi arytmetycznymi z 5 – 10
doĞwiadczeĔ ± Ğredni báąd Ğredniej (SE). PrawdopodobieĔstwo
identycznoĞci dwóch Ğrednich oceniano testem ANOVA.
4.6 Odczynniki
Odczynniki uĪyte do doĞwiadczeĔ byáy czystoĞci analitycznej
i pochodziáy z nastĊpujących firm:
Du Pont: Inulina [3H]
Merck: Triton X-100
Polfa: Heparyna
Polskie Odczynniki Chemiczne: NaCl, sulfaminian amonu, NaNO2,
Tween 80, molibdenian amonowy, H2SO4, K2HPO4, LiCl, glukoza
RBI: Inactin
Renal: TCA
Sigma: Ap4A, E,J - MeATP, 2-MeSATP, Suramina, teofilina,
p-aminohipuran
sodu,
N-(1-naftylo)ethylenodiamina,
Na2HPO4,
KH2PO4, KCl, MgCl2, CaCl2, albumina
37
5. WYNIKI
W
pracy
tej
badano
dziaáanie
naturalnego
aktywatora
receptorów purynowych – diadenozynotetrafosforanu (Ap4A) – na
nerkową hemodynamikĊ, diurezĊ i wydalanie elektrolitów z moczem
szczura. NastĊpnie dziaáanie tego dinukleotydu porównano z
nerkowym dziaáaniem ATP, stosując analogi ATP - swoiste agony
receptorów P2X i P2Y.
Uzyskane wyniki z Ap4A potwierdziáy oraz poszerzyáy
wczeĞniejszą wiedzĊ na temat dziaáania dinukleotydu podawanego do
ogólnego krąĪenia krwi na funkcjĊ nerek. Jak przedstawiono na Ryc. 1
i 2, Ap4A w czasie doĪylnej infuzji w dawce 0,2 µmol/kg +
2 nmol/min/kg stymuluje natriurezĊ okoáo 3,5-krotnie nie zmieniając
w statystycznie znamienny sposób diurezy (Ryc. 1A i B). Natomiast
Ap4A
podany
w
dawce
10-krotnie
wiĊkszej
(2µmol/kg
+
20 nmol/min/kg) – oprócz 5-krotnego wzrostu natriurezy oraz okoáo
2-krotnego wzrostu diurezy – redukuje GFR Ğrednio o okoáo 30% w
czasie godzinnej infuzji (Ryc. 2A). Zmiany te pojawiaáy siĊ
stopniowo; maksymalne obniĪenie GFR obserwowano w trzecim
okresie, tj. 40 – 60 min po wáączeniu infuzji Ap4A (Ryc. 2A).
PoniewaĪ Ap4A zwiĊkszaá wydalanie sodu pomimo hamującego
dziaáania na filtracjĊ káĊbuszkową wyliczono, Īe frakcyjne wydalanie
sodu wzrosáo okoáo 4-krotnie juĪ w pierwszym okresie, a w trzecim
okoáo 8-krotnie (Ryc. 2B). Uzyskane dane Ğwiadczą o zahamowaniu
reabsorpcji sodu w kanalikach nerkowych w wyniku podawania Ap4A
do ogólnego krąĪenia krwi.
Jak przedstawiono na Ryc.3, juĪ w pierwszych dwudziestu
minutach infuzji Ap4A dochodziáo do spadku przepáywu osocza przez
nerki (RPF; p ” 0,05), mierzonego klirensem p-aminohipuranu (CPAH)
38
i zmiany te utrzymywaáy siĊ w kolejnych dwóch okresach
doĞwiadczalnych. W czasie infuzji Ap4A nie obserwowano istotnych
zmian Ğredniego ciĞnienia tĊtniczego krwi (MAP). Jak przedstawiono
w Tab. I, wartoĞü MAP w okresie kontrolnym wynosiáa 116 ± 3,1
mmHg, a w czasie godzinnej infuzji Ap4A Ğrednio 113 ± 4,0 mmHg.
RównieĪ hematokryt krwi tĊtniczej (Ht) nie zmieniaá siĊ w tych
doĞwiadczeniach i wynosiá przed podaniem Ap4A Ğrednio 38 ± 2,0%,
a pod koniec infuzji Ap4A 37 ± 3,1% (Tab.1). Na podstawie
uzyskanych danych wyliczono, Īe doĪylna infuzja Ap4A (2 µmol/kg +
20 nmol/min/kg) zwiĊksza opór naczyĔ krwionoĞnych w nerkach
(RVR) z 7,0 ± 0,3 do 10,4 ± 0,6 mmHg/ml min (p < 0,05). Z danych
tych wynika, Īe w czasie doĪylnej infuzji Ap4A zmienia siĊ motoryka
naczyĔ krwionoĞnych w nerkach, czego wynikiem moĪe byü
zahamowanie tempa przepáywu krwi przez nerki i filtracji
káĊbuszkowej.
Dodatkowych danych wskazujących na naczynioruchowe
dziaáanie Ap4A w nerkach dostarczyáy wyniki doĞwiadczeĔ na
izolowanych káĊbuszkach nerkowych szczura, przedstawione na
Ryc.4: Ap4A dodany do zawiesiny káĊbuszków redukowaá przestrzeĔ
wewnątrzkapilarną káĊbuszka (GIS) w stopniu zaleĪnym od jego
stĊĪenia w Ğrodowisku i czasu inkubacji. Maksymalną redukcjĊ GIS o
ok. 18 % w odniesieniu do wartoĞci wyjĞciowej (p ” 0,05),
obserwowano przy 10 nM stĊĪeniu Ap4A w Ğrodowisku. Z obserwacji
tych wynika, Īe pozakomórkowy Ap4A bądĨ produkty jego hydrolizy
(ATP i/lub adenozyna) mogą obkurczaü w warunkach in vivo
naczynia kapilarne káĊbuszków i w konsekwencji redukowaü
przepáyw krwi przez káĊbuszki oraz powierzchniĊ filtracyjną –
czynniki wpáywające na wielkoĞü przesączania nerkowego.
39
PoniewaĪ obserwowane zmiany funkcji nerek indukowane
doĪylną infuzją Ap4A mogą byü efektem dziaáania Ap4A per se , bądĨ
teĪ jego produktów hydrolizy tj. ATP (poprzez receptory P2) i/lub
adenozyny (poprzez receptory P1), w pracy tej podjĊto próbĊ
okreĞlenia grupy receptorów zaangaĪowanych w nerkowe dziaáanie
Ap4A. W celu zidentyfikowania grupy receptorów zaangaĪowanych w
nerkowe dziaáanie Ap4A, nukleotyd ten podawano jednoczeĞnie z
antagonem receptorów P1 – teofiliną - oraz receptorów P2 – suraminą.
DoĞwiadczenia wykazaáy, Īe suramina (12 mg/kg + 0,18
mg/min/kg), przeciwnie do teofiliny (8 µmol/kg + 0,2 µmol/min/kg),
blokuje dziaáanie Ap4A na nerkĊ. Jak przedstawiono na Ryc.5,
obserwowane zmiany GFR po podaniu Ap4A w czasie infuzji teofiliny
byáy porównywalne do tych jakie wystĊpowaáy, gdy w infuzjĊ
wáączono tylko Ap4A. Z kolei Ap4A podany w czasie infuzji suraminy
nie wywieraá istotnych zmian GFR (Ryc.5), ani teĪ nie zwiĊkszaá
diurezy (Ryc.6) i natriurezy (Ryc.7). Z powyĪszych doĞwiadczeĔ
wynika, Īe w nerkowe dziaáanie Ap4A mogą byü zaangaĪowane
receptory P2, których naturalnymi ligandami są zarówno Ap4A, jak i
produkt hydrolizy – ATP.
W kolejnym etapie doĞwiadczeĔ, dziaáanie Ap4A na funkcjĊ
nerek porównano z dziaáaniem ATP. Do doĞwiadczeĔ uĪyto analogi
ATP, oporne na dziaáanie enzymów hydrolizujących tj. ȕ,ȖmetylenoATP (ȕ,Ȗ-MeATP) – selektywny agon receptorów P2X - i 2metylotioATP (2-MeSATP) – selektywny agon receptorów P2Y.
Związki te podawano doĪylnie w dawkach po 2 µmol/kg jednorazowo
oraz 20 nmol/min/kg w infuzji ciągáej.
Jak przedstawiono na Ryc.8, 2-MeSATP w wiĊkszym stopniu
niĪ , Ap4A obniĪyá GFR, maksymalnie juĪ w pierwszym okresie
doĞwiadczalnym - okoáo 40 % w odniesieniu do okresu kontrolnego
40
(p ” 0,05). Statystycznie istotnych zmian GFR nie obserwowano w
czasie infuzji ȕ,Ȗ-MeATP (Ryc.8A). Analog ten w stosowanej dawce
powodowaá okoáo 2,5-krotny wzrost diurezy (Ryc.9), wyraĪonej
zarówno w wartoĞciach bezwzglĊdnych (Ryc. 9A) oraz jako frakcyjne
wydalanie (Ryc. 9B). Jak przedstawiono na Ryc. 10, kaĪdy
z
testowanych
związków
wywoáywaá
natriurezĊ.
Dziaáanie
natriuretyczne obu analogów ATP, wyraĪone jako frakcyjne
wydalania (FENa, Ryc.10B) byáo podobne i nie róĪniáo siĊ istotnie od
wartoĞci FENa okreĞlonej dla grupy zwierząt otrzymującej Ap4A. Na
podstawie uzyskanych danych moĪna wnioskowaü, Īe Ap4A hamuje
reabsorpcjĊ sodu w kanalikach nerkowych za poĞrednictwem
receptorów P2 – podobnie jak selektywny agon receptorów P2X i w
mniejszym stopniu agon receptorów P2Y.
Jak przedstawiono w tabeli II, zwiĊkszonej natriurezie,
indukowanej infuzją testowanych związków, towarzyszyá okoáo 2krotny wzrost frakcyjnego wydalania (FE) jonu chlorkowego
i
jonów
fosforanowych
(Pi).
Wzrost
frakcyjnego
wydalania
powyĪszych jonów z moczem odzwierciedla redukcjĊ reabsorbcji tych
jonóww kanalikach nerkowych w czasie infuzji testowanych agonów.
