ĆWICZENIE 1 i 2: ANALIZA PRZECIWUTLENIACZY W

ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 1 i 2: ANALIZA
PRZECIWUTLENIACZY W PRODUKTACH
ŻYWNOŚCIOWYCH
Metody oznaczania przeciwutleniaczy
Znaczne zróżnicowanie w budowie, funkcji i pochodzeniu utleniaczy
i reaktywnych form tlenu, wymusiło powstanie licznych metod badawczych. Nie jest
bowiem możliwe analizowanie tym samym sposobem tak różnych związków jak
enzymy, duże białka, niskocząsteczkowe przeciwutleniacze czy hormony. Z drugiej
strony te rozmaite antyoksydanty mogą oddziaływać w odmienny sposób, w
zależności od rodnika czy utleniacza, środowiska reakcji i obecności lub braku innych
substancji. Przeciwutleniacz „wyspecjalizowany” w zmiataniu tlenu singletowego
może nie działać na rodniki peroksylowe i odwrotnie. Właśnie z powodu tak licznych
i różnorodnych mechanizmów, jak również zróżnicowania środowiska reakcji nie ma
możliwości, by jedna metoda mogła dokładnie opisywać wszystkie źródła rodników
i/lub przeciwutleniaczy.
Jak dotąd nie ma jednej, pełnej klasyfikacji stosowanych technik pomiarowych.
Większość badań opiera się na ocenie aktywności czy tzw. pojemności
antyoksydacyjnej, będącej sumą właściwości poszczególnych związków zawartych w
badanym materiale. Inne metody oceniają przeciwutleniacze ilościowo i jakościowo,
nie uwzględniając ich aktywności.
Wszystkie metody służące do oceny przeciwutleniaczy, zarówno ich ilości, jak
i aktywności, można podzielić na:
 chromatograficzne:
- na płaszczyznach - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa (TLC),
- na kolumnach - chromatografia cieczowa (HPLC) i gazowa (GC),
 spektrofotometryczne,
 kolorymetryczne,
 elektrochemiczne:
- woltamperometria cykliczna (CV),
- spektroelektrochemia,
 elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR).
Antyoksydanty mogą inaktywować wolne rodniki na dwa sposoby, przez
transfer atomu wodoru (HAT) lub pojedynczego elektronu (SET). W związku
z tym metody określające pojemność antyoksydacyjną można też podzielić na
odpowiednie dwie grupy:
1) metody oparte o mechanizm HAT (np. ORAC, TRAP) mierzą zdolność
przeciwutleniacza (AH) do wygaszania rodników poprzez oddanie wodoru:
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
(1)
AH  X  
 A  XH
Tego typu reakcje zachodzą szybko i zależą od pH, rozpuszczalnika oraz
obecności innych substancji redukujących, np. metali, które mogą zawyżać
wynik,
2) metody oparte o mechanizm SET (np. FRAP, CUPRAC) wykrywają zdolność
antyoksydanta do przeniesienia e  i zredukowania rodnika czy jonów metali:
(2)
X   AH 
 X   AH 
H 2O



(3)
AH 
 A  H 3O
X   H 3O  
 XH  H 2 O
MeIII   AH 
 AH   MeII 
(4)
(5)
Są to reakcje zachodzące powoli, zależne od pH i obecności jonów metali.
Istnieją jednak metody, których nie można jednoznacznie zakwalifikować do żadnej z
powyższych grup (TEAC, DPPH, metoda Folina-Ciocalteu).
Niezależnie od przyjętego podziału najczęściej wykorzystywane są metody
chromatograficzne i spektrofotometryczne. Szerokie zastosowanie w badaniach
glikozydów flawonoidowych znalazła chromatografia, która pozwala nie tylko na
stwierdzenie obecności związku w próbce, lecz także na wnioskowanie o jego ilości.
