Techniki molekularne do identyfikacji pasożytów u ludzi

Techniki molekularne do identyfikacji
pasożytów u ludzi
Danuta Grygierczyk
W laboratoryjnej diagnostyce parazytologicznej stosuje się rutynowo badania:
• Mikroskopowe
• Immunologiczne
• Biochemiczne
• Hodowle in vitro/ in vivo
• PCR- badania molekularne ( wybrane laboratoria) – przydatność w
wykrywaniu pasożytów oprócz materiału klinicznego, w próbach
środowiskowych
Zastosowanie PCR i innych technik molekularnych ma znaczenie:
• przy niskiej intensywności zarażenia
• gdy pasożyty są trudne lub niemożliwe do hodowli
• są trudności w różnicowaniu gatunków morfologicznie podobnych
• jeśli badania immunologiczne są niewystarczające
Molekularna diagnostyka pierwotniaków
• Toxoplasma gondii
Główną rolę w diagnostyce laboratoryjnej odgrywają badania serologiczne.
Przy rozpoznawaniu toksoplazmozy mózgowej i ocznej a także
we wczesnym rozpoznawaniu zarażeń wrodzonych – hodowla pasożytów z
płynów ustrojowych poprzez dootrzewnową inokulację myszy ( kilka tygodni)
PCR w toksoplazmozie wykorzystywane do poszukiwania sekwencji genów: B1,
P30 i 18S rDNA pasożyta
Wykrywany materiał genetyczny to zawartość pojedynczych tachyzoitów
• W inwazji prenatalnej diagnozowanie toksoplazmozy płynu owodniowego
techniką PCR uzależnione jest od okresu,
• w którym doszło do zarażenia.
• Czułość PCR 92,9% - przy inwazji w II trymestrze ciąży
• Najwyższe prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie ujemnychzarażenie przed 17 i po 21 tygodniu ciąży.
• Ujemny wynik badania płynu owodniowego metodą PCR nie może wykluczyć
inwazji wrodzonej u płodu.
• Otrzymanie pozytywnego wyniku amplifikacji nie jest możliwe we
wszystkich przypadkach toksoplazmowego zapalenia mózgu.
• Brak DNA pasożyta w płynie mózgowo- rdzeniowym przy aktywnym
procesie inwazji wynika z parenchymalnego umiejscowienia zmian z dala
od opon mózgowych i komór mózgu.
• Toksoplazmoza oczna- amplifikacja genów: B1, P30 i 18S rDNA pasożyta
w płynie z przedniej komory oka i z wycinków siatkówki i naczyniówki.
Wartość diagnostyczna tego badania jest jednak ograniczona ( mała objętość
próbki, brak DNA T. gondii w płynie gdy inwazja obejmuje regiony odległe
od komory przedniej gałki ocznej)
• Antygeny rekombinowane – pozwolą na określenie stadium choroby
Otrzymano antygeny/ markery toksoplazmozy: mikronem (MIC), roptrii (ROP),
granul (GRA), powierzchniowe (SAG), cytoplazmatyczny (BAG1)
(bradyzoitów)
Genotypowanie T. gondii – znana sekwencja genów – B1,P30, P23, P22, H4,
H11
Polimorficzny gen SAG2 wskazuje na istnienie III odmiennych szczepów T.
gondii; II najczęściej wywołuje toksoplazmozę wrodzoną bezobjawową
przewlekłą. Może prowadzić także do poronień, powikłań ze strony OUN i
narządu wzroku u płodu. I typ występuje rzadko u człowieka wywołując
wrodzoną toksoplazmozę o ciężkim przebiegu. Typ III typowy u zwierząt.
Cryptosporidium spp.
• W stosunku do tego gatunku metody PCR stały się referencyjne w diagnostyce
parazytologicznej ( czułość i swoistość). W odróżnieniu od konwencjonalnych metod
pozwalają na wyróżnienie gatunków i/lub genogatunków Cryptosporidium inwazyjnych i
patogennych dla człowieka oraz mają zastosowanie do badania prób środowiskowych
( kał, żywność, woda, gleba).
Wykonujemy: PCR podstawowy, PCR-RFLP, FISH
PCR-fingerprinting i PCR- sekwencjonowanie.
Tradycyjne metody mikroskopowe i immunologiczne nie pozwalają na wyróżnienie szczepów.
Na podstawie genotypowania różnych gatunków Cryptosporidium zostały wyodrębnione
nowe : C. felis, C. wrairi; izolat C. parvum od psów, świń, myszy domowej, torbaczy , małp.
W populacji ludzkiej 2 szczepy C.parvum - H( genotyp1)i C( genotyp 2).
• Badania polimorfizmu w obrębie C. parvum pozwoliły na określenie
pokrewieństwa pomiędzy gatunkami i szczepami pasożyta.
• Najbardziej filogenetycznie spokrewnione są szczepy H i C, izolat od małp i od
myszy domowej; oddzielne gałęzie to izolaty od psów, świń torbaczy i C. felis.
Najbardziej odległe filogenetycznie od specyficznie ludzkiego szczepu H są
gatunki: C. muris, C. andersoni, C. serpentis i C. nasorum.