Tylko w niewielkim stopniu wzrosáo frakcyjne wydalanie jonu
potasowego w czasie infuzji Ap4A i analogów ATP, jednakĪe
przeciwnie do pozostaáych jonów, wzrost ten nie byá statystycznie
zamienny (p>0,05).
W jednej serii doĞwiadczeĔ zwierzĊta dodatkowo obciąĪono
chlorkiem litu w celu zbadania wpáywu Ap4A i analogów ATP na
wydalanie jonów litu z moczem, wskaĨnika reabsorpcji sodu w
kanalikach proksymalnych. Badania przeprowadzono na piĊciu
szczurach w kaĪdej grupie doĞwiadczalnej. Po okresie kontrolnym
jedna grupa zwierząt otrzymaáa w infuzji ciągáej Ap4A, druga
41
ȕ,Ȗ-MeATP, a trzecia 2-MeSATP w dawkach po 2 µmol/kg +
20 nmol/min/kg. Jak przedstawiono w tabeli III, godzinna infuzja
badanych związków wywoáaáa wzrost frakcyjnego wydalania litu
(p ” 0,05); okoáo 3-krotny w czasie infuzji Ap4A lub 2-MeSATP, i
okoáo 2-krotny w czasie infuzji ȕ,Ȗ–MeATP (p<0,05). Uzyskane dane
sugerują, Īe w czasie podawania testowanych agonów receptorów P2
wzrosáa objĊtoĞü páynu opuszczającego kanaliki proksymalne,
odpowiednio 3- i 2-krotnie. Zatem, wzrost frakcyjnego wydalania litu
byá związany z redukcją bezwglĊdnej objĊtoĞci páynu kanalikowego
ulegającego reabsorpcji w kanaliku proksymalnym (Cin – CLi).
Wyliczono, Īe reabsorpcja w kanaliku proksymalnym zmniejszyáa siĊ
2,3-krotnie w doĞwiadczeniach z Ap4A (p<0,05) i 3,5-krotnie z 2MeSATP (p<0,05), a w grupie traktowanej ȕ,Ȗ–MeATP zmniejszyáa
siĊ zaledwie o 30 %. Z kolei wyliczono w dalszych odcinkach
nefronów, Īe reabsorpcja wody (CLi – V) i sodu (CLi – CNa) ulegáa
okoáo 2-krotnemu zwiĊkszeniu. Ostatecznie, frakcyjne wydalanie sodu
z dalszych odcinków nefronu istotnie wzrosáo (p<0,05) tylko w
doĞwiadczeniach z ȕ,Ȗ–MeATP. Dane te sugerują, Īe antagon
receptorów P2X hamuje reabsorpcjĊ sodu równieĪ w dalszych
odcinkach nefronu.
Jednym
ze
Ĩródeá
pozakomórkowych
nukleotydów
adeninowych w nerkach są zakoĔczenia nerwowe. Aby odpowiedzieü
na pytanie, czy w wyniku odnerwienia nerek dochodzi do zmiany
wraĪliwoĞci nerek na dziaáanie Ap4A i ATP, przeprowadzono
doĞwiadczenia na szczurach po obustronnym odnerwieniu nerek.
GrupĊ kontrolną stanowiáy zwierzĊta po zabiegu pozorowanym. Obie
grupy zwierząt w dziewiątym dniu po zabiegu otrzymywaáy doĪylnie
Ap4A i analogi ATP w dawce po 2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg.
42
NaleĪy zaznaczyü, Īe mierzone parametry funkcji nerek w okresie
kontrolnym, jak i w czasie podawania testowanych nukleotydów w
grupie zwierząt po zabiegu pozorowanym (grupa kontrolna) nie
róĪniáy siĊ istotnie od tych opisanych powyĪej, w doĞwiadczeniach
przeprowadzonych na szczurach nie poddawanych Īadnym zabiegom
(Ryc.8, 9, 10). Istotne róĪnice ujawniaáy siĊ w grupie szczurów po
obustronnym odnerwieniu nerek. Zmiany GFR przed i w czasie
podawania Ap4A ilustruje Ryc.11. W okresie wstĊpnym (przed
wáączeniem Ap4A) GFR byáo niĪsze w grupie badanej niĪ w grupie
kontrolnej (p ” 0,05) i obniĪyáo siĊ o okoáo 40 % w czasie podawania
Ap4A. Spadek GFR (ǻ GFR) nie róĪniá siĊ istotnie od zmian GFR
wywoáanych infuzją Ap4A w grupie kontrolnej (Ryc.11). Zmieniáa siĊ
natomiast odpowiedĨ nerek odnerwionych – mierzona zmianami GFR
- na dziaáanie analogów ATP. Jak przedstawiono na Ryc.12, 2MeSATP w dwukrotnie mniejszym stopniu obniĪaá GFR niĪ w grupie
kontrolnej.Z kolei ȕ,Ȗ-MeATP, który w grupie kontrolnej nie zmieniaá
GFR, u zwierząt po odnerwieniu nerek redukowaá GFR, Ğrednio o 15
% w odniesieniu do wartoĞci wyjĞciowych (p<0,05).
W wyniku odnerwienia nerek nie zmieniáa siĊ diureza w okresie
wstĊpnym i wzrosáa po wáączeniu infuzji Ap4A w takim samym
stopniu jak w grupie kontrolnej (Ryc.13). Z kolei efekt diuretyczny
ȕ,Ȗ-MeATP byá okoáo 3-krotnie wiĊkszy w grupie badanej niĪ
w kontrolnej. (Ryc.14). RównieĪ infuzja 2-MeSATP, analogu, który
w grupie kontrolnej nie ujawniaá dziaáania diuretycznego, u zwierząt
po odnerwieniu nerek spowodowaá okoáo dwukrotny wzrost diurezy
(Ryc.14).
NiezaleĪnie od zmian diuretycznych obserwowanych w tych
doĞwiadczeniach, zmiany wydalania sodu z moczem przedstawiaáy siĊ
nastĊpująco (Ryc.15): w okresie wstĊpnym wydalanie sodu u
43
szczurów po odnerwieniu nerek byáo okoáo 4-krotnie wiĊksze niĪ w
grupie kontrolnej (po zabiegu pozorowanym) i ulegáo obniĪeniu po
wáączeniu infuzji Ap4A, osiągając wartoĞci zbliĪone do wyjĞciowych grupy kontrolnej. Podobne dziaáanie ujawniaá 2-MeSATP (Ryc.16). Z
kolei przeciwny efekt obserwowano, gdy zwierzĊta po odnerwieniu
nerek otrzymaáy ȕ,Ȗ-MeATP. Pomimo zwiĊkszonej natriurezy w
okresie wstĊpnym, podanie agona receptorów P2X powodowaáo
dalszy wzrost wydalania sodu, który ostatecznie byá ponad 5-krotnie
wiĊkszy niĪ po podaniu tego związku grupie kontrolnej.
W podsumowaniu: wpáyw odnerwienia nerek na diuretyczne
i natriuretyczne dziaáanie agonów receptorów P2 obrazuje Ryc.17,
przedstawiająca zmiany frakcyjnego wydalania sodu (ǻFENa [%])
i moczu (ǻFEmocz [%]) po podaniu testowanych związków grupie
badanej i kontrolnej. Z przedstawionych danych wynika, Īe Ap4A
oraz 2-MeSATP, czynniki hamujące reabsorpcjĊ sodu w kanalikach
proksymalnych tracą tĊ wáaĞciwoĞü w odnerwionych nerkach,
zachowując jednak hamujące dziaáanie na transport wody. Z kolei
hamujące dziaáanie ȕ,Ȗ-MeATP na kanalikową reabsorpcjĊ sodu i
wody
nasiliáo
siĊ
w
nerkach
odnerwionych.
44
A
4
Ap 4 A 2Pmol/kg + 20 nmol/min/kg
Ap 4 A 0,2 Pmol/kg + 2,0 nmol/min/kg
UNaV [Pmol/min]
3
*
*
*
2
*
*
1
0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
B
45
40
35
V [Pl/min]
30
25
*
20
15
10
5
0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
Ryc. 1. Zmiany wydalania jonu sodowego z moczem (UNaV) oraz diureza w
czasie doĪylnej infuzji Ap4A. BezpoĞrednio po okresie kontrolnym
jedna grupa zwierząt (n=8) otrzymaáa Ap4A – jednorazowo 2 µmol/kg i
w infuzji ciągáej 20 nmol/min/kg, druga grupa (n=5) – Ap4A w dawce
10-krotnie mniejszej. Wyniki wyraĪono w wartoĞciach bezwzglĊdnych;
panel A przedstawia minutowe wydalanie sodu (µmol/min), panel B
przedstawia minutowe wydalanie moczu (µl/min). KaĪdy punkt jest
wartoĞcią Ğrednią ± SE. *p” 0,05 wzglĊdem odpowiednich wartoĞci
wyjĞciowych (okres kontrolny).
45
A
3,0
Ap4A 2 Pmol/kg + 20 nmol/min/kg
Ap4A 0,2 Pmol/kg + 2,0 nmol/min/kg
GFR [ml/min]
2,5
2,0
1,5
*
*
1,0
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
B
2,5
FE Na [%]
2,0
*
*
1,5
*
1,0
*
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
Ryc. 2. Zmiany GFR i frakcyjne wydalanie jonu sodowego z moczem (FENa)
w czasie doĪylnej infuzji Ap4A. Protokóá doĞwiadczenia jak w opisie
Ryc.1. Panel A przedstawia filtracjĊ káĊbuszkową (GFR) wyraĪoną w
wartoĞciach bezwzglĊdnych (ml/min), panel B przedstawia wydalanie
sodu z moczem (FENa) – jako procent áadunku sodu filtrowanego
(GFR·[Na]surowica). KaĪdy punkt jest wartoĞcią Ğrednią (n=5-8)
± SE. *p”0,05 obliczone wzglĊdem okresu kontrolnego.
46
1 2 0
1 1 0
1 0 0
14
12
RPF [ml/min]
MAP [mmHg]
1 3 0
10
8
*
*
*
6
4
-2 0
0
20
40
60
C za s [m in ]
Ryc. 3. Zmiany przepáywu osocza przez nerki (RPF) i ciĞnienie tĊtnicze
(MAP) w czasie doĪylnej infuzji Ap4A (2 µmol/kg + 20
nmol/min/kg). BezpoĞrednio po okresie kontrolnym zwierzĊta
(n=8) otrzymaáy Ap4A – jednorazowo 2 µmol/kg i w infuzji ciągáej
20 nmol/min/kg. RPF oznaczano w oparciu o pomiar klirensu paminohipuranu. KaĪdy punkt jest wartoĞcią Ğrednią (n=8) ± SE.