Zasadnicze znaczenie dla dobrego rozdziału ma dobór odpowiedniej fazy
ruchomej i adsorbenta. W skład fazy ruchomej wchodzą najczęściej następujące
rozpuszczalniki: woda, kwas octowy, n-butanol, octan etylu, kwas mrówkowy,
benzen, keton metyloetylowy, chloroform, aceton. Rozdzielanie substancji na
cienkich warstwach wykonuje się niekiedy wielokrotnie, rozwijając chromatogram w
tej samej lub różnych fazach ruchomych. W celu rozpoznania związków stosuje się
wzorzec o znanej wartości czasu retencji. Po dokonaniu rozdziału na cienkiej
warstwie,
można
zlokalizowaną
substancję
wyeluować
odpowiednim
rozpuszczalnikiem i oznaczyć ilościowo.
W wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) fazą ruchomą jest ciecz,
przepływająca pod wysokim ciśnieniem poprzez warstwę złoża w kolumnie.
Identyfikację i oznaczanie składników umożliwiają detektory reagujące na zmiany
zachodzące w składzie fazy ruchomej podczas wymywania z kolumny składników
mieszanin. Dobór rozpuszczalników zależy od właściwości badanego flawonoidu
i stosowanego układu detekcyjnego, niekiedy stosuje się fazę ruchomą, o składzie
zmieniającym się podczas procesu chromatograficznego (elucja gradientowa). Fazy
ruchome w chromatografii cieczowej, w odróżnieniu od gazowej, są ważnym
elementem zmiennym, dostarczającym wielu możliwości doboru najkorzystniejszych
warunków rozdziału. Chromatografia cieczowa znalazła zastosowanie w analizie
jakościowej i ilościowej flawonoidów.
W chromatografii gazowej (GC) fazą ruchomą jest gaz. Badania jakościowe
prowadzi się na podstawie porównania czasu retencji substancji badanej i
wzorcowej. Do oznaczania zawartości stosuje się najczęściej metodę wzorca
wewnętrznego, która eliminuje błędy przy wprowadzaniu próbki na kolumnę.
Metody spektrofotometryczne są przydatne do oznaczania czystych substancji,
natomiast metodami kolorymetrycznymi można oceniać zawartość lub aktywność
flawonoidów w ekstraktach po wstępnym oczyszczeniu. Do tej grupy należą m.in.
metody:
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________

Christa-Műllera, w której zawartość flawonoidów oznacza się poprzez pomiar
natężenia zabarwienia powstałego w wyniku reakcji flawonoidu z trójchlorkiem
antymonu, tlenochlorkiem cyrkonu, octanem uranylowym, azotanem berylu, kwasem
borowym lub chlorkiem glinowym,

Folina-Ciocalteu'a, gdzie flawonoidy tworzą barwny kompleks z odczynnikiem
Folina-Ciocalteu'a (mieszanina wolframianu sodowego, molibdenianu sodowego i
siarczanu litu w środowisku kwasu fosforowego i solnego) dając zielono-niebieską
barwę; po utlenieniu kompleks oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali
od 750 nm do 784 nm,

opierające się na reakcjach wygaszania syntetycznych wolnych rodników
(ABTS, DPPH, DMPD); barwny aktywny rodnik ulega redukcji przez antyoksydanty
obecne w badanej próbce, do bezbarwnych związków, co ilościowo mierzy się
spektrofotometrem przy długości fali 734, 515 i 505 nm odpowiednio dla w/w
rodników,

FRAP, polegająca na pomiarze zdolności do redukcji jonu żelazowego 2,4,6tripirydylo-s-triazyny (TPTZ); związek żelaza (III) w reakcji z antyoksydantem daje
barwny produktu, który oznacza się przy długości fali 593 nm,

TRAP, w której przeciwutleniacz redukuje rodnik ABAP,

CUPRAC, w której jony miedzi (II) ulegają pod wpływem antyoksydantów
redukcji do jonów miedzi (I); analizę spektrofotometryczną wykonuje się przy
długości fali 450 nm,

ORAC, oceniająca zdolność antyutleniacza do opóźniania fluorescencji
R-fikoerytryny, indukowanej przez AAPH, długość fali wzbudzającej to
540 nm, a emisji 570 nm.
