cwiczenie I praktyka

Bioaktywne składniki żywności funkcjonalnej
Ćwiczenie 1
część praktyczna
___________________________________________________________________________
WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYKO-CHEMICZNYCH ORAZ
WARUNKÓW PRZECHOWYWANIA NA WŁAŚCIWOŚCI
PRZECIWUTLENIAJĄCE WYBRANYCH PRODUKTÓW
ŻYWNOŚCIOWYCH
Cel ćwiczenia
1. Określenie wpływu warunków przechowywania, zamrażania, ogrzewania,
promieniowania mikrofalowego na zawartość polifenoli i aktywność antyoksydacyjną
wybranych owoców i warzyw.
2. Ocena aktywności antyoksydacyjnej przygotowanych produktów metodą ABTS i
DPPH.
3. Oznaczanie ogólnej zawartości polifenoli metodą kolorymetryczną z odczynnikiem
Folin-Ciocalteu.
Przygotowanie prób (dzień 1)
1. Pokroić wybrany surowiec (kapusta biała, kapusta czerwona, brokuły lub brukselka)
na drobne kawałki (< 0,5 cm) i dokładnie wymieszać w celu ujednolicenia próby.
2. Przygotować 2 plastikowe tacki, 4 pojemniczki plastikowe zakręcane (podpisać nr 25) i 3 zlewki (podpisać nr 6-8).
3. Przenieść do naczyniek rozdrobniony surowiec w ilości do 2/3 wysokości pojemnika
plastikowego. Opisać „surowiec” i „proces obróbki”.
4. Porcje surowca poddać działaniu odpowiednich czynników zgodnie z tabelą poniżej.
Próbka
1
2
3
4
5
6
7
8
Czynnik
-80°C (kontrola)
Zamrażarka -20°C
Lodówka +4°C
Temperatura pokojowa (pojemnik przykryć lekko
podziurkowaną folią spożywczą lub papierem)
Temperatura pokojowa (zamknąć w pojemniku
próżniowym)
Mikrofale o max mocy (kuchenka ROMIX,
gotować mikrofalowo w wodzie)
Mikrofale o min mocy (kuchenka ROMIX,
gotować mikrofalowo w wodzie)
Gotowanie w wodzie (nad palnikiem gazowym,
mieszając)
Czas działania
2 doby (na tacce!)
2 doby
2 doby
2 doby
2 doby
5 min
15 min
20 min
5. W przypadku próbek nr 6-8 po gotowaniu należy osączyć warzywa z wody.
Monitorować gotowanie, żeby warzywa nie „wykipiały”.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
Bioaktywne składniki żywności funkcjonalnej
Ćwiczenie 1
część praktyczna
___________________________________________________________________________
6. Przygotować na 2 tackach przegrodę z folii aluminiowej, dzielącą tacę na pół. Na
każdą połowę (opisaną z boku lub od spodu) przełożyć całą odsączoną zawartość ze
zlewek nr 6-8. Materiał rozłożyć na dnie równomierną warstwą za pomocą łyżeczki
lub bagietki, nie ubijać, przykryć folią aluminiową i zamrozić w temp. -80°C. Na
pustą połówkę tacki nałożyć kontrolę (próbka nr 1).
7. Zliofilizować zawartość wszystkich pojemniczków (wykonuje prowadzący).
Przygotowanie ekstraktów (dzień 2)
1. Zliofilizowane warzywa rozetrzeć w moździerzu.
2. Do suchej i czystej kolby stożkowej (100 ml) ze szlifem odważyć po dokładnie 0,250
g rozdrobnionego liofilizatu i natychmiast zalać 50 ml 80% metanolu.
3. Do kolby włożyć mieszadełko, zatkać korkiem i pozostawić na 2 h na mieszadle
magnetycznym (500 rpm).
4. Przesączyć całość przez sączek do czystej kolbki miarowej na 50 ml, dopełnić do
kreski metanolem (po doprowadzeniu do temp. pokojowej), przelać do probówki
wirowniczej i zwirować (3000 obr/min, 5 minut, 20°C).
5. Nadsącz zebrać do czystej, zakręcanej probówki na 50 ml. Podpisać.
6. Do czasu analizy przechowywać w zamrażarce.
Analiza aktywności antyoksydacyjnej metodą z rodnikiem ABTS
(dzień 3)
Roztwór podstawowy ABTS*
(7 mM ABTS, 2.45 mM K2S2O8)
1. Przygotowanie 4,9 mM roztworu nadsiarczanu potasu K2S2O8:
 odważyć 0,132 g (dokładnie!) K2S2O8
 przenieść ilościowo do kolbki miarowej na 100 ml
 dopełnić do kreski wodą redestylowaną
 dokładnie wymieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (30 minut na mieszadle
magnetycznym)
 roztwór jest stabilny 1 dzień.
