HercepTest

Transkrypt

HercepTest

HercepTest™
Nr kat. K5204
Wydanie 20
Do barwienia immunocytochemicznego.
Zestaw na 35 testów (70 szkiełek).
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 1/56
Spis treści
Strona
Przeznaczenie ................................................................................................................ 4
Streszczenie i wyjaśnienia - sutek................................................................................... 5
Dodatkowe informacje ................................................................................................. 5
Właściwości................................................................................................................. 5
Zasada testu - sutek........................................................................................................ 6
Odczynniki - sutek........................................................................................................... 6
Dostarczane materiały ................................................................................................. 6
Materiały wymagane, lecz niedostarczone................................................................... 8
Przechowywanie - sutek.................................................................................................. 8
Przygotowanie próbek - sutek ......................................................................................... 9
Skrawki zatapiane w parafinie ..................................................................................... 9
Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu ............................................................. 9
Środki ostroŜności - sutek ............................................................................................. 10
SPOSÓB UśYTKOWANIA - sutek ................................................................................ 12
A. Przygotowanie odczynników .................................................................................. 12
A.1
Epitope Retrieval Solution................................................................................ 12
A.2
Bufor płuczący ................................................................................................. 12
A.3
Roztwór substrat-chromogen (DAB)................................................................. 12
A.4
Barwienie kontrastowe ..................................................................................... 12
A.5
Środek do zatapiania ....................................................................................... 13
B. Procedura barwienia .............................................................................................. 13
B.1
Uwagi dotyczące procedury ............................................................................. 13
B.2
Wykonanie odczynu ......................................................................................... 14
Kontrola jakości - sutek ................................................................................................. 16
Interpretacja wyniku barwienia - sutek........................................................................... 17
Ograniczenia - sutek ..................................................................................................... 21
Ograniczenia ogólne.................................................................................................. 21
Ograniczenia specyficzne dla produktu ..................................................................... 22
Charakterystyka przebiegu testu - sutek ....................................................................... 22
Dodatkowe informacje ............................................................................................... 22
Badania porównawcze............................................................................................... 23
Porównanie z testem uŜywanym w badaniach klinicznych (CTA) .............................. 23
Dokładność................................................................................................................ 24
Powtarzalność ........................................................................................................... 24
Immunoreaktywność.................................................................................................. 25
Rozwiązywanie problemów - sutek ............................................................................... 26
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 2/56
Streszczenie i wyjaśnienia - Ŝołądek ............................................................................. 29
Właściwości............................................................................................................... 29
Zasada testu - Ŝołądek .................................................................................................. 29
Odczynniki - Ŝołądek ..................................................................................................... 30
Dostarczane materiały ............................................................................................... 30
Materiały wymagane, lecz niedostarczone................................................................. 31
Przechowywanie - Ŝołądek............................................................................................ 32
Przygotowanie próbek - Ŝołądek ................................................................................... 32
Skrawki zatapiane w parafinie ................................................................................... 32
Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu ........................................................... 33
Środki ostroŜności - Ŝołądek ......................................................................................... 33
SPOSÓB UśYTKOWANIA - Ŝołądek............................................................................. 35
A. Przygotowanie odczynników .................................................................................. 35
A.1
Epitope Retrieval Solution................................................................................ 35
A.2
Bufor płuczący ................................................................................................. 35
A.3
Roztwór substrat-chromogen (DAB)................................................................. 35
A.4
Barwienie kontrastowe ..................................................................................... 35
A.5
Środek do zatapiania ....................................................................................... 36
B. Procedura barwienia .............................................................................................. 36
B.1
Uwagi dotyczące procedury ............................................................................. 36
B.2
Wykonanie odczynu ......................................................................................... 37
Kontrola jakości - Ŝołądek ............................................................................................. 39
Interpretacja wyniku barwienia - Ŝołądek....................................................................... 40
Ograniczenia - Ŝołądek ................................................................................................. 44
Ograniczenia ogólne.................................................................................................. 44
Ograniczenia specyficzne dla produktu ..................................................................... 45
Charakterystyka przebiegu testu - Ŝołądek.................................................................... 46
Powtarzalność ........................................................................................................... 48
Immunoreaktywność.................................................................................................. 50
Rozwiązywanie problemów - Ŝołądek............................................................................ 51
Piśmiennictwo ............................................................................................................... 54
Objaśnienie symboli ...................................................................................................... 56
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 3/56
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
HercepTest™ to półilościowy test immunocytochemiczny słuŜący do wykrywania nadmiernej
ekspresji białka HER2 w tkankach raka sutka poddawanych rutynowym badaniom histologicznym i
w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkanek raka od pacjentów z
gruczolakorakiem połączonym zespoleniem Ŝołądkowo-przełykowym. HercepTest™ jest
przeznaczony do wspomagania badania pacjentów, u których rozwaŜane jest podjęcie leczenia
lekiem Herceptin™ (trastuzumab) (zob. ulotka dołączona do opakowania Herceptin™).