Do
oceny
aktywności
przeciwutleniającej
służą
także
metody
elektrochemiczne. Wykorzystują one prąd jaki powstaje w czasie elektrochemicznej
reakcji tlenu na elektrodzie. Przeciwutleniacze, reagując z tlenem i jego pochodnymi,
zmniejszają natężenie tego prądu. Istnieje kilka wariantów elektrochemicznego
pomiaru aktywności antyoksydacyjnej. Najważniejsze z nich, cykliczna woltametria
(CV) i różnicowa woltametria pulsowa (DPV), pozwalają na pomiar siły działania
przeciwutleniaczy zawartych w badanych próbkach za pomocą specjalnej szklanej
elektrody węglowej. Zróżnicowanie pH pozwala na selektywną ocenę samych
flawonoidów (pH=7,5) lub flawonoidów i kwasów fenolowych (pH=2,0). Zaletą tych
metod jest to, że nie wymagają żadnych dodatkowych odczynników.
Szklana elektroda węglowa jest najlepszą do tych celów, gdyż antyoksydanty
fenolowe utleniają się na niej przy podobnych potencjałach jak na elektrodach
metalicznych, jednak bez zakłóceń interferencyjnych związanych z utlenianiem
etanolu.
Do technik oceniających zawartość związków przeciwutleniających należy
zaliczyć również wszystkie oznaczenia poszczególnych antyoksydantów, a więc
metody analizy witaminy C, tokoferoli, antocyjanin itd.
Wyżej wymienione metody służą do analizy ilościowej lub jakościowej
przeciwutleniaczy oraz oceny ich aktywności. Odmienne podejście do problemu
reprezentuje następna technika.
Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) pozwala
na wykrycie związków posiadających niesparowane elektrony (paramagnetyków),
czyli będących wolnymi rodnikami. Badanie polega na wprowadzeniu próbki w
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
zmienne pole magnetyczne, po czym niesparowane elektrony orientują się
równolegle lub antyrównolegle względem kierunku pola (rozszczepienie poziomów
energetycznych to tzw. efekt Zeemana) i następuje absorpcja doprowadzonego
promieniowania o częstości pasującej do różnicy energii tych orientacji. Warunki
pomiaru można zmienić poprzez zmianę indukcji pola magnetycznego, natomiast
jego częstotliwość pozostaje stała. Badania przeprowadza się zazwyczaj w temp.
ciekłego azotu 77oK, gdyż przedłuża to czas życia wolnych rodników. Pochłonięcie
energii może zostać zmienione, odpowiednio przekształcone przez układ odbiorczy
spektrometru elektronowego rezonansu paramagnetycznego i wyświetlone na
ekranie, bądź zapisane przez układ rejestrujący. Otrzymywane widma są
porównywane ze wzorcem zewnętrznym, którym najczęściej jest DPPH i
analizowane przez programy komputerowe.
Metoda EPR posiada szereg zalet wobec innych spektroskopii
promieniowania elektromagnetycznego:
 jest to metoda specyficzna dla wolnych rodników, inne substancje nie mają
żadnego udziału w rejestrowanym sygnale,
 energia stosowanych do napromieniania próbki mikrofal jest niewielka, zatem i
możliwość powstania uszkodzeń analizowanej próbki przez sam pomiar jest
znikoma,
 objętość badanej próbki to zaledwie – około 200µl,
 możliwe są pomiary próbek nieprzezroczystych,
 sygnał wolnych rodników w tle jest znikomy, pozwala to w sposób
niezaburzony obserwować upatrzone substancje wolnorodnikowe.