*p” 0,05 wzglĊdem odpowiednich wartoĞci wyjĞciowych (okres
kontrolny).
47
Tab.I. Przepáyw krwi przez nerki (RBF) i opornoĞü naczyĔ nerkowych
(RVR) w odpowiedzi na doĪylną infuzjĊ Ap4A (2 µmol/kg + 20
nmol/min/kg)
OKRES KONTROLNY
OKRES
DOĝWIADCZALNY
MAP [ mmHg]
116 ± 3,1
113 ± 4,0
Ht [%]
38 ± 2,0
37 ± 3,1
RPF [ml/min]
10,3 ± 1,7
6,9 ± 1,4*
RBF [ml/min]
16,6 ± 2,5
10,9 ± 1,8*
RVR [mmHg/ml min]
7,0 ± 0,3
10,4 ± 0,6*
GFR [ml/min]
1,9 ± 0,2
1,3 ± 0,2*
ObjaĞnienia: MAP – Ğrednie ciĞnienie krwi tĊtniczej; Ht – hematokryt;
RPF – przepáyw osocza przez nerki; RBF – przepáyw krwi przez nerki (RPF/(1Ht); RVR – opornoĞü naczyĔ nerkowych (RVR = MAP/RBF). Wyniki
przedstawiają wartoĞci Ğrednie (n=5) ± SE z okresu kontrolnego (przed
wáączeniem Ap4A) oraz 60 minutowego okresu doĞwiadczalnego (bezpoĞrednio
po wáączeniu infuzji Ap4A).*p< 0,05 obliczone wzglĊdem wartoĞci kontrolnych.
48
GIS [% wartosci podstawowej]
100
10-8M
95
90
10-4M
85
10-6M
80
0
0
2
4
6
8
10
Czas [min]
Ryc. 4. Zmiany objĊtoĞci przestrzeni wewnątrzkapilarnej (GIS) izolowanych
káĊbuszków nerkowych w czasie inkubacji z Ap4A. ZawiesinĊ
káĊbuszków nerkowych (1000 káĊbuszków w 100µl PBS) preinkubowano
z [3H]-inuliną, a nastĊpnie inkubacjĊ kontynuowano z Ap4A o stĊĪeniu
0,01; 1; 100 µM w czasie 0, 1, 2, 5 i 7 minut, w temp. 36ºC. KaĪdy punkt
jest wartoĞcią Ğrednią z 5 doĞwiadczeĔ ± SE. p*” 0,05 obliczone
wzglĊdem wartoĞci podstawowej (czas inkubacji i stĊĪenie Ap4A = 0).
49
T eofilina
lub
A p 4 A (2 Pm ol/kg + 20 nm ol/m in/kg)
S uram ina
A
3,0
140 m M N aC l
Teofilina
S uram ina
GFR [ml/min]
2,5
2,0
1,5
*
*
1,0
*
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
80
C zas [m in]
B
20
140 m M NaCl
S u ra m in a
T e o filin a
10
' GFR [%]
0
-1 0
A p 4 A (-)
A p 4 A (+ )
-2 0
-3 0
*
*
-4 0
Ryc. 5. Wpáyw teofiliny (anty P1) i suraminy (anty P2) na zmiany filtracji
káĊbuszkowej indukowane doĪylną infuzją Ap4A (2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg). Po
okresie kontrolnym jednej grupie zwierząt (n=8), doĪylnie podawano teofilinĊ
(0,8 µmol/kg + 0,2 µmol/min/kg), drugiej grupie (n=6) suraminĊ (12 mg/kg + 0,18
mg/min/kg), a trzeciej – kontrolnej (n=10) 140mM NaCl. Wszystkim trzem grupom
zwierząt w 20 minucie dodatkowo wáączono Ap4A i infuzjĊ kontynuowano przez 60
minut. Panel A ilustruje filtracjĊ káĊbuszkową (GFR) w przebiegu doĞwiadczenia,
wyraĪoną w wartoĞciach bezwzglĊdnych (ml/min). Panel B przedstawia zmiany GFR
wyraĪone w procentach w odniesieniu do okresu kontrolnego - bezpoĞrednio przed
wáączeniem Ap4A (sáupek biaáy) oraz w czasie 60 minut po wáączeniu Ap4A (sáupek
czarny). Wyniki przedstawiają wartoĞci Ğrednie ± SE; *p” 0,05 wzglĊdem wartoĞci
kontrolnych.
50
A
Teofilina
lub
Ap4A (2 Pmol/kg + 20 nmol/min/kg)
Suramina
50
V [Pl/min]
40
140 mM NaCl
Teofilina
Suramina
*
30
*
20
10
0
-20
0
20
40
60
80
Czas [min]
B
8
7
*
FE V [%]
6
A p A (-)
4
A p A (+ )
4
5
4
3
2
1
0
140 m M NaCl
S u ra m in a
T e o filin a
Ryc. 6. Wpáyw teofiliny (anty P1) i suraminy (anty P2) na diuretyczne
dziaáanie Ap4A (2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg). Protokóá doĞwiadczenia
jak w opisie Ryc.5. Panel A ilustruje diurezĊ w przebiegu doĞwiadczenia,
wyraĪoną w wartoĞciach bezwzglĊdnych (µl/min). Panel B przedstawia
frakcyjne wydalanie moczu (%) w czasie 20 minut infuzji antagonu
bezpoĞrednio przed wáączeniem Ap4A (sáupek biaáy) oraz w okresie 60
minut po wáączeniu Ap4A (sáupek czarny). Wyniki przedstawiają wartoĞci
Ğrednie ± SE; *p” 0,05 wzglĊdem wartoĞci kontrolnych.
51
A
Teofilina
lub
Suramina Ap 4 A (2 Pmol/kg + 20 nmol/min/kg)
6
5
*
UNaV [Pmol/min]
*
4
*
140 mM NaCl
Teofilina
Suramina
3
*
2
*
1
0
-20
0
20
40
60
80
Czas [min]
3 ,0
2 ,5
A p 4 A (-)
FENa [%]
2 ,0
A p 4 A (+ )
*
1 ,5
1 ,0
*
0 ,5
0 ,0
140 m M N aC l
S u ra m in a
T e o filin a
Ryc. 7. Wpáyw teofiliny (anty P1) i suraminy (anty P2) na natriuretyczne
dziaáanie Ap4A (2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg). Protokóá doĞwiadczenia jak w
opisie Ryc.5. Panel A ilustruje wydalanie jonu sodowego w przebiegu
doĞwiadczenia, wyraĪone w wartoĞciach bezwzglĊdnych (µmol/min). Panel B
przedstawia frakcyjne wydalanie sodu (%) w czasie 20 min infuzji antagonu
bezpoĞrednio przed wáaczeniem Ap4A (sáupek biaáy) oraz w okresie 60 minut po
wáaczeniu Ap4A (sáupek czarny). Wyniki przedstawiają wartoĞci Ğrednie ± SE;
*p” 0,05 wzglĊdem wartoĞci kontrolnych.
52
A
3,0
Ap4A
EJ-MeATP
2-MeSATP
GFR [ml/min]
2,5
2,0
1,5
*
*
*
*
1,0
*
*
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
B
10
Ap 4 A
EJ-MeATP
2-MeSATP
0
'GFR [%]
-10
-20
-30
-40
-50
*
*
-60
Ryc. 8. Zmiany GFR w czasie doĪynej infuzji analogów ATP – swoistych
agonów receptorów P2X (ȕ,Ȗ-metylenoATP) i P2Y (2metylotioATP). Po okresie kontrolnym jedna grupa zwierząt
otrzymywaáa w infuzji doĪylnej ȕ,Ȗ-metylenoATP (ȕ,Ȗ-MeATP), druga
– 2-metylotioATP (2-MeSATP), a trzecia – kontrolna – Ap4A. KaĪdy
związek podawano w dawkach po 2,0 µmol/kg + 20 nmol/min/kg.
Wyniki wyraĪono w wartoĞciach bezwzglĊdnych (ml/min) – panel A,
oraz jako procent zmian GFR w czasie 60 min infuzji agonu w
odniesieniu do odpowiedniego okresu kontrolnego – panel B. KaĪdy
wynik jest wartoĞcią Ğrednią (n =8) ± SE, *p” 0,05 wzglĊdem wartoĞci
kontrolnej.
53
A
50
Ap4A
EJ-MeATP
2-MeSATP
V [Pl/min]
40
30
*
*
*
*
20
40
20
*
*
10
0
-20
0
60
Czas [min]
B
6
*
5
FEV [%]
4
3
*
2
1
0
Ap4A
E,J-MeATP
2-MeSATP
Ryc. 9. Zmiany diurezy w czasie doĪynej infuzji analogów ATP – swoistych
agonów receptorów P2X (ȕ,Ȗ-metylenoATP) i P2Y (2metylotioATP). Protokóá doĞwiadczenia jak w opisie Ryc.8. Wyniki
wyraĪono w wartoĞciach bezwzglĊdnych (µl/min) – panel A oraz jako
Ğrednie frakcyjne wydalanie moczu przed (sáupek biaáy) i po wáączeniu
testowanych analogów (sáupek czarny) – panel B. KaĪdy punkt jest
wartoĞcią Ğrednią (n = 5-8) ± SE, *p” 0,005 wzglĊdem wartoĞci
kontrolnej.
54
B
A
Ap4A
E-J-Me-ATP
2-Me-S-ATP
3,0
2,5
UNaV [Pmol/min]
*
2,0
*
*
1,5
1,0
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
1,0
*
0,8
*
FENa [%]
*
0,6
0,4
0,2
0,0
Ap4A
E,J-MeATP
2-MeSATP
Ryc. 10. Zmiana wydalania sodu z moczem w czasie doĪylnej infuzji
analogów ATP – swoistych agonów receptorów P2X (ȕ,Ȗ-metylenoATP) i
P2Y (2-metylotioATP). Protokóá doĞwiadczenia jak w opisie Ryc. 8. Wyniki
wyraĪono w wartoĞciach bezwzglĊdnych (µmol/min) – panel A oraz jako Ğrednie
frakcyjne wydalanie sodu z moczem przed (sáupek biaáy) i po wáączeniu
testowanych agonów (sáupek czarny) – panel B. KaĪdy punkt jest wartoĞcia
Ğrednią (n = 8) ± SE. *p” 0,05 wzglĊdem wartoĞcikontrolnej.