Szczep H (genotyp1)- odpowiedzialny za epidemie miejskie, z dobrym układem
odpornościowym
Szczep C – wspólny dla ludzi i zwierząt ( epidemie wodnopochodne na terenach
rolniczych) oraz połowę zarażeń u nosicieli wirusa HIV
• Entamoeba histolytica i E. dispar
E. histolytica s.s.– patogeniczny, w obrębie tego gatunku są szczepy patogeniczne i
niepatogeniczne (badania izoenzymatyczne i genetyczne)
Diamond i Clark dokonali w 1993r redeskrypcji gatunku E. histolytica , przywracając
nazwę E. dispar – niepatogeniczny
Badania obu gatunków metodami izoenzymatycznymi, wykrywającymi swoiste
antygeny i PCR( z cyst w kale i treści ropnia wątroby).
• Plasmodium spp.
Rutynowo cienki rozmaz krwi
– 500-1000pasozytów/ μl krwi
Gruba kropla – 10-20pasożytów/μl krwi
Trudności są przy niskiej parazytemii, mieszanej, po przyjęciu nieskutecznej
dawki leku
PCR- pełna krew na EDTA, startery komplementarne do genów r RNA małej
podjednostki rybosomu, białko powierzchniowe ”circumsporozoite” czy BRK1
PCR standardowy, nested PCR
Molekularna diagnostyka robaków
• Trichinella spp.
W rutynowej diagnostyce stosowane są nadal mikroskopowe wykrywanie larw
w bioptatach oraz metody serologiczne, (test ELISA).
PCR: RAPD-PCR, multiplex PCR, RFLP-PCR
Identyfikacja 7 gatunków przy zastosowaniu 11 enzymów restrykcyjnych- 3
różne produkty PCR: 2800pz( b. sekrecyjne), 1250pz (startery SB147A),
372pz (startery SB372A)
Potwierdzono występowanie w obrębie rodzaju Trichinella 2 nowych
gatunków: T. murrelli oraz T. papue
• Echinococcus multilocularis
Głównie badania immunologiczne, skreeningowe (odczyn hemaglutynacji
pośredniej, ELISA)
potwierdzenie -ELISA z antygenem EM2+, immunoblotting z antygenem EM18 i
EM 16, badania histopatologiczne materiału z zabiegu lub biopsja cienkoigłowa.
PCR – mitochondrialny 12S rRNA, sekwencjonowanie produktów PCR
Genetyczne zróżnicowanie pasożytniczych pierwotniaków
Giardia
Obecnie istnieje 5 odmiennych gatunków (grup) w rodzaju Giardia:
G. agilis, G. muris i G. intestinalis (G. duodenalis),G. psittaci,
G. ardeae.
Genetyczna analiza 200 aksenicznych izolatów Giardia ujawniła, że należą do 2
dużych grup- „ polskie” (A)(1i 2) i „ belgijskie” (B)(3 i 4).
W obrębie 1 – izolaty od ludzi i zwierząt, 2- tylko od ludzi, 3 i 4 –bardziej
zróżnicowane.
Dodatkowe grupy C i D ( od psów)
Różnią się kariotypami, sekwencją nukleotydów małej podjednostki rRNA i
obrazem długości fragmentów restrykcyjnych rDNA.
Zastosowanie technik molekularnych umożliwia identyfikacje gatunków Giardia w
próbach środowiskowych. Samo wykrycie cyst w wodzie nie pozwala oszacować
ryzyka zarażenia ludzi.
Izolaty B odpowiedzialne są za łagodny lub bezobjawowy przebieg choroby.
• Cryptosporidium
Obecnie wyróżnia się 8 gatunków,
obserwuje się różnorodność objawów klinicznych kryptosporydiozy oraz zmienną
inwazyjność i wirulencję populacji tego pasożyta.
Wynik RAPD PCR wykazał istnienie 4 genetycznie odmiennych grup wśród
kilkudziesięciu izolatów Cryptosporidium uzyskanych od ssaków i węży (C.
serpentis). Od ludzi są mało zróżnicowane ale różnią się swoją potencją
zoonotyczną.
Molekularna analiza genetycznych różnic w locus genu białka TRAP-C2 od ludzi z
różnych regionów geograficznych wykazała istnienie 2 genotypów( od ludzi i
zwierząt).
Analiza filogenetyczna opiera się na sekwencji 18rDNA i genu syntetazy acetylokoenzymu A.
• Leishmania spp.
Wyróżnia się kilkanaście gatunków Leishmania inwazyjnych dla człowieka.
Do celów taksonomicznych przydatna jest metoda fingerprintów DNA.
Do różnicowania izolatów L. donovani wykorzystuje się 2 sondy molekularne
odpowiadające sekwencjom genów białka szoku termicznego (hsp70)
• Trypanosoma
Populacja T.cruzi wykazuje dużą heterogeniczność podobną do Giardia.
Wykazano korelacje miedzy filogenetyczną różnorodnością i biomedycznymi
właściwościami, T.cruzi jest przykładem klonalnej ewolucji co wykazała
analiza różnych markerów molekularnych- wyróżniono 2 filogenetyczne linie
rozwojowe.