Poważnym utrudnieniem obserwacji bezpośredniej wolnych rodników może
być ich bardzo krótki czas życia. Aby ominąć ten problem stosowane są
tzw. pułapki spinowe (T). Są to związki diamagnetyczne, które dzięki obecności
wiązań typu  N  O , z łatwością wchodzą w reakcję z nietrwałym rodnikiem tworząc
trwałe addukty spinowe:
R  T 
R  T 

(6)
Czynniki wpływające na zafałszowania wyników
Jak dotąd nie ma jednej uniwersalnej i idealnej metody oznaczania aktywności
przeciwutleniającej. Pomimo tego, że większość z nich jest prosta, interpretacja
wyników bywa skomplikowana, np. kiedy analizowane próbki mają pokrywające się
widma. DPPH ma stosunkowo mały zasięg liniowy, ponadto istnieje wiele
antyoksydantów reagujących szybko z rodnikami propylowymi, ale wolno bądź wcale
z DPPH. Przy jego użyciu można oznaczyć tylko związki hydrofobowe w
przeciwieństwie do metody z zastosowaniem rodnika ABTS, która oznacza zarówno
hydrofobowe, jak i hydrofilowe.
W metodzie Folina-Ciocalteu'a czynnikiem, który najbardziej wpływa na
zafałszowania jest mieszanie się substancji, szczególnie cukrów, aromatycznych
amin, dwutlenku siarki, kwasu askorbinowego i kwasów organicznych. Dlatego
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
należy wprowadzać korekty. Dodatkowo niefenolowe substancje organiczne
(adenina, adenozyna, alanina, anilina, kwas aminobenzoesowy, kwas askorbinowy,
benzaldehyd, kreatynina, cysteina, cytozyna, dimetyloalanina, EDTA, fruktoza,
guanina, glicyna, histamina, histydyna, uracyl, kwas olejowy, tryptofan, białka,
sacharoza), jak i nieorganiczne (hydrazyna, siarczan amonu, siarczan manganu,
fosforan sodu) reagujące z odczynnikiem Folina dają w efekcie zawyżony wynik
końcowy aktywności przeciwutleniającej.
Niektóre metody opierają się na założeniu, że reakcje redoks przebiegają tak
szybko, że wszystkie kompletne reakcje zachodzą w przeciągu 4 do 6 minut.
W rzeczywistości to nie zawsze jest prawda. Szybko reagujące fenole, które wiążą
żelazo i rozbijają niższe związki najlepiej analizować w krótkim czasie (ok. 4 min).
Jednakże, niektóre polifenole reagują nieco wolniej i potrzebują dłuższego czasu
reakcji dla wykrycia (ok. 30 min). Źle dobrany czas reakcji również powoduje, że
wyniki są obarczone błędem.
Nie wszystkimi metodami można oznaczyć te same przeciwutleniacze.
Metoda FRAP nie mierzy np. glutationu. Wykrywa się go za pomocą oznaczenia
TRAP, opierającego się na fazie opóźnienia, zakładając, że wszystkie
przeciwutleniacze ją wykazują i że jej długość jest proporcjonalna do aktywności
przeciwutleniającej. Jednakże, nie wszystkie antyoksydanty posiadają oczywistą fazę
opóźnienia. Ponadto wartość otrzymana na podstawie samej fazy obniża rzeczywisty
wynik.