UWAGA dotycząca wyłącznie raka sutka: Wszystkich pacjentów uczestniczących w badaniach
klinicznych leku Herceptin™ wybierano przy uŜyciu testu immunocytochemicznego przeznaczonego
do badań klinicznych (CTA, ang. clinical trial assay). śadnego z pacjentów uczestniczącego w tych
badaniach nie wybierano przy uŜyciu testu HercepTest™. Test HercepTest™ porównano z testem
przeznaczonym do badań klinicznych na niezaleŜnie wybranym zbiorze próbek, stwierdzając
moŜliwą do przyjęcia zgodność wyników. Nie ustalono jednak faktycznej korelacji między wynikami
testu HercepTest™ a klinicznymi wynikami stosowania leku Herceptin™.
UWAGA dotycząca wyłącznie nowotworów Ŝołądka: Wszyscy pacjenci fazy III badania
BO18255 (ToGA), sponsorowanego przez Hoffmann-La Roche, zostali dobrani z zastosowaniem
testu Dako HercepTest™ (IHC) i zestawu Dako HER2 FISH pharmDx™ Kit (FISH). Badanie
wykazało uŜyteczność kliniczną obu testów przy ocenie statusu HER2 pacjentów z
nieoperacyjnym, miejscowo zaawansowanym gruczolakorakiem Ŝołądka, nawracającym i/lub
przerzutowym gruczolakorakiem Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego.
Gruczolakorak Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, jest w tym dokumencie
nazywany rakiem Ŝołądka.
Szczegółowe informacje o aplikacji raka sutka na stronach 5-28.
Szczegółowe informacje o aplikacji raka Ŝołądka na stronach 29-53.
WaŜne: NaleŜy zwrócić uwagę na róŜnice pomiędzy tkanką nowotworu sutka i Ŝołądka,
zwłaszcza przy interpretacji wyniku barwienia.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 4/56
Rak sutka
Streszczenie i wyjaśnienia - sutek
Dodatkowe informacje
Ludzki gen HER2 (znany takŜe jako ERBB2 lub NEU) koduje białko oznaczane najczęściej
symbolem HER2 lub p185HER2. Białko HER2 to transbłonowe białko receptorowe o aktywności
kinazy tyrozynowej, wykazujące homologię do receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR
lub HER1) (1-8). Białko HER2 jest składnikiem prawidłowym, wykazującym ekspresję w róŜnych
typach komórek nabłonkowych (8).
U pewnego ułamka chorych na raka sutka białko HER2 wykazuje nadmierną ekspresję w procesie
zezłośliwiania i progresji nowotworu (9). Nadmierna ekspresja białka HER2 na powierzchni
komórek raka sutka stała się punktem wyjścia do opracowania metody leczenia przeciwciałami
skierowanymi przeciwko temu białku. Herceptin™ (trastuzumab) to „uczłowieczone” przeciwciało
monoklonalne (10), które wiąŜe się z białkiem HER2, wykazując do niego silne powinowactwo.
W badaniach in vitro i in vivo stwierdzono, Ŝe przeciwciało to blokuje rozrost ludzkich komórek
nowotworowych wykazujących nadmierną ekspresję białka HER2 (11-13).
Właściwości
Test HercepTest™ opracowano jako alternatywę dla testu badawczego CTA uŜywanego w
badaniach klinicznych leku Herceptin™. Charakterystykę wydajnościową testu HercepTest™ w
określaniu nadmiernej ekspresji białka HER2 oceniano w niezaleŜnym badaniu porównującym
wyniki testu HercepTest™ z wynikami testu do badań klinicznych na 548 próbkach tkanki raka
sutka, przy czym Ŝadna z tych próbek nie pochodziła od pacjentów uczestniczących w badaniach
klinicznych leku Herceptin™. Wyniki wykazały 79-procentową zgodność między wynikami obu
testów wykonanych na tych próbkach tkankowych.