55
Tab.II. Wydalanie elektrolitów z moczem przed i w czasie doĪylnej infuzji
Ap4A i analogów ATP (po 2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg)
Ap4A
okres
kontrolny
okres
doĞwiad.
ȕ,Ȗ-MeATP
okres
kontrolny
okres
doĞwiad.
2-MeSATP
okres
kontrolny
okres
doĞwiad.
V
[µl/min]
13,1±3,6
22,8±3,9*
17,1±4,6
31,6±6,2*
20,6±8,5
19,8±4,0
FEV
[%]
0,7±0,2
1,8±0,3*
0,9±0,1
1,7±0,3*
1,0±0,2
1,7±0,2
UNaV
[µmol/min]
1,2±0,2
3,2±0,7*
1,4±0,3
3,6±0,6*
0,9±0,4
2,0±0,4
FENa
[%]
0,4±0,2
1,8±0,4*
0,6±0,2
1,4±0,2*
0,4±0,1
1,2±0,2*
UKV
[µmol/min]
2,2±0,6
2,0±0,7
1.8±0,2
2,0±0,5
1,9±0,3
1,5±0,6
FEK
[%]
30±4,5
39±5,0
24±4,0
28±4,5
24±3,7
32±6,0
UClV
[µmol/min]
2,4±0,2
4,1±0,5
2,7±0,3
4,2±0,7
2,2±0,6
2,3±0,5
FECl
[%]
1,4±0,5
3,2±0,7*
1,5±0,4
2,3±0,4*
1,1±0,3
2,0±0,5*
UPiV
[µmol/min]
0,7±0,1
1,3±0,1*
0,6±0,1
1,1±0,2*
FEPi
[%]
14±1,2
28±1,0*
13±0,9
24±1,3*
0,7±0,2
12±0,7
1,0±0,1
35±1,4*
ObjaĞnienia: V – diureza wyraĪona w µl/min; FEV – frakcyjne wydalanie moczu
wyraĪone %; UElek.V – wydalanie elektrolitów (sodu, potasu, chlorku, fosforanu) z
moczem wyraĪone w wartoĞciach bezwzglĊdnych (µmol/min); EFElek.(%)- frakcyjne
wydalanie elektrolitów z moczem. KaĪdy wynik jest wartoĞcią Ğrednią ( n = 5 w
kaĪdej grupie) ± SE z okresu kontrolnego (wstĊpnego) oraz 60 minutowego okresu
56
doĞwiadczalnego.
kontrolnego.
*p<0,05
obliczone
wzglĊdem
odpowiedniego
okresu
Tab. III. WskaĨniki funkcji kanalików nerkowych przed i w czasie doĪylnej
infuzji Ap4A i analogów ATP (po 2 µmol/kg + 20nmol/min/kg)
Ap4A
okres
kontrolny
FELi
[%]
okres
doĞwiad.
ȕ,Ȗ-MeATP
okres
kontrolny
okres
doĞwiad.
2-MeSATP
okres
kontrolny
17±6,0
okres
doĞwiad.
17±4.0
48±11*
18±4,1
35±8,0*
58±12*
1543±121
655±115*
1510±118
1060±123
1690±180 485±171*
294±30
582±155
313±112
548±103
319±145
665±148
4,2±2,0
4,0±1,8
5,1±0,9
5,4±1,2
6,2±1,4
3,0±1,5
299±26
582±175
320±93
505±118
333±127
671±122
2,6±1,2
3,5±1,1
3,1±0,8
5,5±0,9*
2,1±1,2
2,2±1,0
Cin - CLi
CLi - V
V/CLi
[%]
CLi - CNa
CNa/CLi
[%]
ObjaĞnienia: FELi = frakcyjne wydalanie Li z moczem [%]; Cin – CLi =
reabsorpcja przesączu w kanalikach proksymalnych [µl/min]; CLi – V =
reabsorpcja wody w dalszych czĊĞciach nefronów; V/CLi = frakcyjne wydalanie
wody z dalszych czĊĞci nefronów [%]; CLi – CNa = reabsorpcja sodu w dalszych
czĊĞciach nefronów; CNa/CLi = frakcyjne wydalanie sodu z dalszych czĊĞci
nefronów. Wyniki przedstawiają wartoĞci Ğrednie (n = 5 w kaĪdej grupie) ± SE z
okresu kontrolnego (wstĊpnego) oraz 60 minutowego okresu doĞwiadczalnego
(bezpoĞrednio po wáączeniu testowanych związków). *p<0,05 obliczono
wzglĊdem odpowiedniego okresu kontrolnego.
57
Ap4A (2 Pmol/kg + 20 nmol/min/kg)
3,0
GFR [ml/min]
2,5
szczury po odnerwieniu nerek
szczury (kontrolne) po zabiegu
pozorowanym
2,0
1,5
#
*
1,0
*
#
#*
*
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
Ryc.11. Wpáyw odnerwienia na filtracjĊ káĊbuszkową (GFR) indukowaną infuzją
Ap4A. Po okresie kontrolnym grupa zwierząt badanych oraz grupa kontrolna
(po zabiegu pozorowanym) otrzymaáy w infuzji doĪylnej Ap4A w dawce
po 2 µmol/kg + 20 nmol/min/kg. Wyniki wyraĪono w wartoĞciach
bezwzglĊdnych (ml/min) w przebiegu doĞwiadczenia. KaĪdy punkt jest
wartoĞcią Ğrednią (n = 5) ± SE. *p ” 0,05 obliczone wzglĊdem odpowiedniego
okresu kontrolnego,#p” 0,05 obliczone wzglĊdem odpowiedniego okresu
w grupie po zabiegu pozorowanym.
10
A p 4A
E ,J -M e A T P
2 -M e S A T P
0
-1 0
' GFR [%]
*
-2 0
*
*
*
-3 0
-4 0
-5 0
-6 0
s z c z u ry (k o n tro ln e ) p o z a b ie g u p o z o ro w a n y m
s z c z u ry p o o d n e rw ie n iu n e re k
Ryc.12. Wpáyw odnerwienia na filtracjĊ káĊbuszkową (GFR) indukowaną infuzją
analogów ATP. Po okresie kontrolnym jedna grupa zwierząt otrzymaáa w
infuzji doĪylnej ȕ,Ȗ-metylenoATP (ȕ,Ȗ-MeATP), druga - 2-metylotioATP (2MeSATP), i dla porównania trzecia – Ap4A - w dawkach po 2 µmol/kg + 20
nmol/min/kg. GrupĊ kontrolną stanowiáy zwierzĊta po zabiegu upozorowanym,
które otrzymaáy testowane związki w dawkach jw. Wyniki wyraĪono jako
procent zmian GFR w czasie 60 minut infuzji testowanych związków w
odniesieniu do odpowiednich wartoĞci wyjĞciowych (okres kontrolny). KaĪdy
punkt jest wartoĞcią Ğrednią (n= 5) ± SE. *p ” 0,005 obliczone wzglĊdem
odpowiedniego okresu kontrolnego.
58
Ap 4A (2 Pmol/kg + 20 nmol/min/kg)
60
50
*
V [Pl/min]
40
szczury po odnerwieniu nerek
szczury (kontrolne) po zabiegu
pozorowanym
30
*
20
10
0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
Ryc. 13. Wpáyw odnerwienia na diurezĊ indukowaną infuzją Ap4A. Protokóá
doĞwiadczenia jak w opisie Ryc.11. Wyniki wyraĪono w wartoĞciach
bezwzglĊdnych (µl/min) w przebiegu doĞwiadczenia. KaĪdy punkt jest
wartoĞcią Ğrednią (n = 5) ± SE. *p ” 0,05 obliczone wzglĊdem
odpowiedniego okresu kontrolnego.
400
*
350
300
szczury (kontrolne) po zabiegu
pozorowanym
szczury po odnerwieniu nerek
' V [%]
250
200
150
100
*
*
50
0
-50
-100
Ap4A
E,J-MeATP
2-MeSATP
Ryc. 14. Wpáyw odnerwienia na diurezĊ indukowaną infuzją analogów ATP.
Protokóá doĞwiadczenia jak w opisie Ryc.12. Wyniki wyraĪono jako
procent zmian diurezy w czasie 60 minut infuzji testowanych związków
w odniesieniu do odpowiednich wartoĞci wyjĞciowych (okres
kontrolny). KaĪdy punkt jest wartoĞcią Ğrednią (n = 5) ± SE. *p ” 0,05
obliczone wzglĊdem odpowiedniego okresu kontrolnego.
59
Ap4A (2 Pmol/kg + 20 nmol/min/kg)
4,0
3,5
szczury po odnerwieniu nerek
szczury (kontrolne) po zabiegu pozorowanym
UNaV [Pmol/min]
3,0
2,5
#
#
2,0
*
1,5
*
1,0
*
0,5
0,0
-20
0
20
40
60
Czas [min]
Ryc. 15. Wpáyw odnerwienia na natriurezĊ indukowaną infuzją Ap4A.
Protokóá doĞwiadczenia jak w opisie Ryc.11. Wyniki wyraĪono w
wartoĞciach bezwzglĊdnych (µmol/min) w przebiegu doĞwiadczenia.
KaĪdy punkt jest wartoĞcią Ğrednią (n = 5) ± SE. *p ” 0,05 obliczone
wzglĊdem odpowiedniego okresu kontrolnego. #p ” 0,05 obliczone
wzglĊdem odpowiedniego okresu w grupie po zabiegu pozorowanym.
800
*#
' UNAV [%]
600
szczury (kontrolne) po zabiegu
pozorowanym
szczury po odnerwieniu nerek
400
*
200
*
#
0
#
-200
Ap 4 A
E,J-MeATP
2-MeSATP
Ryc. 16. Wpáyw odnerwienia na natriurezĊ indukowaną infuzją analogów
ATP. Protokóá doĞwiadczenia jak w opisie Ryc. 12. Wyniki wyraĪono
jako procent zmian GFR w czasie 60 minut infuzji testowanych
związków w odniesieniu do odpowiednich wartoĞci wyjĞciowych (okres
kontrolny). KaĪdy punkt jest wartoĞcią Ğrednią (n = 5) ± SE. *p ” 0,05
obliczone wzglĊdem odpowiedniego okresu kontrolnego, #p ” 0,05
obliczone wzglĊdem odpowiedniej grupy kontrolnej.
