Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE
Transkrypt
Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE
Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE Wpisany przez Publicysta 1. PCR W pierwszym kroku należy namnożyć fragment przeznaczony do sekwencjonowania. Następni e oczyścić produkt z wolnych oligonukleotydów oraz wolnych dNTPs. W tym celu można się posłużyć dwiema metodami: - trawienie enzymami - zalecany jest PCR CleanUp Mix firmy GeneSys (www.gene-sys.pl) 1ul MIX'a na 5 ul PCR'a; inkubacja 37 o C przez 15-30 minut (czas należy dobrać eksperymentalnie), potem 80 o C przez 15 min. - metodą kolumienkową - zalecany zestaw PCR Purification Kit firmy GeneSys (www.gene-sys.pl) Po oczyszczeniu produktu należy zmierzyć stężenie DNA. 2. Sekwencjonowanie Należy przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą: DNA matrycowe (0.1-1.0 ug) X ul Primer reakcji (3.2 pmol) X ul Big Dye 2 ul 2.5X BD buffer 2 ul H 2 O uzupełnić do 20 ul Warunki reakcji: denaturacja 96 o C przez 1 min 1/3 Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE Wpisany przez Publicysta 35 cykli 96 50 60 4 o o o o C przez 10 sek C przez 5 sek C przez 4 min C do czasu wyjęcia próbek z termocyklera 3a. Precypitacja produktu po sekwencjonowaniu 1. Przygotowanie mieszaniny precypitacyjnej (każda w osobnej probówce 1.5 ml): 1. - 2 ul 3M NaOAC - 50 ul 95% EtOH - Do takiej mieszaniny dodać produkt po sekwencjonowaniu. - Umieścić na lodzie na 10 min (nie dłużej aż zobaczymy wyprecypitowany kolorowy osad). - Odwirować na maksymalnej prędkości (czyli ok 10 000 - 15 000 g) przez 15-30 min. - Osad przemyć 70% EtOH. - Po zlaniu etanolu podsuszyć osad przez 10-15 minut (bez grzania). UWAGA nie wolno przesuszyć. - Osad rozpuścić w formamidzie lub przechowywać w postaci nierozpuszczonej w -20 o C. 3b. Oczyszczanie produktu po sekwencjonowaniu. Jest to metoda alternatywna do precypitacji. Można ją używać dla produktów do 500bp. 2/3 Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE Wpisany przez Publicysta 1. Do 5ul produktu po sekwencjonowaniu dodać 1ul enzymu SAP (alkaliczna fosfataza). 2. Inkubować przez 1h w temperaturze 37 o C, a następnie 20 min w temperaturze 70 o C. 3. Do rozdziału na sekwenator sporządzić mieszaninę: 1-3ul mieszaniny po trawieniu + 9ul formamidu. 4. Rozdział produktów sekwencjonowania Zalecany jest rozdział produktów wg dołączonego do zestawu manuala. UWAGI: 1. Trzeba pamiętać że zarówno etanol jak i wysokie stężenie soli wpływa na wydajność reakcji sekwencjonowania. 2. Produkt sekwencjonowania nie powinien być przechowywany w formamidzie. Jeśli nie planujemy rozdziału bezpośrednio po precypitacji bezpieczniej jest przechowywać produkt w o C. postaci osadu w -20 Powyższa procedura została wypróbowana przez autora niniejszego opracowania jednak nie bierze on odpowiedzialności za jej wykorzystanie. 3/3