2. Przygotowanie PBS, pH 7,4:
 do czystej butelki 500 ml wsypać 2 tabletki PBS
 dopełnić do około 400 ml wodą redestylowaną,
 co jakiś czas mieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (około 2-3 godzin).
3. Przygotowanie ABTS*
 do zakręcanej probówki na 15 ml odmierzyć pipetą automatyczną 1,3 ml 4,9 mM
roztworu K2S2O8,
 dodać 1 tabletkę ABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) –
nie dotykać palcami!!!
 dodać 1,3 ml wody podwójnie destylowanej,
 zakręcić probówkę, dokładnie wymieszać,
 owinąć szczelnie folią aluminiową,
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
Bioaktywne składniki żywności funkcjonalnej
Ćwiczenie 1
część praktyczna
___________________________________________________________________________
 odstawić na 16 h w temperaturze pokojowej, w ciemnym miejscu.
Roztwór podstawowy ma mieć kolor ciemnozielony. Przechowywać w lodówce, nie
zamrażać!
Roztwór roboczy ABTS (ABTS0.7)
Rozcieńczyć za pomocą PBS roztwór ABTS* tak, by jego absorbancja przy 734 nm wynosiła
A = 0,7 ± 0,02 (najlepiej gdy A jest bliższe 0,72). Przygotować taką ilość roztworu ABTS0,7
by wystarczyła do analizy wszystkich próbek i wykonania krzywej standardowej (licząc po 1
ml na każdy punkt pomiarowy). Gotowy roztwór przechowywać w butelce z ciemnego szkła
ze szlifem.
Metoda ta pozwala na ilościową ocenę zmiatania wolnych rodników na podstawie
zdolności składnika do wygaszania stabilnego rodnika ABTS.
Kwas 2,2’-azyno-bis (3-etylenobenzotiazolinowy) (rys. 1.) jest syntetycznym
kationorodnikiem, rozpuszczalnym w wodnych i organicznych roztworach, pozwalającym na
pomiar przeciwutleniaczy zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych. Jest on wrażliwy na
światło i musi być przetrzymywany w ciemności.
W przeciwieństwie do DPPH rodnik ten nie jest dostępny w formie aktywnej.
W handlu występuje pod postacią nieaktywnej soli dwuamonowej i generuje się go albo
poprzez reakcję chemiczną (np. z dwutlenkiem manganu, nadsiarczanem potasu, ABAP) lub
enzymatyczną (z peroksydazą, mioglobiną, hemoglobiną).
SO3H
Et
S
N
N
N
N
S
HO 3S
Et
Rys. 1. Budowa chemiczna rodnika ABTS
Krzywa standardowa Troloxu dla ABTS
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mM roztworu Troloxu
w PBS zgodnie z poniższą tabelą
Stężenie końcowe
Objętość
standardu
PBS
[mg/100 ml]
[μl]
1
0
200
2
1,25
190
3
2,5
180
4
5
160
5
7,5
140
6
10
120
2. Do 7 kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS0.7
Lp
Objętość
1mM Troloxu
[μl]
0
10
20
40
60
80
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
Bioaktywne składniki żywności funkcjonalnej
Ćwiczenie 1
część praktyczna
___________________________________________________________________________
3. Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6, wpisać
kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 734 nm; zero, nonintercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: 3
4. Ustawić blank w aparacie: PBS
5. Dodać do pierwszej kuwety 100 l roztworu Troloxu z probówki nr 1
i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość
kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza!)
6. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 100 l roztworu z probówki nr 2 itd.
7. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 6 minut odczytać absorbancję pierwszej
kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu – żeby spektrofotometr przeczytał
absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią).
8. Po 30 sekundach (na stoperze 6:30) odczytać w analogiczny sposób absorbancję
roztworu w następnej kuwecie itd.
9. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową.
Pomiar próbek metodą ABTS
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-, pięcio- i
dziesięciokrotne) przygotowanych na poprzednich zajęciach ekstraktów w buforze
PBS.
2. Do kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS0.7.
3. Ustawić blank w aparacie: PBS.
4. Dodać do pierwszej kuwety 100 l pierwszego badanego ekstraktu
i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość
kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza).
5. Zmierzyć absorbancję próbek (w 6. minucie), na podstawie krzywej wyliczyć
aktywność przeciwutleniającą badanych ekstraktów (w mg Troloxu/100 ml ekstraktu).