60
A
1000
*#
800
' FENa [%]
600
400
*
*
200
*
#
0
#
Ap4A
E,J-MeATP
2-MeSATP
-200
B
szczury (kontrolne) po zabiegu
pozorowanym
szczury po odnerwieniu nerek
600
#*
*
*
' FE mocz [%]
400
200
*
*
0
Ap4A
E,J-MeATP
2-MeSATP
Ryc. 17. Wpáyw odnerwienia na frakcyjne wydalanie sodu z moczem
indukowane infuzją Ap4A i analogów ATP. Protokóá doĞwiadczenia jak
w opisie Ryc. 12. Wyniki wyraĪono jako procent zmian frakcyjnego
wydalania sodu (FENa) i moczu (FEUV) w odniesieniu do odpowiednich
wartoĞci podstawowych (okres kontrolny) w grupie po zabiegu
pozorowanym (sáupek biaáy) oraz w grupie szczurów po przewlekáym
odnerwieniu nerek (sáupek czarny). KaĪdy punkt jest wartoĞcią Ğrednią (n
= 5) ± SE. *p ”0,05 obliczone wzglĊdem wartoĞci podstawowej (okres
kontrolny), #p ” 0,05 obliczone wzglĊdem grupy zwierząt po zabiegu
pozorowanym.
61
6. DYSKUSJA
Wyniki
przeprowadzonych
doĞwiadczeĔ
potwierdzają
wczeĞniejsze obserwacje [70] oraz dostarczają dalszych dowodów
wskazujących, Īe doĪylne podanie Ap4A wywoáuje natriurezĊ i
diurezĊ bez istotnych zmian w wydalaniu potasu. W wiĊkszej dawce
hamuje równieĪ hemodynamikĊ nerkową (przepáyw krwi przez nerki;
RBF) i w konsekwencji prĊdkoĞü przesączania káĊbuszkowego (GFR).
Diuretyczne i natriuretyczne dziaáanie Ap4A, które wystĊpuje pomimo
spadku filtracji káĊbuszkowej dowodzi, Īe nukleotyd ten dziaáa na
mechanizm transportu sodu w kanalikach nerkowych.
Podobne zmiany funkcji nerek, chociaĪ z nieco innym
nasileniem, obserwowano, gdy szczurom doĪylnie podano analogi
ATP, tj. ȕ,Ȗ-MeATP oraz 2-MeSATP. WczeĞniej opisano, Īe związki
te są swoistymi agonami receptorów P2: ȕ,Ȗ MeATP – agon
receptorów P2X oraz 2-MeSATP – agon receptorów P2Y. Aktywator
receptorów P2X stymulowaá diurezĊ i natriurezĊ, bez istotnych zmian
GFR, podczas gdy aktywator receptorów P2Y w znacznie wiĊkszym
stopniu obniĪaá GFR niĪ podany w tej samej dawce Ap4A (Ryc.8, 9
i 10).
Znamienny
wzrost
frakcyjnego
wydalania
(FE)
jonów
sodowych, chlorkowych i fosforanowych wskazuje, Īe znaczna czĊĞü
tych jonów wczeĞniej przefiltrowanych w káĊbuszkach nerkowych
ulega wydalaniu z moczem w nastĊpstwie podania do krąĪenia Ap4A
lub analogów ATP. ZwiĊkszeniu ulegáo równieĪ frakcyjne wydalanie
litu sugerując, Īe kanaliki proksymalne mogą byü gáównym miejscem
zahamowania wcháaniania zwrotnego sodu.
WczeĞniej opisano [75], Īe w kanalikach proksymalnych jony
litu ulegają reabsorpcji w iloĞciach proporcjonalnych do jonów sodu,
62
natomiast w dalszych czĊĞciach nefronu lit praktycznie nie ulega
reabsorpcji. Z innych badaĔ wynika, Īe lit moĪe ulegaü reabsorpcji
równieĪ w dalszych czĊĞciach nefronu w warunkach ograniczonej
podaĪy sodu [74]. W obecnie prezentowanych doĞwiadczeniach
zwierzĊta byáy karmione dietą standardową, a zatem moĪna przyjąü,
Īe
w
tych
warunkach
doĞwiadczalnych,
klirens
litu
jest
wyznacznikiem objĊtoĞci izotonicznego páynu opuszczającego kanalik
proksymalny i poĞrednio iloĞci jonów sodowych wpáywających do
dalszych czĊĞci nefronu. Zastosowanie tej techniki w obecnych
doĞwiadczeniach pozwoliáo wykazaü, Īe Ap4A i 2-MeSATP oraz w
mniejszym
stopniu
ȕ,Ȗ-MeATP
zwiĊkszają
objĊtoĞü
páynu
opuszczającego kanaliki proksymalne. Otrzymane dane uwidoczniáy
równieĪ, Īe ȕ,Ȗ-MeATP zwiĊksza frakcyjne wydalanie sodu z
dalszych czĊĞci nefronu sugerując, Īe analog ten hamuje reabsorpcjĊ
sodu równieĪ w tej czĊĞci nefronu. Z kolei zmiany wywoáane infuzją
Ap4A, czy teĪ 2-MeSATP w dalszych czĊĞciach nefronów nie byáy
statystycznie znamienne. JednakĪe zbyt duĪy rozrzut uzyskanych
wartoĞci dla klirensu litu i sodu mógá przyczyniü siĊ do zaciemnienia
ewentualnych zmian w reabsorpcji sodu w tej czĊĞci nefronów.
W pracy tej wykazaáam, Īe Ap4A obniĪa GFR powodując
jednoczeĞnie spadek RBF bez istotnych zmian Ğredniego ciĞnienia
tĊtniczego krwi (MAP). Wyniki te sugerują, Īe zmniejszony przepáyw
krwi przez nerki moĪe byü konsekwencją zwiĊkszonego oporu naczyĔ
wewnątrz-nerkowych. W oparciu o uzyskane dane wyliczono, Īe
Ap4A zwiĊkszyá opornoĞü naczyĔ nerkowych okoáo 50%. Dane te
potwierdzają wczeĞniejsze obserwacje dotyczące zmian nerkowej
hemodynamiki w doĞwiadczeniach klirensowych z Ap4A [70] oraz na
modelu
perfundowanej
nerki
[38].
Dodatkowym
dowodem
wskazującym na moĪliwoĞü bezpoĞredniego oddziaáywania ApnA na
63
system naczyĔ krwionoĞnych w nerkach są wyniki doĞwiadczeĔ in
vitro na izolowanych káĊbuszkach nerkowych - przedstawione na Ryc.
4 oraz opublikowane przez nas w Br. J. Pharmacol [69]. Ap4A
zmniejszaá objĊtoĞü wenątrzkapilarną káĊbuszka nerkowego (GIS) w
stopniu zaleĪnym od jego stĊĪenia w Ğrodowisku zewnĊtrznym i czasu
inkubacji. Zmiany GIS wystĊpowaáy równieĪ w obecnoĞci Ap3A i
Ap5A i byáy odwracalne w obecnoĞci antagonów receptorów P2 suraminy oraz báĊkitu reaktywnego-2. JednakĪe w doĞwiadczeniach
tych, jak i w obecnie prezentowanej pracy, nie ustalono czy zmiany
dynamiki naczyĔ nerkowych są efektem dziaáania Ap4A per se, czy
teĪ produktu jego hydrolizy - ATP. Wysoka aktywnoĞü w káĊbuszkach
nerkowych ekto-enzymów hydrolizujących dinykleotydy adeninowe
do naczynioaktywnych mononukleotydów wskazuje, Īe Ap4A
pojawiający siĊ w tej czĊĞci nefronu moĪe byü Ĩródáem ATP. Z kolei
ATP, jak wykazaáy wczeĞniejsze badania, za poĞrednictwem
receptorów P2X i P2Y - zlokalizowanych na komórkach kurczliwych
káĊbuszka – wywoáuje skurcz, a za poĞrednictwem receptorów P2Y –
zlokalizowanych na komórkach Ğródbáonka – relaksacjĊ naczyĔ
kapilarnych káĊbuszka [32]. Wydaje siĊ wiĊc moĪliwe, Īe zmiany
funkcji nerek szczura w czasie doĪylnej infuzji Ap4A są wywoáane,
przynajmniej czĊĞciowo, przez ATP.
Obserwowany spadek GFR w obecnie prezentowanych
doĞwiadczeniach, szczególnie w tych z uĪyciem Ap4A i 2-MeSATP,
moĪe byü wynikiem uruchomienia mechanizmu ujemnego sprzĊĪenia
kanalikowo-káĊbuszkowego poprzez zwiĊkszony dowóz sodu do
dalszych czĊĞci nefronu (Cin – CLi). Mechanizm ten, w warunkach
zwiĊkszonego áadunku sodu napáywającego w okolice macula densa,
stymuluje spadek GFR w pojedynczym nefronie. Postulowany jest
pogląd, Īe mediatorem sprzĊĪenia zwrotnego jest adenozyna i jej
64
receptory A1 [61] i/lub ATP [46]. JednakĪe zastosowanie w obecnych
doĞwiadczeniach teofiliny - antagona receptorów adenozyny – nie
miaáo istotnego wpáywu na hamujące dziaáanie Ap4A na filtracjĊ. Z
kolei suramina – antagon receptorów P2 caákowicie blokowaáa
dziaáanie Ap4A na funkcjĊ nerek, co potwierdza moĪliwoĞü dziaáania
Ap4A i/lub jego metabolitu – ATP za poĞrednictwem receptorów P2na funkcjĊ káĊbuszka nerkowego i kanalika.
W doĞwiadczeniach, w których obniĪono aktywnoĞü ukáadu
wspóáczulnego nerek, poprzez przeciĊcie nerwów nerkowych,
obserwowano spadek GFR (ok. 20%; Ryc.11) i wzrost wydalania
sodu z moczem (ok. 4-krotny; Ryc.15) w odniesieniu do grupy
zwierząt,
której
potwierdzają
wykonano
fizjologiczną
zabieg
pozorowany.
odpowiedĨ
Wyniki
nerek,
te
wyraĪoną
zahamowaniem reabsorpcji sodu, w warunkach obniĪonej aktywnoĞci
wspóáczulnej nerek i mogą byü traktowane jako potwierdzenie
efektywnoĞci
dokonanego
zabiegu
odnerwienia
[17].