Ponadto dane zgodności wskazują, Ŝe odczyt 3+ przy uŜyciu HercepTest™ z wysokim
prawdopodobieństwem odpowiadał dodatniemu odczytowi za pomocą CTA, co stanowiło
spełnienie kryteriów włączenia do badania (2+ lub 3+). Wyniki 2+ w teście HercepTest™ nie były
równie dobrze skorelowane z wynikami testu badawczego. Około 42% (53/126) wyników w teście
HercepTest™ 2+ odpowiadało ujemnym wynikom testu badawczego (0–1+), które nie spełniają
kryteriów włączenia do badań klinicznych leku Herceptin™.
Wynik testu HercepTest™ w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2 interpretuje się jako
ujemny (odczyn o intensywności 0 i 1+), słabo dodatni (intensywność odczynu 2+) albo silnie
dodatni (intensywność odczynu 3+). Pacjenci ani lekarze nie powinni wykorzystywać wyników
testu HercepTest™ jako podstawy do prognoz; test HercepTest™ nie został zatwierdzony do
takich zastosowań.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 5/56
Rak sutka
Zasada testu - sutek
Test HercepTest™ zawiera odczynniki konieczne do wykonania dwuetapowej procedury barwienia
immunocytochemicznego dla rutynowo przygotowanych próbek zanurzonych w parafinie.
W omawianym zestawie po zakończeniu inkubacji pierwotnych przeciwciał króliczych z ludzkim
białkiem HER2 następuje reakcja z gotowym barwnym odczynnikiem Visualization Reagent
produkowanym w oparciu o technologię stosowaną do wytwarzania dekstranu. W skład
odczynnika wchodzą cząsteczki wtórnych przeciwciał kozich skierowanych przeciw
immunoglobulinom króliczym oraz cząsteczki peroksydazy chrzanowej połączone ze wspólnym
szkieletem polimerowym dekstranu. W ten sposób wyeliminowano konieczność sekwencyjnego
stosowania przeciwciała wtórnego i koniugatu peroksydazy. Reakcję krzyŜową odczynnika
Visualization Reagent z immunoglobulinami ludzkimi i płodową surowicą cielęcą wyeliminowano
poprzez absorpcję w fazie stałej. Po dodaniu chromogenu następuje reakcja enzymatyczna, której
efektem jest widoczny produkt, zlokalizowany w miejscu występowania antygenu. Następnie
moŜna wykonać barwienie kontrastowe i nakryć preparat szkiełkiem nakrywkowym. Wynik reakcji
ocenia się w mikroskopii świetlnej. Zestaw zawiera szkiełka kontrolne zawierające trzy utrwalone w
formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka, dające odczyny o nasileniu
odpowiednio 0, 1+ i 3+. SłuŜą one do weryfikacji serii odczynów. Nasilenie odczynu tych linii
komórkowych jest skorelowane z liczbą receptorów przypadających na komórkę.
Test HercepTest™ Nr kat. K5204 jest odpowiedni zarówno dla testów barwienia wykonywanych
ręcznie jak i na automatach przy uŜyciu Autostainera.
Odczynniki - sutek
Dostarczane materiały
Wyszczególnione poniŜej materiały wystarczają na wykonanie 35 testów (35 szkiełek mikroskopowych
inkubowanych z odczynnikiem przeciwciałem pierwotnym przeciwko białku HER2 oraz 35 szkiełek
inkubowanych z odpowiednim odczynnikiem do kontroli ujemnej). Liczba testów opiera się na
zastosowaniu 3 kropli (100 µL) na sekcje tkanki fiolek z numerem 1, 2, 3 i 4 oraz roztworu
Substrate-Chromogen Solution (DAB). Materiał znajdujący się w zestawie wystarcza na wykonanie
co najwyŜej 5 pojedynczych serii oznaczeń.
Fiolka nr
Ilość
1
1 x 7 mL
Opis
Peroxidase-Blocking Reagent: 3% roztwór nadtlenku wodoru z
dodatkiem azydku sodu (NaN3) w stęŜeniu 15 mmol/L.