Skróty:
ORAC - Oxygen radical absorption capacity
TRAP - Total reactive antioxidant potential
FRAP - Ferric reducing ability of plasma albo Ferric reducing antioxidant power
CUPRAC - Cupric reducing antioxidant capacity
TEAC - Trolox equivalent antioxidant capacity
VCEAC - Vitamin C equivalent antioxidant capacity
AAPH - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane dihydrochloride
ABAP - 2,2'-azo-bis-2-amidinopropane
ABTS+ - 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)
DMPD – N,N-dimethyl-p-phenylenediamine
DPPH - 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część praktyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 1 i 2: ANALIZA
PRZECIWUTLENIACZY W PRODUKTACH
ŻYWNOŚCIOWYCH
Cel ćwiczenia
1. Ocena aktywności antyoksydacyjnej wybranych produktów metodą ABTS
i DPPH
2. Oznaczanie ogólnej zawartości polifenoli metodą kolorymetryczną z
odczynnikiem Folin-Ciocalteu
Przygotowanie ekstraktów z owoców
1. Porcję zliofilizowanych owoców przełożyć szczypczykami do zbiornika młynka
laboratoryjnego (do około połowy objętości pojemnika) i zmielić (2 x 12
sekund)
2. Do suchej i czystej kolby stożkowej (50 ml) ze szlifem odważyć po dokładnie
0,500 g rozdrobnionego liofilizatu i natychmiast zalać 25 ml metanolu
3. Do kolby włożyć mieszadełko, zatkać korkiem i pozostawić na 2h na
mieszadle magnetycznym (500 rpm)
4. Przesączyć całość przez sączek do czystej probówki wirowniczej, dopełnić do
25 ml (po doprowadzeniu do temp. pokojowej) i zwirować (3000 obr/min, 10
minut, 20ºC)
5. Nadsącz zebrać do czystej, zakręcanej probówki na 15 ml
6. Do czasu analizy przechowywać w zamrażarce
Analiza ABTS
Roztwór podstawowy ABTS*
(7 mM ABTS, 2.45 mM K2S2O8)
1. Przygotowanie 4,9 mM roztworu nadsiarczanu potasu K2S2O8:
 odważyć 0,132 g (dokładnie!) K2S2O8
 przenieść ilościowo do kolbki miarowej na 100 ml
 dopełnić do kreski wodą redestylowaną
 dokładnie wymieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (30 minut na
mieszadle magnetycznym)
 roztwór jest stabilny 1 dzień
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część praktyczna
___________________________________________________________________________
2. Przygotowanie PBS, pH 7,4:
 Do czystej butelki 500 ml wsypać 2 tabletki PBS
 Dopełnić do około 400 ml wodą redestylowaną,
 Co jakiś czas mieszać, aż do całkowitego rozpuszczenia (około 2-3
godzin)
3. Przygotowanie ABTS*
 do zakręcanej probówki na 15 ml odmierzyć pipetą automatyczną 1,3 ml
4,9 mM roztworu K2S2O8
 dodać 1 tabletkę ABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic
acid) – nie dotykać palcami!!!
 dodać 1,3 ml wody podwójnie destylowanej
 zakręcić probówkę, dokładnie wymieszać
 owinąć szczelnie folią aluminiową
 odstawić na 16 h w temperaturze pokojowej, w ciemnym miejscu
Roztwór podstawowy ma mieć kolor ciemnozielony. Przechowywać w lodówce,
nie zamrażać!
Roztwór roboczy ABTS (ABTS0.7)
Rozcieńczyć za pomocą PBS roztwór ABTS* tak, by jego absorbancja przy 734 nm
wynosiła A = 0,7 ± 0,02 (najlepiej gdy A jest bliższe 0,72). Przygotować taką ilość
roztworu ABTS0,7 by wystarczyła do analizy wszystkich próbek i wykonania krzywej
standardowej (licząc po 1 ml na każdy punkt pomiarowy). Gotowy roztwór
przechowywać w butelce z ciemnego szkła ze szlifem.
Metoda ta pozwala na ilościową ocenę zmiatania wolnych rodników na
podstawie zdolności składnika do wygaszania stabilnego rodnika ABTS.
Kwas 2,2’-azyno-bis (3-etylenobenzotiazolinowy) (rys. 1.) jest syntetycznym
kationorodnikiem, rozpuszczalnym w wodnych i organicznych roztworach,
pozwalającym na pomiar przeciwutleniaczy zarówno hydrofilowych, jak i
hydrofobowych. Jest on wrażliwy na światło i musi być przetrzymywany w ciemności.
W przeciwieństwie do DPPH rodnik ten nie jest dostępny w formie aktywnej.