NaleĪy
nadmieniü, iĪ dla peánego potwierdzenia efektywnoĞci odnerwienia
naleĪaáoby oznaczyü stĊĪenie noradrenaliny w nerce. Zastosowany w
obecnej pracy model przewlekáego, obustronnego odnerwienia nerek
pozwoliá
zbadaü
odpowiedĨ
nerek
na
pobudzenie
ukáadu
purynergicznego w sytuacji obniĪonej/zniesionej aktywnoĞci ukáadu
wspóáczulnego. UĪycie w tych doĞwiadczeniach swoistych agonów
receptorów purynowych pozwoliáo na analizĊ udziaáu receptorów P2X
i P2Y w regulacji funkcji nerek. W piĞmiennictwie znajduje siĊ wiele
doniesieĔ, z których wynika, Īe odnerwienie moĪe modyfikowaü
odpowiedĨ naczyĔ na egzogenne neurotransmitery, czy teĪ hormony
oraz czynniki o charakterze auto/parakrynym. Stwierdzono, Īe
izolowane káĊbuszki nerkowe – pochodzące z farmakologicznie
odnerwionych nerek – pod wpáywem noradrenaliny w wiĊkszym
65
stopniu
akumulują
inozytolo-trifosforan
(IP3),
niĪ
káĊbuszki
pochodzące od szczurów normalnych [6]. Przewlekáe odnerwienie
nerki zmienia jej odpowiedĨ na podawaną do krąĪenia noradrenalinĊ
[35]. W normalnych warunkach noradrenalina obkurcza naczynia
krwionoĞne nerek oraz stymuluje reabsorpcjĊ sodu, a dziaáanie to jest
nasilone w nerce z obniĪoną/zniesioną podstawową aktywnoĞcią
ukáadu sympatycznego. ZwiĊkszona reaktywnoĞü narządów na
noradrenalinĊ prawdopodobnie jest wynikiem zwiĊkszonej ekspresji
synaptycznych receptorów dla noradrenaliny tj. receptorów Į1 [17].
Odnerwienie nerek zwiĊksza fosfaturyczny efekt dziaáania PTH na
kanalik proksymalny [42]. RównieĪ odpowiedĨ odnerwionych
narządów na dziaáanie agonów receptorów purynowych byáa
przedmiotem
badaĔ,
chociaĪ
stosunkowo
nielicznych.
W
doĞwiadczeniach na odnerwionej nerce wykazano, Īe aktywnoĞü
reninowa osocza indukowana agonami receptorów adenozynowych A2
jest mniejsza w warunkach odnerwienia [59]. DoĞwiadczenia te
sugerują, iĪ uwalnianie reniny pod wpáywem aktywacji receptorów A2
jest wspomagane w obecnoĞci podstawowej aktywnoĞci sympatycznej
nerek. Stymulacja receptorów adenozyny, A1 i A2 w nerkach,
prowadzi do zmian w hemodynamice nerek oraz ich funkcji
wydalniczej
[13,47,77].
Wykazano,
Īe
aktywnoĞü
ukáadu
sympatycznego zmienia wraĪliwoĞü nerek na dziaáanie agonów
receptorów A1 i A2. Na modelu ostrego odnerwienia (40 minut po
zabiegu
przeciĊcia
nerwów
nerkowych)
wykazano,
Īe
agon
receptorów A2 tj. NECA w mniejszym stopniu hamuje wydalanie sodu
niĪ w nerce unerwionej. Takiego efektu nie zaobserwowano w
odniesieniu do agona receptorów A1 tj. CCPA [54]. Z kolei w
warunkach obniĪonej/zniesionej podstawowej aktywnoĞci ukáadu
sympatycznego w wyniku przewlekáego odnerwienia nerek (3-6 dni
66
po zabiegu), stwierdzono wzmoĪony efekt dziaáania agona receptorów
A1, co objawiaáo siĊ znacznie wiĊkszym spadkiem GFR, RBF i
zwiĊkszoną reabsorpcją sodu i potasu niĪ u zwierząt normalnych [15].
Wyniki
obecnie
przeprowadzonych
doĞwiadczeĔ
wskazują,
Īe odpowiedĨ nerek na Ap4A i niemetabolizujące siĊ analogi ATP
ulega
równieĪ
podstawowej
modyfikacji
aktywnoĞci
w
ukáadu
sytuacji
obniĪenia/zniesienia
symaptycznego
nerek.
W
doĞwiadczeniach tych wykazaáam, Īe przewlekáe odnerwienie nerek
powoduje, iĪ stają siĊ one oporne na natriuretyczne dziaáanie Ap4A i
agona receptorów P2Y – 2-MeSATP. Podobną natriuretyczną
opornoĞü odnerwionej nerki opisano w stosunku do dopaminy [29].
W warunkach fizjologicznych wielkoĞü natriurezy jest regulowana w
przewaĪającej
mierze
przez
aktywnoĞü
Na+-K+-ATPazy
zlokalizowanej w báonie podstawno-bocznej komórek kanalików
(bliĪszych i dalszych). W mniejszym stopniu wielkoĞü natriurezy jest
zaleĪna od aktywnoĞci transportu wymiennego jonu sodowego na jon
wodorowy. Na+-K+-ATPaza jest fosfoproteiną; fosforylacja zmniejsza
a defosforylacja zwiĊksza jej aktywnoĞü. Istotnym czynnikiem
fizjologicznym, który aktywuje Na+-K+-ATPazĊ jest noradrenalina
uwalniana z zakoĔczeĔ nerwowych w nerkach. Poprzez aktywacjĊ
fosfatazy biaákowej zaleĪnej od kalmoduliny, tj. kalcineuryny,
dochodzi do defosforylacji Na+-K+-ATPazy albo innych biaáek, które
wpáywają poĞrednio na aktywnoĞü Na+-K+-ATPazy tj. fosfoproteiny
regulowanej przez dopaminĊ i cykliczny AMP. Konsekwencją
wzrostu aktywnoĞci Na+-K+-ATPazy jest zwiĊkszone wcháanianie
zwrotne jonów sodu oraz związków transportowanych z jonami sodu
np. fosforan, glukoza. Stąd teĪ obserwuje siĊ zmniejszoną natriurezĊ
pod wpáywem aktywacji ukáadu sympatycznego nerek, a z drugiej
strony zwiĊkszone wydalanie sodu z moczem w wyniku odnerwienia
67
nerki. Do innych czynników regulujących natriurezĊ naleĪy równieĪ
dopomina. Poprzez rodzinĊ receptorów (D1-5) rozmieszczonych
wzdáuĪ nefronu, sprzĊĪonych z biaákami G aktywuje ona kinazĊ
biaákową A (PKA) lub kinazĊ biaákową C (PKC), która z kolei
aktywuje fosfolipazĊ A2 (PLA2). Enzym ten zwiĊksza metabolizm
kwasu arachidonowego w cytochromie P-450 i powstanie 20-HETE.
Zarówno PKA, jak i PKC oraz 20-HETE zwiĊkszają stopieĔ
ufosforylowania Na+-K+-ATPazy, co wiedzie do obniĪenia jej
aktywnoĞci, a to z kolei do zmniejszonego wcháaniania zwrotnego
sodu [12]. W nerkach dopamina jest uwalniana z zakoĔczeĔ
nerwowych. Produkowana jest równieĪ przez komórki kanalika
bliĪszego i dlatego przewlekáe odnerwienie nie wpáywa na jej stĊĪenie
w páynie pozakomórkowym nerek. MoĪna wiĊc zaáoĪyü, Īe
w
przewlekáym
odnerwieniu,
przy
niedoborze
noradrenaliny
i prawidáowym stĊĪeniu dopaminy, Na+-K+-ATPaza znajduje siĊ w
stanie wzmoĪonej fosforylacji. Wydaje siĊ, Īe dalsza fosforylacja
indukowana przez inne czynniki nie jest moĪliwa i dlatego teĪ pojawia
siĊ opornoĞü odnerwionych nerek na natriuretyczne dziaáanie
endogennej dopaminy. Ap4A, podobnie jak dopomina, nie wywieraá
efektu natriuretycznego w nerce odnerwionej. U podáoĪa opornoĞci
nerek odnerwionych na dziaáanie Ap4A, czy teĪ agona receptorów
P2Y, moĪe znajdowaü siĊ podobny mechanizm jaki opisano dla
dopaminy. Obecne badania z zastosowaniem antagonów i agonów
receptorów
P2
sugerują,
Īe
Ap4A
wywoáuje
natriurezĊ
za
poĞrednictwem receptorów P2Y. Z badaĔ nad receptorami P2Y
wynika, Īe Ap4A aktywuje receptory P2Y2 i P2Y11. Receptory P2Y2
zlokalizowane są przede wszystkim w kanaliku bliĪszym, natomiast
receptory P2Y11 gáównie w kanaliku dalszym. Pobudzenie receptorów
P2Y2 prowadzi do wzrostu aktywnoĞci PKC, natomiast w wyniku
68
pobudzenia receptorów P2Y11 wzrasta stĊĪenie cyklicznego AMP, co
moĪe sugerowaü zaangaĪowanie PKA. MoĪna postawiü hipotezĊ
badawczą, Īe natriuretyczne dziaáanie Ap4A jest związane z aktywacją
receptorów P2Y1 i P2Y11 i jest nastĊpstwem fosforylacji Na+-K+ATPazy przez PKA i PKC. Ocena stopnia fosforylacji Na+-K+ATPazy
w
poszczególnych
zastosowanie
swoistych
odcinkach
antagonów
nefronów,
receptorów
a
takĪe
P2
(P2Y2
i P2Y11) pozwoliáoby na potwierdzenie stawianej hipotezy.
W pracy tej wykazaáam równieĪ, Īe w nerce odnerwionej
w wiĊkszym stopniu niĪ w nerce unerwionej ujawniają siĊ
naczyniowe
i
kanalikowe
dziaáania
agona
receptorów
P2X.
Pobudzenie receptorów P2X zwiĊksza wydalanie wody i sodu z
moczem w wiĊkszym stopniu w nerce odnerwionej, niĪ unerwionej.