Uzyskane wyniki przeliczyć na mg Troloxu/g s.s., wyciągnąć wnioski i zamieścić je w
sprawozdaniu.
Analiza aktywności antyoksydacyjnej metodą z rodnikiem DPPH
Przygotowanie roztworu
1. Odważyć 0,012 g DPPH w naczyńku wagowym, przenieść ilościowo do kolby
miarowej na 100 ml – uwaga: DPPH słabo się rozpuszcza, kryształki mogą zatykać
końcówkę pipety i powodować jej zalanie!
2. Dopełnić do kreski czystym etanolem (do 100 ml)
3. Odstawić na mieszadło magnetyczne na co najmniej 1 godzinę
4. Po całkowitym rozpuszczeniu DPPH przenieść roztwór do butelki z ciemnego szkła.
Roztwór ma kolor ciemno fioletowy!
W oznaczeniu metodą DPPH przeciwutleniacze obecne w badanej próbce redukują
stabilny rodnik azotowy 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH) powodując spadek
absorbancji mierzonej przy długości fali 517 nm (rys.2.). Roztwór aktywnego rodnika ma
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
Bioaktywne składniki żywności funkcjonalnej
Ćwiczenie 1
część praktyczna
___________________________________________________________________________
barwę purpurową, a jego odbarwienie świadczy o tym, że niesparowany dotąd elektron został
sparowany.
N
N
.
+
N
O 2N
RH
NO 2
+
NH
O 2N
O 2N
.
R
NO 2
NO 2
Rys. 2. Reakcja redukcji rodnika DPPH przez antyutleniacz
Krzywa standardowa Troloxu dla DPPH
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mM roztworu Troloxu
w etanolu zgodnie z poniższą tabelą:
Lp
1
2
3
4
5
6
Stężenie końcowe
standardu [mg/100ml]
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Objętość
EtOH [l]
1000
980
960
940
920
900
Objętość
1 mM Troloxu [µl]
0
20
40
60
80
100
2. Do 6 kuwet odmierzyć po 0,6 ml EtOH.
3. Do każdej z kuwet dodać po 0,2 ml przygotowanego roztworu DPPH nie dotykając
końcówką do etanolu, po nałożeniu do wszystkich kuwet przepipetować tą końcówką
zawartość wszystkich kuwet.
4. Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6, wpisać
kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 517 nm; zero, nonintercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: 3.
5. Ustawić w aparacie blank: EtOH.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
Bioaktywne składniki żywności funkcjonalnej
Ćwiczenie 1
część praktyczna
___________________________________________________________________________
6. Dodać do pierwszej kuwety 200 l roztworu Troloxu z probówki nr 1 i równocześnie
włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować) zawartość kuwety (uważać,
żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza).
7. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 200 l roztworu z probówki nr 2 itd.
8. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 10 minut odczytać absorbancję roztworu z
pierwszej kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu – żeby spektrofotometr
zmierzył absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią).
9. Po 30 sekundach (na stoperze 10:30) odczytać w analogiczny sposób A roztworu w
następnej kuwecie itd.
10. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową.
Pomiar próbek metodą DPPH
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-, pięcio- i
dziesięciokrotne) badanych ekstraktów w wodzie redestylowanej.
2. Przygotować mieszaninę 0,6 ml EtOH i 0,2 ml DPPH w kuwecie, dokładnie
przepipetować, żeby kolor był jednolity
UWAGA: Dla ułatwienia i przyspieszenia pracy można przygotować sobie
rozcieńczenie DPPH. W tym celu: odmierzyć w suchej, czystej kolbie miarowej
dokładnie 25 ml roztworu DPPH, przelać ilościowo do kolby miarowej na 100 ml
(wypłukiwać kolbę etanolem, aż etanol będzie całkiem bezbarwny), dopełnić kolbę do
kreski etanolem (czyli do 100 ml). Wymieszać, aż kolor roztworu będzie jednolity.
Przelać zawartość do 2 butelek z ciemnego szkła na 50 ml. Tak rozcieńczony roztwór
dodajemy do kuwet w ilości 0,8 ml!
3. Odczytać blank: EtOH
4. Dodać do pierwszej kuwety 0,2 ml rozcieńczonego pierwszego badanego ekstraktu
(ekstrakt nr 1) i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować)
zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały pęcherzyki powietrza!). Po 30
sekundach do drugiej kuwety dodać 0,2 ml kolejnego rozcieńczenia ekstraktu nr 1, po
kolejnych 30 sekundach, do następnej kuwety, dodać 0,2 ml następnego rozcieńczenia
itd.
