docDiagnostyka molekularna achondroplazji
download 
Reklamacja Transkrypt
Diagnostyka molekularna achondroplazji
&ARM0RZEGL.AUK COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. $IAGNOSTYKAMOLEKULARNAACHONDROPLAZJI -OLECULARDIAGNOSTICSOFACHONDROPLASIA 0AULINA"ORKOWSKA*AN+OWALSKI +ATEDRAI:AKAD'ENETYKI-EDYCZNEJ7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH Streszczenie Achondroplazja jest najczęściej spotykaną nieletalną dysplazją szkieletową. Choroba dziedziczona autosomalnie dominująco jest skutkiem mutacji punktowej w genie kodującym receptor 3 dla czynnika wzrostu fibroblastów – FGFR3. Badania w kierunku achondroplazji mogą być prowadzone na etapie rozwoju prenatalnego, postnatalnego, a także jako element diagnostyki przedimplantacyjnej. Stosowana w tym celu diagnostyka molekularna wykorzystuje metodę PCR-RFLP lub jej modyfikacje. Słowa kluczowe: achondroplazja, mutacja punktowa, receptor 3 czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR3), enzymy restrykcyjne Achondroplazja zwana także chondrodystrofią lub dwarfizmem jest najczęściej spotykaną, nieletalną (w układzie heterozygotycznym) dysplazją szkieletową. Częstość jej występowania waha się pomiędzy 1/10000 a 1/30000 urodzeń i nie zależy od rasy lub płci [1]. W achondroplazji obserwujemy nieprawidłowe kostnienie śródchrzęstne, w efekcie pojawiają się zaburzenia w rozwoju kości i karłowatość. Skróceniu ulegają przede wszystkim kość udowa i kości przedramienia, co powoduje zaburzenie proporcji ciała. Inne cechy charakterystyczne dla tej jednostki chorobowej to szpotowatość kończyn, ręka trójzębna, przykurcze w stawach, lordoza lędźwiowa, nieproporcjonalnie duża głowa i wyraźnie zapadnięta nasada nosa [2]. Achondroplazja to choroba uwarunkowana genetycznie, dziedziczona autosomalnie dominująco, jednak w 90% przypadków powstaje de novo. Prawdopodobieństwo urodzenia chorego potomstwa rośnie wraz z wiekiem ojca [3]. W przypadku obojga rodziców z achondroplazją prawdopodobieństwo powstania homozygoty z dwarfizmem wynosi 25%, jednak układ homozygotyczny jest letalny na etapie rozwoju zarodkowego [4]. W 97% przypadków przyczyną achondroplazji jest pojedyncza mutacja punktowa, w genie kodującym receptor 3 dla czynnika wzrostu fibroblastów - FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3). Gen ten zlokalizowany jest w krótkim ramieniu chromosomu 4 (4p16.3), a mutacja pojawiająca się w pozycji 1138 to substytucja typu tranzycji – w tym przypadku zamiana guaniny na adeninę. Pozostałe 3% przypadków achondroplazji związane jest z wystąpieniem mutacji w tej samej pozycji, jednak jest to substytucja typu transwer- Abstract Achondroplasia is the most common non-lethal skeletal dysplasia. This autosomal dominant disorder is caused by point mutation in the gene encoding the type 3 receptor for fibroblast growth factor FGFR3. Achondroplasia can be diagnosed prenatally, postnatally or in blastomers before implantation. Molecular detection of achondroplasia is based on typical PCR-RFLP method or modified PCRRFLP. Key words: achondroplasia, point mutation, fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3); restriction enzyme sji –zamiana guaniny na cytozynę. Pojawiające się substytucje to mutacje zmiany sensu. W efekcie, w obu przypadkach, w kodonie 380 glicyna zastępowana jest argininą (G380R), a zmiana dotyczy transmembranowej domeny FGFR3 [5]. Celem opracowania i wdrożenia metod molekularnych do diagnostyki postnatalnej achondroplazji była możliwość wczesnego wykluczenia lub potwierdzenia choroby. Szybkie rozpoczęcie terapii ma niebagatelny wpływ na jakość życia chorego. Badania molekularne wykrywające achondroplazję są także ważnym elementem badań prenatalnych [6] i przedimplantacyjnych w przypadku rodzin z grupy ryzyka [7]. Pierwszym etapem diagnostyki postnatalnej choroby jest izolacja DNA z krwi pełnej przy użyciu gotowych zestawów [4] lub izolacja z zastosowaniem standardowej procedury [2]. Po przeprowadzeniu ekstrakcji dokonujemy analizy ilościowej i jakościowej otrzymanego DNA. Kolejnym etapem jest przeprowadzenie reakcji PCR z użyciem starterów (F: 5’AGGAGCTGGTGGAGGCTGA3’ R: 5’GGAGATCTTGTGCACGGTGG3’) flankujących region podlegający mutacji. Produkt reakcji ma wielkość 164 pz (Tab. I) [5]. Zastosowanie techniki PCR-RFLP z użyciem różnych enzymów restrykcyjnych pozwala na zdiagnozowanie choroby oraz na określenie genotypu pacjenta. Produkt o wielkości 164 pz, jest trawiony enzymami SfcI lub MspI przy odpowiednich dla danego enzymu warunkach termicznych (Tab. I). Enzym SfcI trawi zmutowany produkt PCR na fragmenty o wielkości 109 pz i 55 pz pozwalając tym samym na zdiagnozowanie genotypu G/A lub A/A. Enzym MspI tra- &ARM0RZEGL.AUK Tab. I. Sekwencje starterów i warunki zastosowane do analizy RFLP w celu zdiagnozowania określonego typu mutacji [5], zmodyfikowano wg [4] PCR Zastosowane startery 1 F: 5’AGGAGCTGGTGGAGGCTGA3’ R: 5’GGAGATCTTGTGCACGGTGG3’ 2 F: 5’AGGAGCTGGTGGAGGCTGA3’ R: 5’GGAGATCTTGTGCACGGTGG3’ Wielkość otrzymanego produktu 164 pz 164 pz Ryc. 1. Elektroforogram przedstawiający wynik trawienia produktów PCR enzymami SfcI i MspI. Pacjenci 1 i 2 (przy enzymie SfcI) to heterozygoty G1138A. Brak produktów trawienia enzymem MspI świadczy o braku genotypu G1138C u któregokolwiek z pacjentów, zmodyfikowano wg [4]. wi zmutowany produkt PCR na fragmenty o długości 107 pz i 57 pz, pozwalając na zdiagnozowanie genotypu G/C lub C/C. U żywo urodzonych pacjentów, oprócz wymienionych powyżej, znamiennych dla danego enzymu produktów trawienia, występuje także produkt o długości 164 pz świadczący o heterozygotycznym genotypie (G/A lub G/C). Zdrowy pacjent pozbawiony mutacji w obu allelach genu FGFR3 w pozycji 1138 nie posiada miejsca uchwytu dla żadnego z enzymów restrykcyjnych i reprezentuje genotyp G/G. Wynik trawienia obserwowany jest na żelu agarozowym (Ryc. 1) [4]. Warunki trawienia Zdiagnozowana mutacja SfcI: 37°C; 1 h SfcI: 25°C; 16 h Produkty: 109 pz; 55 pz MspI: 37°C; 1 h Produkty: 107 pz; 57 pz G1138A G1138C Diagnostyka przedimplantacyjna w kierunku achondroplazji prowadzona jest w przypadku gdy u jednego lub obu partnerów występuje choroba. Diagnostykę przedimplantacyjną przeprowadza się na polocytach, blastomerach lub komórkach trofodermy blastocysty. Biopsja ciałek kierunkowych i analiza zawartego w nich materiału genetycznego pozwala wywnioskować czy dana komórka jajowa po zapłodnieniu rozwinie się w zdrowy zarodek [8]. Do diagnostyki achondroplazji wykorzystywane są również blastomery. W celu uniknięcia błędnego rozpoznania należy pobrać dwa blastomery z każdego zarodka. Przeprowadzając lizę blastomeru za pomocą komercyjnie dostępnych zestawów, DNA uwalniane jest z wnętrza komórki. Prowadząc reakcję PCR na matrycy pozyskanej z pojedynczej komórki wzrasta ryzyko kontaminacji próbki obcym DNA. Ponadto rośnie prawdopodobieństwo wystąpienia zjawisk niepożądanych takich jak nierównomierna amplifikacja alleli heterozygoty (efekt stochastyczny) lub wypadanie alleli ADO (ang. allelic drop out). Dlatego też przed przeprowadzeniem właściwej reakcji PCR prowadzi się wstępną amplifikację całego genomu [7]. Kolejnym etapem jest przeprowadzenie właściwej reakcji PCR z użyciem odpowiednich starterów flankujących region podlegający mutacji np.: (F: 5’CTGTCGCTTGAGCGGGAAGC3’ R: 5’CCGAGGAGGAGCTGGTGGA3’). W tym przypadku końcowym efektem reakcji jest produkt o długości 191 pz. Starter antysensowny zastosowany w reakcji należy wyznakować sondą fluorescencyjną. Oprócz reakcji PCR przeprowadzonej dla materiału badanego wy- 4800 3600 2400 1200 0 1B : digestion control 1R : size standard 1Y : heterorygous 2B : digestion control 2R : size standard 2Y : normal control 4800 3600 2400 1200 0 Ryc. 2. Elektroforogram produktu PCR locus G380 genu FGFR3. Standard wielkości Genescan Rox500 zaznaczony jako puste piki. Próbka referencyjna kolor szary, próbka badana kolor czarny. Profil pierwszy – heterozygota G380R, profil drugi zdrowa homozygota [7]. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. konywane są czynności analogiczne dla próbki referencyjnej (DNA limfocytów). Jedyną różnicą jest wyznakowanie startera antysensownego inną sondą fluorescencyjną [7]. Otrzymane produkty PCR poddajemy działaniu enzymu restrykcyjnego SfcI lub MspI z zastosowaniem odpowiednich warunków termicznych. Enzym SfcI trawi zmutowany produkt PCR na fragmenty o długości 61 pz i 130 pz [7]. Przed przystąpieniem do analizy należy zmieszać równe objętości otrzymanych produktów PCR (próbki badanej i referencyjnej). Podczas analizy rejestrowany jest sygnał od fragmentów 130 pz i 191 pz ponieważ tylko jeden starter w każdej z reakcji był wyznakowany fluorochromem. Na podstawie otrzymanego elektroforogramu (Ryc. 2) określany jest genotyp pacjenta. Dzięki analizie próbki badanej w odniesieniu do kontroli możliwa staje się także ocena wydajności reakcji PCR oraz stopnia wypadania alleli [7]. W rodzinach z grupy ryzyka, w których doszło do naturalnego zapłodnienia, metody molekularne są wykorzystywane do prenatalnego diagnozowania achondroplazji. Prawdziwa rewolucja w nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej nastąpiła gdy okazało się, iż w matczynej krwi obwodowej znajdują się komórki płodu. Stanowią one szczególnie cenny materiał do badań prenatalnych, gdyż zawierają DNA innej wielkości niż DNA matki [6]. W celu przeprowadzenia analizy należy wyizolować DNA z krwi obwodowej pobranej od matki. Po ekstrakcji, DNA należy rozdzielić w 1% żelu agarozowym, a wiedząc, iż DNA płodu ma wielkość 300 pz można dokładnie określić jego umiejscowienie. Przy pomocy komercyjnie dostępnych zestawów z żelu ekstrahowane jest DNA płodu [9]. Następnie, podobnie jak w przypadku innego materiału należy przeprowadzić reakcję amplifikacji z zastosowaniem odpowiednio dobranych starterów. Otrzymany produkt PCR trawiony jest enzymem restrykcyjnym, a dzięki analizie znamiennych produktów określany jest genotyp pacjenta [6]. Diagnostyka molekularna achondroplazji odgrywa ogromne znaczenie na każdym z przedstawionych etapów rozwoju. W przypadku diagnostyki przedimplantacyjnej u rodzin z grupy ryzyka umożliwia wybór i implantację zdrowego zarodka. W przypadku diagnostyki prenatalnej umożliwia przerwanie ciąży na jej wczesnym etapie lub daje szansę przyszłym rodzicom na oswojenie się z trudną, niecodzienną sytuacją. W badaniach postnatalnych pozwala na stuprocentowe potwierdzenie diagnozy postawionej na podstawie cech fenotypowych i wczesne wdrożenie zróżnicowanych metod terapii. Prawdziwą zaletą przytoczonych metod są niskie koszty ich wykonania, dlatego też istnieje realna możliwość wdrożenia badań w kierunku achondroplazji do standardowych procedur przedimplantacyjnych. Piśmiennictwo 1. Baujat G i wsp. Achondroplasia. Best Pract Res Clin Rheumat 2008; 22: 3-18. 2. Bellus GA i wsp. Achondroplasia is defined by recurrent G380A mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995; 56: 368–373. 3. Wilkin DJ, Szabo JK, Cameron R. Mutations in fibroblast growth-factor receptor 3 in sporadic cases of achondroplasia occur exclusively on the paternally derived chromosome. Am J Hum Genet 1998; 63: 711–716. 4. Lale Satiroglu–Tufan N i wsp. Accurate diagnosis of homozygous G1138A mutation in the fibroblast growth factor receptor 3 gene responsible for achondroplasiia. Tohoku J Exp Med 2006; 208: 103-107. 5. Shiang R i wsp. Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism, achondroplasia. Cell 1994; 78: 335–342. 6. Li Y i wsp. Improved prenatal detection of a fetal point mutation for achondroplasia by the use of size-fractionated circulatory DNA in maternal plasma-case report. Prenat. Diagn. 2004, 24: 896-898. 7. Moutou C i wsp. Preimplantation genetic diagnosis for achondroplasia: genetics and gynaecological limits and difficulties. Hum Reprod 2003, 18: 509-514. 8. Braude P. Preimplantation genetic diagnosis and embryo research – human developmental biology in clinical practice. Int J Dev Biol 2001, 45: 607-611. 9. Li Y i wsp. Detection of Paternally Inherited Fetal Point Mutations for β-Thalassemia Using Size-Fractionated Cell-Free DNA in Maternal Plasma. JAMA 2005, 293. data otrzymania pracy: 19.11.2009 r. data akceptacji do druku: 04.02.2010 r. Adres do korespondencji: Paulina Borkowska Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Ostrogórska 30, 41-200 Sosnowiec tel: +44 32 364 14 01 e-mail: [email protected]