2
1 x 3,5 mL
Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Gotowe do uŜycia przeciwciała
wyizolowane ze względu na powinowactwo. Dostarczany w buforze
Tris/HCl 0,05 mol/L, NaCl 0,1 mol/L, NaN3 15 mmol/L, pH 7,2, z
dodatkiem białka stabilizującego.
Immunogen: syntetyczny fragment C-końcowy (część
wewnątrzcytoplazmatyczna) białka HER2 sprzęŜony z KLH
(Keyhole Limpet Hemocyanin).
Swoistość: białko HER2.
Metoda oczyszczania: przeciwciała są izolowane ze względu na
powinowactwo przy uŜyciu immobilizowanego peptydu białka HER2.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 6/56
Rak sutka
3
1 x 7 mL
Visualization Reagent: Polimer dekstranowy skoniugowany z
peroksydazą chrzanową oraz przeciwciała kozie izolowane ze
względu na powinowactwo, skierowane przeciw antygenom
króliczym. Dostarczany w buforze Tris/HCl zawierającym białko
stabilizujące i środek przeciwbakteryjny.
4
1 x 3,5 mL
Negative Control Reagent: Frakcja immunoglobulinowa prawidłowej
surowicy króliczej rozcieńczona do takiego samego stęŜenia białek,
jak przeciwciało przeciwko białku HER2. Dostarczany w buforze
Tris/HCl 0,05 mol/L, NaCl 0,1 mol/L, NaN3 15 mmol/L, pH 7,2, z
dodatkiem białka stabilizującego.
5
1 x 10 mL
DAB Buffered Substrate: Roztwór buforowy substratu, pH 7,5,
zawierający roztwór nadtlenku wodoru o stęŜeniu < 0,1 %,
substancje stabilizujące, substancje wzbogacające i środek
przeciwbakteryjny.
6
1 x 0,5 mL
DAB Chromogen: Roztwór tetracholorowodorku
3,3’-diaminobenzydyny o stęŜeniu 5% w roztworze chromogenu
7
1 x 500 mL
Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): Roztwór
cytrynianowy o stęŜeniu 0,1 mol/L z dodatkiem środka
przeciwbakteryjnego.
8
1 x 250 mL
Wash Buffer (10x): Bufor Tris/HCl z detergentem i środkiem
przeciwbakteryjnym.
5 szkiełek
Szkiełka kontrolne: KaŜdy preparat zawiera skrawki trzech
utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie linii komórkowych
raka sutka wykazujących róŜne poziomy ekspresji białka HER2:
MDA-231 (0), MDA-175 (1+) i SK-BR-3 (3+). Preparaty do kontroli
jakości zostały poddane obróbce cieplnej w celu uzyskania lepszego
przylegania skrawków do szkiełek. Jakakolwiek dodatkowa obróbka
cieplna preparatów do kontroli jakości przeprowadzona w celu
poprawy przylegania skrawków do szkiełek moŜe negatywnie
wpłynąć na wyniki odczynu.
UWAGA: Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały
przygotowane specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z
instrukcją nie naleŜy uŜywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, zamiast którego
moŜna uŜyć Dako Nr kat. S3006.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 7/56
Rak sutka
Materiały wymagane, lecz niedostarczone
Waciki
Wodorotlenek amonu, 15 mol/L rozcieńczony do 37 mmol/L
Barwnik kontrastowy: Hematoksylina, taka jak rozcieńczana wodą Mayer's Hematoxylin,
Dako Nr kat. S3301 (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, A.4)
Szkiełka nakrywkowe
Marker, taki jak Dako Pen, Nr kat. S2002
Woda destylowana lub dejonizowana (Washing Water)
Suszarka umoŜliwiająca utrzymanie temperatury 60°C lub niŜszej
Etanol absolutny i roztwór o stęŜeniu 95%
Komora wilgotna (opcjonalna)
Mikroskop optyczny (powiększenie obiektywu 4–40x)
Środek do montowania, taki jak Dako Faramount, Nr kat. S3025 lub Glycergel™ Nr kat. C0563
Tkanki o dodatnim i ujemnym odczynie, do stosowania w charakterze próby kontrolnej
(zobacz część Kontrola jakości)
Szkiełka, SuperFrost Plus, szkiełka opłaszczone poli-L-lizyną lub silanizowane szkiełka
Dako Silanized Slides Nr kat. S3003 (zobacz Przygotowanie próbek)
Słoje lub łaźnie barwiące
Stoper (odpowiedni do wyznaczenia 2–40-minutowych okresów)
Tryskawki
Łaźnia wodna z przykrywką (odpowiednia do utrzymywania temperatury
Epitope Retrieval Solution 95–99 °C)
Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu
Przechowywanie - sutek
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C.