W handlu występuje pod postacią nieaktywnej soli dwuamonowej i generuje się go
albo poprzez reakcję chemiczną (np. z dwutlenkiem manganu, nadsiarczanem
potasu, ABAP) lub enzymatyczną (z peroksydazą, mioglobiną, hemoglobiną).
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część praktyczna
___________________________________________________________________________
SO3H
Et
S
N
N
N
N
S
HO 3S
Et
Rys. 1. Budowa chemiczna rodnika ABTS
Krzywa standardowa Troloxu dla ABTS
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mM roztworu
Troloxu w PBS zgodnie z poniższą tabelą
Lp Stężenie
końcowe
standardu
[mg/100 ml]
1 0
2 1,25
3 2,5
4 5
5 7,5
6 10
Objętość
PBS
[μl]
Objętość
1mM Troloxu
[μl]
200
190
180
160
140
120
0
10
20
40
60
80
2. Do 7 kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS0.7
3. Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6,
wpisać kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 734 nm;
zero, non-intercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: 3
4. Ustawić blank w aparacie: PBS
5. Dodać do pierwszej kuwety 100 l roztworu Troloxu z probówki nr 1
i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować)
zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza!)
6. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 100 l roztworu z probówki nr 2
itd.
7. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 6 minut odczytać absorbancję
pierwszej kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu – żeby
spektrofotometr przeczytał absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią)
8. Po 30 sekundach (na stoperze 6:30) odczytać w analogiczny sposób
absorbancję roztworu w następnej kuwecie itd.
9. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część praktyczna
___________________________________________________________________________
Pomiar próbek metodą ABTS
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-,
pięcio-, dziesięcio-, pięćdziesięcio- i stukrotne) ekstraktów owocowych w PBS.
2. Do kuwet odmierzyć po 1 ml ABTS0.7
3. Ustawić blank w aparacie: PBS
4. Dodać do pierwszej kuwety 100 l pierwszego badanego ekstraktu
i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować)
zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza),
5. Zmierzyć absorbancję próbek (w 6. minucie), na podstawie krzywej wyliczyć
aktywność przeciwutleniającą badanych ekstraktów (w mg Troloxu/ 100 ml
ekstraktu). Wyciągnąć wnioski i zamieścić je w sprawozdaniu.
Analiza DPPH
Przygotowanie roztworu
1. Odważyć 0,012g DPPH w naczyńku wagowym, przenieść ilościowo do kolby
miarowej na 100 ml – uwaga: DPPH słabo się rozpuszcza, kryształki mogą
zatykać końcówkę pipety i powodować jej zalanie!
2. Dopełnić do kreski czystym etanolem (do 100 ml)
3. Odstawić na mieszadło magnetyczne na co najmniej 1 godzinę
4. Po całkowitym rozpuszczeniu DPPH przenieść roztwór do butelki z ciemnego
szkła. Roztwór ma kolor ciemno fioletowy!
W oznaczeniu metodą DPPH przeciwutleniacze obecne w badanej próbce
redukują stabilny rodnik azotowy 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH) powodując
spadek absorbancji mierzonej przy długości fali 517 nm (rys.2.). Roztwór aktywnego
rodnika ma barwę purpurową, a jego odbarwienie świadczy o tym, że niesparowany
dotąd elektron został sparowany.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część praktyczna
___________________________________________________________________________
N
N
.
+
N
O 2N
RH
NO 2
+
NH
O 2N
.
