DZIEŃ 1 | 31.05.2016 Technika Real-Time PCR

DZIEŃ 1 | 31.05.2016 Technika Real-Time PCR - Oznaczenia ilościowe
9:00 – 11:00 Wykład 1: Podstawy techniki Real-time PCR
 podstawowe różnice między klasycznym PCR, Real-Time PCR a ilościowym PCR (qPCR)
 metody detekcji kwasów nukleinowych stosowanych w urządzeniach Real-Time PCR (barwniki
fluorescencyjne, sondy znakowane flourescencyjnie)
 terminologia stosowana do opisu technik PCR w czasie rzeczywistym (Cq, ΔΔCq, krzywa standardowa,
wydajność reakcji)
 przegląd głównych grup zastosowań techniki Real-Time PCR
o wykrywanie i identyfikacja materiału genetycznego w próbie badanej
o oznaczanie ilości kopii DNA (kwantyfikacja bezwzględna)
o analiza ekspresji genów (kwantyfikacja względna)
o genotypowanie (badanie mutacji i polimorfizmów, identyfikacja gatunków)
 Zapoznanie się z urządzeniem do prowadzenia reakcji PCR z możliwością pomiaru w czasie rzeczywistym
(zasada działania, aplikacje, software)
11:00 – 11:15 Przerwa – kawa
11:15 – 12:00 Część praktyczna I : Przygotowanie reakcji kwantyfikacji qPCR
 Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i prób do reakcji Real-Time PCR
 Programowanie aparatu do Real-Time PCR
12:00 – 13:30 Wykład 2: Zastosowanie Real-Time PCR do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych
 kwantyfikacja bezwzględna
 kwantyfikacja względna
 krzywe standardowe
13:30 – 14:00 Przerwa – catering
14:00 – 15:30 Wykład 3: Optymalizacja reakcji qPCR
 Określanie wydajności reakcji Real-Time PCR
 Czynniki wpływające na wydajność reakcji oraz inhibitory reakcji Real-Time PCR
 Strategia optymalizacji protokołu reakcji, ustalanie najlepszych warunków reakcji i optymalnego składu
mieszaniny reakcyjnej
 Universal Probe Library (UPL)
 Panele Real-Time Ready
15:30 – 16:00 Część praktyczna II : Analiza wyników reakcji qPCR:
 Omówienie wyników.
 Dyskusja.
DZIEŃ 2 | 01.06.2016 Technika Real-Time PCR - Oznaczenia jakościowe, genotypowanie
9:00 – 10:00 Wykład 1. Wprowadzenie do genotypowania
 SNP, mutacje i ich znaczenie
 genotypowanie techniką real-time PCR jako alternatywa dla RFLP i SSCP
 amplifikacja allelospecyficzna
 genotypowanie w oparciu o krzywą topnienia i typu end point za pomocą sond hybrydyzujących i
hydrolizujących
10:00 – 11:00 Wykład 2. Technika Real-Time PCR - High Resolution Melting (qPCR-HRM)
 Zasada wykonywania oznaczenia
 Przebieg reakcji, profil termiczny i kluczowe parametry reakcji qPCR-HRM
 Barwniki stosowane w analizie HRM
 Analiza krzywych topnienia wysokiej rozdzielczości
 Identyfikacja genotypów
11:00 – 11:15 Przerwa – kawa
11:15 – 12:00 Część praktyczna I : Genotypowanie SNP za pomocą techniki HRM
 Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i prób do reakcji HRM
 Programowanie aparatu do Real-Time PCR
12:00 – 12:45 Wykład 3. Optymalizacja i nastawianie reakcji qPCR-HRM
 Optymalizacja warunków reakcji
 Optymalizacja składu mieszaniny reakcyjnej
12:45 – 13:30 Wykład 4. Analiza poziomu metylacji DNA za pomocą krzywej topnienia wysokiej rozdzielczości
(MS-HRM)
13:30 – 14:00 Przerwa – catering
14:00 – 15:30 Wykład 5. Analiza wyników reakcji qPCR-HRM
 Analiza „typowych” wyników reakcji qPCR-HRM
 Analiza wyników „problematycznych” – troubleshooting
15:30 – 16:00 Część praktyczna II : Analiza wyników uzyskanych w reakcji qPCR-HRM
 Analiza wyników reakcji wykonywanej przez uczestników warsztatów
 Dyskusja