W doĞwiadczeniach na hodowanych komórkach kanalika dalszego
wykazano, Īe agony receptorów P2X zmniejszają transport sodu do
komórki [43], czego konsekwencją w warunkach in vivo moĪe byü
zwiĊkszona natriureza. Nasilenie natriuretycznego dziaáania agona
dla receptorów P2X w nerce przewlekle odnerwionej moĪe wynikaü
ze wzrostu iloĞci receptorów P2X w zakoĔczeniach nerwowych,
podobnie, jak to ma miejsce dla receptorów noradrenaliny.
ZwiĊkszona
reaktywnoĞü
obniĪonego/zniesionego
kanalika
napiĊcia
nerkowego
ukáadu
w
sytuacji
sympatycznego
nerek
wskazuje, Īe receptory P2X znajdują siĊ pod tonicznym hamującym
wpáywem ukáadu nerwowego. RównieĪ w nerce odnerwionej
dochodzi do odmiennej odpowiedzi systemu naczyĔ tĊtniczych nerki
na pobudzenie receptorów P2X, czego konsekwencją jest spadek
GFR, jakiego nie obserwowano w nerce unerwionej. Obserwowany
spadek
GFR
moĪe
byü
wynikiem
obkurczenia
tĊtniczki
69
doprowadzającej, gdzie obok receptorów P2Y obecne są receptory
P2X.
Z przeprowadzonych doĞwiadczeĔ wynika, Īe obniĪenie
aktywnoĞci ukáadu adrenergicznego, poprzez odnerwienie nerek,
w zasadniczy sposób zmienia natriuretyczny i diuretyczny efekt
dziaáania nukleotydów adeninowych na nerkĊ. Obserwacje te
wskazują na powiązanie systemu purynergicznego z aktywnoĞcią
ukáadu adrenergicznego w nerkach. PoniewaĪ nerka odnerwiona
stanowi model zbliĪony do nerki przeszczepionej, dlatego teĪ
scharakteryzowanie mechanizmu wzajemnej relacji obu ukáadów
kontrolujących hemodynamikĊ i transport sodu w kanalikach
nerkowych przyczyni siĊ do lepszego zrozumienia fizjologii i
biochemii nerki przeszczepionej – i wymaga dalszych badaĔ.
70
7. WNIOSKI
DoĪylna infuzja Ap4A zmienia funkcjĊ nerek – wywoáuje
natriurezĊ i diurezĊ oraz hamuje tempo filtracji káebuszkowej.
W dziaáanie to zaangaĪowane są receptory P2, których aktywatorem
moĪe byü zarówno Ap4A, jak i produkt jego hydrolizy – ATP.
Nukleotydy te za poĞrednictwem receptorów P2X i P2Y stymulują
natriurezĊ, a za poĞrednictwem receptorów P2Y hamują prĊdkoĞü
filtracji káĊbuszkowej.
ObniĪona – w wyniku odnerwienia nerek – aktywnoĞü ukáadu
wspóáczulnego czyni nerki niewraĪliwe na natriuretyczne dziaáanie
agonów receptorów P2Y, podczas gdy zwiĊksza wraĪliwoĞü na
dziaáanie agonów receptorów P2X. Na tej podstawie wnioskujemy, Īe
ukáad purynergiczny – szczególnie receptory P2X zlokalizowane w
obrĊbie kanalików nerkowych – znajdują siĊ pod hamującym
wpáywem ukáadu sympatycznego. Z kolei efekt aktywacji receptorów
P2Y wystĊpuje przy wspóáistnieniu podstawowej aktywnoĞci ukáadu
sympatycznego.
71
8. PIĝMIENNICTWO
1. Abbracchio M.P., Burnstock G. Purinoreceptors: are there families
of P2X and P2Y purinoreceptors? Pharmacol Ther., 1994; 64(3):
445-75.
2. Anderson S.: Relevance of single nephron studies to human
glomerular function. Kidney Int. 1994; 45: 384-389.
3. Angielski S., Kuchta G., Redlak M., SzczepaĔska-Konkel M.:
Attenuated glomerular responses to atria natriuretic factor in lowsodium rats prevented by theophyline. Biochem Biophys. Res
Commun., 1990; 31(170): 596-602.
4. Ausiello D.A., Kreisberg J.I., Roy C., Karnovsky M.J.: Contraction
of cultured rat glomerular cells of apparent mesangial origin after
stimulation with agiotensin II and arginin vasopressin. J. Clin.
Invest. 1980; 65: 754-760.
5. Bagorda A., Guerra L., Di Sole F., Helmle-Klob C., Favia M.,
Jacobson K.A., Casavola V., Reshkin S.J.: Extracellular adenine
nucleotides regulate Na+/H+ exchanger NHE3 activity in A6-NHE3
transfectans by a cAMP/PKA-dependent mechanism. J Membr
Biol. 2002; 188: 249-259.
6. Bailey M.A., Turner C.M., Hus-Citharel A., Marchetti J., ImbertTeboul M., Milner P., Burnstock G., Unwin R.J.: P2Y Receptors
Present in the Native and Isolated Rat Glomerulus. Nephron
Physiol. 2004; 96: 79-90.
7. Blantz
R.C.,
Pelayo
J.C.:
A
functional
role
for
the
tubuloglomerular feedback mechanism. Kidney Int. 1984; 25:
739-746.
72
8. Blanz R.C., Gabbai F.B., Tucker B.J., Yamamoto T., Wilson C.B.:
Role of mesangial cell in glomerular response to volume and
angiotensin II. Am. J. Physiol. 1993; 264: F158-F165.
9. Bratton A.C., Marshall E.K.: A new coupling component for
sulfanilamide determination. J. Biol. Chem. 1939; 28, 537-540.
10.Burnstock G.: Purine – mediated signaling in pain and visceral
perception. Trends in Pharmacological Sci. 2001; 4: 182-188.
11.Burnstock G.: The purinergic nerve hypothesis. Ciba Found Symp.
1977; 48: 295-314.
12.Carey R.M.: Renal Dopamine System. Paracrine Regulator of
Sodium Homeostasis and Blood Pressure. Hypertension. 2001; 38:
297-302.
13.Churchill P.C., Bidani A.K.: Renal effect of selective adenosine
receptor agonists. Am. J. Physiol., 1987; 252: F299-303.
14.Cogan M.G.: Angiotensin II; a powerful controller of sodium
transport in the early proximal tubule. Hypertension. 1990: 15:
451-458.
15.Cook C.B., Churchill P.C.: Effects of renal denervation on the
renal responses of anesthetized rats to cyclohexyadenosine. Can. J.
Physiol. Pharmacol. 1984; 62: 934-938.
16.Czekalski S., Chansel D., Vandermeersch S., Ronoco P., Ardaillou
R.: Evidence for angiotensin IV receptors in human collecting duct
cells. Kidney Int.1996; 50(4): 1125-1131.
17.DiBona G.F., Kopp U.C.: Neural control of renal function. Physiol.
Rev. 1997; 77: 75-197.
18.Dillingham M.A., Anderson R.J.: Purinergic regulation of basal
and arginine vasopressin –stimulated hydraulic conductivity in
rabit cortical collecting tubule. J.Membr. Biol. 1985; 88:277-281.
73
19.Dunn M.J: Renal prostaglandins In: Renal Endocrinology.
Baltimore, Maryland. Wiliams and Wilkins (eds). 1989; 1-74.
20.Edwards R.M.: Basolateral, but not apical, ATP inhibits
vasopressin action in rat inner medullary collecting duct. Eur. J.
Pharmacol. 2002; 438: 179-181.
21.Ernsberger P., Zhou J., Damon T.H., Douglas J.G.: Angiotensin II
receptors subtypes in cultured rat renal mesangial cells. Am. J.
Physiol. 1992; 263: F411-F416.
22.Flodgaard H., Klenow H.: Abundant amounts of diadenosine
5’5’’’ – P1, P4-tetraphosphate are present and releasable, but
metabolically inactive in human platelets. Biochem. J. 1982; 208:
737-742.
23.Fredholm B.B., Abbracchio M.P., Burnstock G., Dubyak G.R.,
Harden T.K., Jacobson K.A, Schwabe U., Williams M.: Towards a
revised nomenclature for P1 and P2 receptors. Trends Pharmacol
Sci. 1997; 18(3): 79-82.
24.Fujiwara Y., Kitamura E., Ochi S., Shin S.H., Fukunaga M.,
Yokoyama K., Fukuhara Y., Ueda N., Kamada T., Orita Y.:
Isotopic measurement of glomerular intracapillary volume as a
quantitative index for mesangial cell contractility. Contrib.
Nephrol. 1991; 95: 12-21.
25.Gomori G.: Standard methods of clinical chemistry. 84; Academic
Press; New York, 1953.
26.Gosink E.C., Forsberg E. Effects of ATP and bradykinin on
endothelial cell Ca2+ homeostasis and formation of cGMP and
prostacyclin. Am. J. Physiol. 1993; 265: C1620-C1629.
27.Haberle D.A., Baeyer H,: Characteristic of glomerulotubular
balance. Am. J. Physiol. 1983; 244: F355-F366.
74
28.Hill R.J., Oleynek J.J., Hoth C.F., Kiron M.A., Wemg W., Wester
R.T., Tracey W.R., Knight D.R., Buchholz R.A., Kennedy S.P.:
Cloning, expression and pharmacological characterization of rabbit
adenosine A1 and A3 receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;
280: 122-128.
29.Ibarra F., Aperia A., Svensson L.B., Eklöf A.Ch.: Bidirectional
regulation of Na+,K+-ATPase activity by dopamine and an Įadrenergic agonists. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90: 21-24.
30.Jackson E.,K., Raghvendra D.,K.: The extracellular Cyclic AMP –
Adenosine Pathway in Renal Physiology. Annv. Rev. Physiol.
2004; 66: 571-599.
31.Jankowski M., SzczepaĔska-Konkel M., Kalinowski L., Angielski
S.: The role of P2Y-receptors in the regulation of glomerular
volume. Med. Sci. Monit., 2001; 7, 635-640.
32.Jankowski M., SzczepaĔska-Konkel M., Kalinowski L., Angielski
S.: Bidirection action of extracellular ATP on intracapillary
volume of isolated rat renal glomeruli. J. Physiol. Pharmacol.