5. Pomiar absorbancji roztworu w kuwecie wykonać dokładnie w 10 minut od dodania
ekstraktu do kuwety, na podstawie krzywej wyliczyć aktywność przeciwutleniającą
badanych ekstraktów (w mg Troloxu/ 100 ml ekstraktu). Przeliczyć na mg Troloxu/g
s.s. warzywa. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je w sprawozdaniu.
Oznaczenie zawartości polifenoli ogółem metodą Folin-Ciocalteu
Wykonanie krzywej wzorcowej
1. Z roztworu standardowego (+)katechiny o stężeniu 50 mg/100 cm3 (w 80% metanolu)
przygotować rozcieńczenia do krzywej wzorcowej.
2. W tym celu do kolby miarowej na 25 cm3 dodać: 0,5; 1,25; 2,5; 3,75; 5,0 cm3
standardowego roztworu katechiny i dopełnić metanolem do kreski.
3. Następnie z każdej kolby pobrać 2,5 cm3 do kolb miarowych na 25 cm3 i dopełnić
wodą redestylowaną.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
6
Bioaktywne składniki żywności funkcjonalnej
Ćwiczenie 1
część praktyczna
___________________________________________________________________________
4. Z tak przygotowanych roztworów do kolb stożkowych przenieść po 5 cm3 roztworu,
dodać 0,25 cm3 odczynnika Folina-Ciocalteu (rozcieńczonego wcześniej wodą
redestylowaną w stosunku 1:1 v/v) oraz 0,5 cm3 7% roztworu Na2CO3. Zamieszać i
pozostawić w ciemności na 30 min.
5. Po tym czasie zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760
nm (blank = metanol). Wykreślić krzywą wzorcową.
Badanie właściwe
1. Przygotować rozcieńczenia (w 80% metanolu) ekstraktów.
2. Z tak przygotowanych roztworów pobrać do kolb miarowych na 25 cm3 po 2,5 cm3 i
dopełnić wodą.
3. Pobrać 5 cm3 tak rozcieńczonego ekstraktu, dodać 0,25 cm3 odczynnika Folina–
Ciocalteu (1:1) oraz 0,5 cm3 7% Na2CO3. Wymieszać i pozostawić na 30 min w
ciemności.
4. Zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm (blank =
metanol).
5. Z krzywej wzorcowej odczytać zawartość polifenoli ogółem wyrażoną w mg
katechiny/100 ml ekstraktu.
6. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je wraz z wynikami w sprawozdaniu.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Apak R., Güclü K.G., Özyürek M., Karademir S.E.: Novel total antioxidant capacity index for dietary
polyphenols and vitamins C and E, using their cupric iron reducing capability in the presence of
neocuproine: CUPRAC method, J. Argic. Food Chem. 2004, 52, 7970-7981.
Arnao M.B.: Some methodological problems in the determination of antioxidant activity using
chromogen radicals: a practical case, Trends Food Sci. Technol. 2000, 11, 419-421.
Arts M.J.T.J., Haenen G.R.M.M., Voss H.P., Bast A.: Antioxidant capacity of reaction products limits
the applicability of the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay, Food Chem. Toxicol.
2004, 42, 45-49.
Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa, 1995.
Grajek W. (praca zbiorowa) Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne,
molekularne i analityczne. WNT, Warszawa, 2007.
Korotkova E.I., Karbainov A.Y., Shevchuk A.V.: Study of antioxidant properties by voltammetry, J.
Electroanal. Chem. 2002, 518, 56-60.
Miller N.J., Rice-Evans C.A., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A.: A novel method for measuring
the antioxidant capacity, 1993, 84, 407-412.
Miller N.J., Rice-Evans C.A.: Factors influencing the antioxidant activity determined by the ABTS +·
radical cation assay, Free Radical Res. 1997, 26, 195-199.
Prior R. L., Wu X., Schaich K.: Standarized methods for the determination of antioxidant capacity and
phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 4290-4302.
Re R., Pellegrini N., Porteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C.: Antioxidant activity
applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Res., 1999, 26 (9/10),
1231-1237.
Sanchez-Moreno C.: Review: Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods and
biological systems, Food Sci. Tech. Int. 2002, 8 (3), 121-137.
Schlesier K., Harwat M., Böhm V., Bitsch R.: Assessment of antioxidant activity by using different in
vitro methods. Free Radic. Res., 2002, 36 (20), 177-187
Swain T., Hillis W.E.: The phenolic constituents of Prunus domestica. I. The quantitative analysis of
phenolic constituents; J. Sci. Food. Agric. 1959, 10; 63 – 68.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
7