Rozróżniono podgatunki w obrębie T. brucei dzięki zastosowaniu RFLP PCR,
hybrydyzacji z sondami DNA, analizie izoenzymów oraz oceny wrażliwości
metacyklicznych trypomastigota na lityczne działanie ludzkiej surowicy
odpornościowej.
Izolaty T.b.gambiense, T.b.rhodesiense różnią się od T.b. brucei
• Toxoplasma gondii
Genetyczny polimorfizm T. gondii warunkuje niezwykłą zdolność adaptacyjną
do licznych gatunków żywicieli pośrednich.
Do oceny stopnia heterogeniczności genomu zastosowano: RFLP (starter dla
genu P30), RAPD i sekwencjonowanie.
Wykazano zmienność wewnątrzgatunkową i wewnątrzszczepową tego
pasożyta.
3 linie klonalne wyróżniono; genotyp 2 związany z ciężkim przebiegiem
toksoplazmozy u ludzi.
Lekooporność pasożytów
Lekooporność wynika z:
• Długotrwałego i powszechnego stosowania tego samego leku
• Przerwania terapii (uboczne działanie leków)
• Nie przestrzegania przyjmowania odpowiednich dawek leku
Niepodatność na leczenie może być wynikiem genetycznych,
immunologicznych lub fizjologicznych czynników zarażonego żywiciela
• Lekooporność jest genetycznie przekazywaną utratą wrażliwości populacji
pasożyta na lek, który wcześniej był skuteczny.
• Tolerancja lub naturalna oporność to niepodatność populacji, która
wcześniej nie była wystawiona na działanie danego leku.
W obu przypadkach dotyczy to pojedynczej lub licznych mutacji
różnicujących populacje pod względem wrażliwości na działanie leku.
W lekooporności mutacja jest indukowana selekcyjnym działaniem leku
(lek mutagenem).
Tolerancja ujawnia się w rozprzestrzenieniu różnych populacji, poddanych
naturalnej selekcji.
• Oporność na leki wynikać może z nabycia nowej aktywności przez
pasożyty( degradowanie lub inaktywowanie leku) bądź z utraty wcześniej
istniejącej aktywności.
• Stwierdza się heterogeniczność różnych gatunków pasożytów pod
względem wrażliwości na działanie leków.
• U różnych pasożytów istnieją odmienne molekularne mechanizmy
lekooporności
• Schistosoma mansoni
Stwierdzono zmienność międzypopulacyjną
S. mansoni we wrażliwości na hykanton i oksamnikwin(afrykańskie są bardziej
oporne niż południowoamerykańskie) (genetycznie przekazywana cechaautosomalnie, recesywnie; utrata pojedynczej aktywności przywr- pojedyncza
mutacja punktowa).
Aktywacja leku polega na enzymatycznej estryfikacji, spontanicznej dysocjacji
powstałego estru. Utworzone aktywne reszty są zdolne do alkilacji DNA lub
innych cząsteczek przywr.
Przywry z opornym fenotypem wykazują mniejszą żywotność.
O wysokiej skuteczności nadal jest lek prazykwantel.
• Leishmania
Amplifikacja niektórych genów i ich nadekspresja wiąże się z brakiem
wrażliwości na działanie leków pierwotniakobójczych.
Tlenki związków stosowane jako leki są induktorami amplifikacji danego genu u
Leishmania. Gatunki te często amplifikują swoistą część genomu po
selekcyjnym działaniu leku. Genomowy region zawierający locus H jest
amplifikowany jako pozachromosomowy, kolisty DNA
2 klasy genów pgp (P- glikoproteina) oporne na leki hydrofilne (1) i
hydrofobowe (2)
Uzyskano szczep L. tropika z fenotypem MDR (multidrug resistant), u którego
stwierdzono nadekspresje genu ltpgpE
• Plasmodium spp.
Izolaty Plasmodium spp. uzyskane z przypadków klinicznych
jak i drogą selekcji w warunkach laboratoryjnych wykazują oporność na liczne
leki w szczególności na chlorochinę.
Lekooporność wynika ze zmniejszonej akumulacji leku w wodniczkach
pokarmowych pasożyta.
Przywrócenie wrażliwości na leki jest możliwe po podaniu inhibitorów kanału
wapniowego.
PCR i hybrydyzacja z sondami molekularnymi – geny pfmdr1 i pfmdr2;
amplifikacja i nadekspresja genu 1 występowała u P. falciparum opornych na
chininę, meflochinę i halofantrin przy braku amplifikacji genu 2
• Entamoeba histolytica
W genomie zidentyfikowano geny pgp (4g+2pg)
Wykazano oporność na emetynę, podanie inhibitorów kanału
wapniowego- przywrócenie wrażliwości na leki.
Trichomonas vaginalis
Oporność na metronidazol, wrażliwe na tinidazol.
Oporność jest związana ze spadkiem reduktazy flawiny i tioredoksyny
(zaburzenia przemiany tlenu) oraz dehydrogenazy alkoholowej1
(ADH1)