2000; 51 (3): 491-496.
33.Johns E.J.: The autonomic nervous system and pressure-natriuresis
in cardiovascular-renal interaction in response to salt. Clin. Auton.
Res. 2002; 12: 256-263.
34.Klotz K.,N.: Adenosine receptors and their ligands. Naunyn
Schmiedebergs. Arch Pharmacol. 2000; 362 (4-5): 382-391.
35.Krayacich J., Kline R.L., Mercer P.F.: Supersensitivity to NE alters
renal function of chronically denervated rat kidneys. Am. Physiol.
Sci. 1987; F856-F864.
36.Kriz W., Elger M., Lemley K., Sakai T.: Structure of the
glomerular mesangium: A biomechanical interpretation. Kidney
Int. 38, 1990; Suppl. 30: S2-S9.
75
37.Kriz W., Elger M., Mundel P., Lemley K.V. Structure-satilizing
forces in the glomerular tuft. J. Am. Soc. Nephrol. 1995; 5: 17311739.
38.Langner G.: Wpáyw diadenozynotetrafosforanu na funkcjĊ nerek.
Praca doktorska. Akademia Medyczna w GdaĔsku. 2002.
39.Leder E.D., McLeish K.R. P2 purinoreceptor stimulation attenuates
PTH inhibition of phosphate uptake by a G protein – dependent
mechanism. Am. J. Physiol. 1995; 269: F309-F316.
40.Lehrmann H., Thomas J., Kim S.J., Jacobi C., Leipziger J.:
Luminal P2Y2 receptor-mediated inhibitions of Na+ absorption in
isolated perfused mouse CCD. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13: 1018.
41.Lopez-Novoa J.M., de ArribaG., Barrio V., Rodriguez-Puyol.
Adenosine induces a calcium-dependent glomerular contraction.
Europ. J. Pharmacol. 1987; 134: 356-357.
42.Mann K.J., RybczyĔska A., Berndt T.J., Hoppe A., Tyce G.M.,
Knox F.,G.: Renal Denervation Enhances the Phosphaturic Effect
of Parathyroid Hormone. Miner Electrolyte Metab. 1991; 17: 1620.
43.McCoy D.E., Taylor A.L., Kudlow B.A., Karlson K., Slattery M.J.,
Schwiebert L.M., Schwiebert E.M., Stanton B.: Nucleotides
regulate NaCl transport in mIMCD-K2 cells via P2X and P2Y
purinergic receptors. Am. Physiol. Sci. 1999; F552-F559.
44.Miras –Portugal M.T., Gualix J., Pintor J.: The neurotransmitter
role of diadenosine polyphosphates. FEBS. 1998; 430: 78-82.
45.Misra R.P.: Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by
graded sieving. Am. J. Clin. Phatol. 1972; 58: 135-139.
76
46.Mitchell K.D., Navar G.: Modulation of tubuloglomerular
feedback responsivness by extracellular ATP. Am. J. Physiol.
1993; 264: F458-466.
47.Miyamoto M., Yagil Y., Larson T., Robertson C., Jamison R.L.:
Effect of intrarenal adenosine on renal function and medulary
blood flow in the rat. Am. J. Physiol.1988; 255: 1230-1234.
48.Mundel P., Kriz W.: Structure and function of podocytes: An
update. Anat. Embryol., 1995; 192: 385-397.
49.North R.,A. Molecular Physiology of P2X receptors. Physiol. Rev.
2002; 82: 1013-1067.
50.Olivera A., Lamas S., Rodriguez-puyol D., Lopez-Novoa J.:
Adenosine induces mesangial cell contraction by an A1-type
receptor. Kidney Int. 1989; 35: 1300-1305.
51.Osswald H., Hermes H., N., Nabakowski G.: Role of adenosine in
signal transmission of tubuloglomerular feedback. Kidney In.,
1982; 22(12): 136-142.
52.Osswald H., Nabakowski G., Hermes H.H.: Adenosine as a
possible mediator of metabolic control of glomerular filtration rate.
Int. J. Biochem., 1980; 12: 262-267.
53.Osswald H.: Renal effects of adenosine and their inhibition by
theophylline in dog. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol.
Sci. 1975; 288: 79-86.
54.Panzacchi G., Demarchi B., Busca G., Protasoni G., Golin R.,
Stella A.: Effects of adenosine receptor agonists on renal function
in anaesthetized rats. Hypertension. 1997; 15: 1785-1789.
55.Pettinger W.A., Mitchel H.C.: Clinical pharmacology angiotensin
antagonists. Fed. Proc. 1976; 35: (12), 2531-5.
77
56.Pfister M.F., Forgo J., Zeigler U., Biber J., Murer H.: cAMPdependent and –independent downregulation of type II Na-Pi
cotransporters by PTH. Am. J. Physiol. 1999; 276: F720-F725.
57.Pintor J., Diaz-Rey M.A., Tores M., Miras-Portugal M.T: Presence
of diadenosine polyphosphates – Ap4A and Ap5A – in rat brain
synaptic terminals. Ca2+ dependent relese evoked by 4aminopyridine and veratridine. Neuroscience Letter. 1992; 136:
141-144.
58.Pintor J., Puche J.A., Gualix J., Hoyle C.H.V., Miras-Portugal
M.T.: Diadenosine polyphosphates evoke Ca2+ transients in guineapig brain via receptors distinct from those for ATP. Journal of
Physiology. 1997; 504(2): 327-335.
59.Protasoni G., Castoldi G., Busca G., Panzacchi G., Genovesi S.,
Golin R., Stella A.: Effects of adenosine-receptor agonists on
rennin release in anaesthetized rats. Hypertension. 1995; 13: 17531757.
60.Schaltter E., Ankorina I., Xaxelmans S., Kleta R.: Effects of
diadenosine polyphosphates, ATP and angiotensin II on cytosolic
Ca2+ activity and contraction of rat mesangial cells. Pfugers Archiv.
1995; 430: 721-728.
61.Schnermann J., Weihprecht H., Briggs J.P.: Inhibition of
tubuloglomerular feedback during adenosine receptor blocade. Am.
J. Physiol. 1990; 258: F553-F561.
62.Schulze-Lohoff E., Zanner S., Ogilvie A., Sterzel R.B.:
Extracellular ATP stimulates proliferation of cultured mesangial
cells via P2-purinergic receptors. Am. J. Physiol. Renal Physiol.
1992; 263: F374-383.
78
63.Schwiebert E.M., Kishore B.: Extracellular nucleotide signaling
along the renal epithelium. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2001;
280: F945-963.
64.Simons M.S., Rooney A.: Characterization of endothelin receptors
in mesangial cells: evidence for two functionally distinct
endothelin binding sites. Mol. Pharmacol. 1994; 46: 41-50.
65.Singhal P.C., DeCandido S., Satriano J.A., Schlondorff D., Hays
R.M.: Atrial natriuretic peptide and nitroprusside cause relaxation
of cultured rat mesangial cells. Am. J. Physiol. 1989; 257: C86C93.
66.Soares T.J., Coimbra T.M., Maryinis A.R., Pereira A.G., Carnio
E.C., Branco L.G.S., Albuquerque-Araaujo W.I.C., de Nucci G.,
Favaretto A.L.V., Gutkowska J., McCann, Antunes-Rodrigues J.
Atrial natriuretic peptide and oxitocin induce natriuresis by release
of cGMP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 278-283.
67.Steinmetz M., Van Lee T., Hollah P., Gabriels G., Hohage H.,
Heinz Rahn K., Schalatter E.: Influence of purinoreceptor
antagonism on diadenosine pentaphosphate-induced hypotension in
anesthetized rats. J. of Pharmacol. And Experiment Therap. 2000;
294: 963-968.
68.Suga S., Nakao K., Mukoyama M., Arai H., Hosoda K., Ogawa Y.,
Amura H.: Characterization of natriuretic peptide receptors in
cultured cells. Hypertension. 1992; 19: 762-765.
69.SzczepaĔska-Konkel M., Jankowski M., Stiepanow-Trzeciak A.,
Angielski S.: Effects of diadenosine polyphosphates on glomerular
volume. Br. J. Pharmacol. 2005; 144: 1109-1117.
79
70.SzczepaĔska-Konkel M., Langner G., Bednarczuk G., StiepanowTrzeciak A., Jankowski M., Angielski S.: Renal hemodynamics
and natriuretic responses to intravenous administration of
diadenosine tetraphosphate (Ap4A) and nicotinamide adenine
dinucleotide (NAD) in rat. J.Physiol. Pharmacol. 2003; 54(2): 163173.
71.SzczepaĔska-Konkel M., Redlak M., Angielski S.: Glibenclamidsensitive K+ channels are responsible for angiotensin II
hypertensitive contraction and atrial natriuretic factor refractoriness
of glomeruli in low-sodium rat. Biochem. Biophys. Res. Commun.
1991; 181: 871-876.
72.SzczepaĔska-Konkel M., Redlak M., Kuchta G., Angielski S.: The
role of intrarenal adenosine in glomerular action of atria natriuretic
factor. Cellular and Molecular Biology of the Kidney. Contrib.
Nephrol. Koide H., Endou H., Kurokawa K. (eds), 1991; 99: 90101.
73.SzczepaĔska-Konkel M.: Rola adenozyny w regulacji funkcji
nerek. Rozprawa habilitacyjna. Akademia Medyczna w GdaĔsku,
1996.
74.Thomsen K., Leyssac P.P.: Acute effects of various diuretics on
lithium clearance. Studies in rats on medium and low sodium diet.
Renal Physiol., 1986; 9: 1-8.
75.Thomsen K.: Lithium clearance: a new method for determining
proximal and distal reabsorption of sodium and water. Nephron.
1974; 37: 217-223.
76.Unwin R.J., Bailey M.A., Burnstock G.: Purinergic signaling
Along the Renal Tubule: The Current State of Play. News Physiol.
Sci. 2003; 18: 237-241.
80
77.Yagil Y., Schabel T., Jamison R.L.: The effects of adenosine on
renal excretory function. Kidney Int. 1990; 37:381.
78.Zhao J., Ardaillou N., Lu C.Y., Placier S., Pham P., Badre L.,
Cambar J., Ardaillou R.: Characterization of C-type natriuretic
peptide receptors in human mesangial cells. Kidney Int. 1994; 46:
717-725.
81