R
NO 2
O 2N
NO 2
Rys. 2. Reakcja redukcji rodnika DPPH przez antyutleniacz
Krzywa standardowa Troloxu dla DPPH
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować rozcieńczenia 1 mM roztworu
Troloxu w etanolu zgodnie z poniższą tabelą:
Lp
1
2
3
4
5
6
Stężenie
końcowe
standardu
[mg/100ml]
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Objętość
EtOH
[l]
Objętość
1 mM Troloxu
[l]
1000
980
960
940
920
900
0
20
40
60
80
100
2. Do 6 kuwet odmierzyć po 0,6 ml EtOH
3. Do każdej z kuwet dodać po 0,2 ml przygotowanego roztworu DPPH nie
dotykając końcówką do etanolu, po nałożeniu do wszystkich kuwet
przepipetować tą końcówką zawartość wszystkich kuwet
4. Ustawić spektrofotometr: Single Component Analysis; liczba standardów 6,
wpisać kolejno stężenia standardów (wg tabeli powyżej); długość fali 517 nm;
zero, non-intercept; czas pomiaru 0,2 sek; liczba powtórzeń: 3
5. Ustawić w aparacie blank: EtOH
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część praktyczna
___________________________________________________________________________
6. Dodać do pierwszej kuwety 200 l roztworu Troloxu z probówki nr 1 i
równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać (przepipetować)
zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza)
7. Po 30 sekundach dodać do kolejnej kuwety 200 l roztworu z probówki nr 2
itd.
8. W chwili, kiedy stoper pokaże dokładnie 10 minut odczytać absorbancję
roztworu z pierwszej kuwety (należy 3-krotnie kliknąć w pole standardu – żeby
spektrofotometr zmierzył absorbancję 3 razy i wyciągnął średnią)
9. Po 30 sekundach (na stoperze 10:30) odczytać w analogiczny sposób A
roztworu w następnej kuwecie itd.
10. Po odczytaniu A wszystkich roztworów Troloxu wykreślić krzywą wzorcową.
Pomiar próbek metodą DPPH
1. W probówkach typu Eppendorf przygotować kolejne rozcieńczenia (dwu-,
pięcio-, dziesięcio-, pięćdziesięcio- i stukrotne) badanych ekstraktów w
wodzie redestylowanej.
2. Przygotować mieszaninę 0,6 ml EtOH i 0,2 ml DPPH w kuwecie, dokładnie
przepipetować, żeby kolor był jednolity
UWAGA: Dla ułatwienia i przyspieszenia pracy można przygotować sobie
rozcieńczenie DPPH. W tym celu: odmierzyć w suchej, czystej kolbie miarowej
dokładnie 25 ml roztworu DPPH, przelać ilościowo do kolby miarowej na 100 ml
(wypłukiwać kolbę etanolem, aż etanol będzie całkiem bezbarwny), dopełnić
kolbę do kreski etanolem (czyli do 100 ml). Wymieszać, aż kolor roztworu będzie
jednolity. Przelać zawartość do 2 butelek z ciemnego szkła na 50 ml. Tak
rozcieńczony roztwór dodajemy do kuwet w ilości 0,8 ml!
3. Odczytać blank: EtOH
4. Dodać do pierwszej kuwety 0,2 ml rozcieńczonego pierwszego badanego
ekstraktu (ekstrakt nr 1) i równocześnie włączyć stoper, dokładnie wymieszać
(przepipetować) zawartość kuwety (uważać, żeby nie powstały pęcherzyki
powietrza!). Po 30 sekundach do drugiej kuwety dodać 0,2 ml kolejnego
rozcieńczenia ekstraktu nr 1, po kolejnych 30 sekundach, do następnej
kuwety, dodać 0,2 ml następnego rozcieńczenia itd.
5. Pomiar absorbancji roztworu w kuwecie wykonać dokładnie w 10 minut od
dodania ekstraktu do kuwety, na podstawie krzywej wyliczyć aktywność
przeciwutleniającą badanych ekstraktów (w mg Troloxu/ 100 ml ekstraktu).
6. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je w sprawozdaniu.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
część praktyczna
___________________________________________________________________________
Oznaczenie zawartości polifenoli ogółem
Wykonanie krzywej wzorcowej
1. Z roztworu standardowego (+)katechiny o stężeniu 50 mg/100 cm 3 (w
metanolu) przygotować rozcieńczenia do krzywej wzorcowej.
2. W tym celu do kolby miarowej na 25 cm3 dodać: 0,5; 1,25; 2,5; 3,75; 5 cm3
standardowego roztworu katechiny i dopełnić metanolem do kreski.
3. Następnie z każdej kolby pobrać 2,5 cm3 do kolb miarowych na 25 cm3 i
dopełnić wodą redestylowaną.
4. Z tak przygotowanych roztworów do kolb stożkowych przenieść po 5 cm 3
roztworu, dodać 0,25 cm3 odczynnika Folina-Ciocalteau (rozcieńczonego
wcześniej wodą redestylowaną w stosunku 1:1 v/v) oraz 0,5 cm 3 7% roztworu
Na2CO3. Zamieszać i pozostawić w ciemności na 30 min.
5. Po tym czasie zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ
= 760 nm (blank = metanol). Wykreślić krzywą wzorcową.
Badanie właściwe
1. Przygotować rozcieńczenia ekstraktu wyjściowego: 2-, 5- i 10-krotne z
użyciem metanolu. Następnie pobrać 2,5 cm3 przenieść do kolb miarowych o
pojemności 25 cm3 i dopełnić wodą.
2. Z tak przygotowanych roztworów pobrać 5 cm 3, dodać 0,25 cm3 odczynnika
Folina–Ciocalteau (1:1) oraz 0,5 cm3 7% Na2CO3. Wymieszać i pozostawić na
30 min. w ciemności.
3. Zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm
(blank = metanol).
4. Z krzywej wzorcowej odczytać zawartość polifenoli ogółem wyrażoną w mg
katechiny/100 ml ekstraktu.
5. Wyciągnąć wnioski i zamieścić je wraz z wynikami w sprawozdaniu.
ELEKTYW: Witaminy i przeciwutleniacze w żywności i napojach
piśmiennictwo
___________________________________________________________________________
Piśmiennictwo
1. Apak R., Güclü K.G., Özyürek M., Karademir S.E.: Novel total antioxidant
capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric
iron reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method, J.
Argic. Food Chem. 2004, 52, 7970-7981.
2. Arnao M.B.: Some methodological problems in the determination of
antioxidant activity using chromogen radicals: a practical case, Trends Food
Sci. Technol. 2000, 11, 419-421.
3. Arts M.J.T.J., Haenen G.R.M.M., Voss H.P., Bast A.: Antioxidant capacity of
reaction products limits the applicability of the Trolox equivalent antioxidant
capacity (TEAC) assay, Food Chem. Toxicol. 2004, 42, 45-49.
4. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Warszawa. Wydawnictwo naukowe PWN,
1995.
5. Korotkova E.I., Karbainov A.Y., Shevchuk A.V.: Study of antioxidant properties
by voltammetry, J. Electroanal. Chem. 2002, 518, 56-60.
6. Miller N.J., Rice-Evans C.A., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A.: A novel
method for measuring the antioxidant capacity, 1993, 84, 407-412.
7. Miller N.J., Rice-Evans C.A.: Factors influencing the antioxidant activity
determined by the ABTS+· radical cation assay, Free Radical Res. 1997, 26,
195-199.
8. Prior R. L., Wu X., Schaich K.: Standarized methods for the determination of
antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric.
Food Chem. 2005, 53, 4290-4302.
9. Re R., Pellegrini N., Porteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C.:
Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization
assay. Free Radic. Res., 1999, 26 (9/10), 1231-1237.
10. Sanchez-Moreno C.: Review: Methods used to evaluate the free radical
scavenging activity in foods and biological systems, Food Sci. Tech. Int. 2002,
8 (3), 121-137.
11. Schlesier K., Harwat M., Böhm V., Bitsch R.: Assessment of antioxidant
activity by using different in vitro methods. Free Radic. Res., 2002, 36 (20),
177-187
12. Swain T., Hillis W.E.: The phenolic constituents of Prunus domestica. I. The
quantitative analysis of phenolic constituents; J. Sci. Food. Agric. 1959, 10; 63
– 68.