Nie uŜywać zestawu po dacie waŜności ostemplowanej na zewnętrznej stronie opakowania. JeŜeli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na wkładce informacyjnej do
opakowania, UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość (14a,14b). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe
równieŜ preparaty do kontroli jakości powinny być przechowywane w temperaturze 2–8 °C.
Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego teŜ naleŜy
wykonywać Kontrole Dodatnie i Ujemne jednocześnie z badaniem próbki pacjentki. Jeśli
zauwaŜone zostanie nieoczekiwane zabarwienie, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w
procedurach laboratoryjnych i podejrzewa się, Ŝe przyczyną moŜe być HercepTest™, naleŜy
niezwłocznie skontaktować się z serwisem technicznym firmy Dako.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 8/56
Rak sutka
Przygotowanie próbek - sutek
Materiał biopsyjny naleŜy traktować tak, by zachować materiał tkankowy do wykonania odczynów
immunocytochemicznych. Do wszystkich preparatów naleŜy stosować standardowe metody
przeprowadzania tkanek (15).
Skrawki zatapiane w parafinie
Testu moŜna uŜywać do tkanek konserwowanych w obojętnym roztworze buforowanej formaliny
lub płynie Bouina, poddanych standardowej obróbce i zatopionych w parafinie. Na przykład
materiał biopsyjny naleŜy pociąć na bloczki o grubości 3 lub 4 mm i utrwalać przez 18–24 godzin
w obojętnym roztworze buforowanej formaliny. Następnie tkanki zostają odwodnione w szeregu
alkoholi i w ksylenie, a następnie przesiąknięte stopioną parafiną utrzymywaną w temperaturze nie
wyŜszej niŜ 60 °C. Prawidłowo utrwalone i zatopione tkanki z e kspresją białka HER2 mogą być
przechowywane przez nieograniczony czas przed podzieleniem na skrawki i zamontowaniem na
szkiełka, pod warunkiem, Ŝe są przechowywane w chłodnym miejscu (15–25 °C) (15, 1 6).
W Stanach Zjednoczonych dokument Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (Zmiany w
zasadach postępowania w laboratoriach klinicznych, 42 CFR 493.1259(b)) „nakłada na
uŜytkowników wymóg przechowywania wybarwionych szkiełek przez co najmniej 10 lat od daty
badania i zachowania bloczków próbek przez co najmniej dwa lata od daty badania” (16).
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach 4–5 µm, zatopić w szkiełkach i suszyć
na powietrzu w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin (lub do wysuszenia) albo w
temperaturze 37 °C przez cał ą noc lub w temperaturze 60 °C w ci ągu jednej godziny.
PRZESTROGA: Nadmierne ogrzewanie przez ponad jedną godzinę w temperaturze ≥60°C
moŜe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2 związanej z odczynem
błonowym (17).
Aby zachować antygenowość, skrawki tkankowe zatopione na szkiełkach (SuperFrost Plus,
Poly-L-lysine lub szkiełka silanizowane) powinny zostać poddane barwieniu w ciągu 4–6 tygodni
od sporządzenia skrawków, o ile skrawki były przechowywane w temperaturze pokojowej
(20–25 °C) (18). Szkiełka wymagane do oceny białka HER2 i zweryfikowania obecności guza
naleŜy przygotować w tym samym czasie. Zaleca się minimum 5 szkiełek, 1 szkiełko dla obecności
guza, 2 szkiełka dla oceny białka HER2 (1 dla inkubacji z fiolką nr 2 i 1 dla inkubacji z fiolką nr 4)
oraz 2 szkiełka zapasowe.
Zastosowanie HercepTest™ na tkankach odwapnionych nie zostało zatwierdzone i nie
jest zalecane.
Szczegółowe informacje dotyczące przygotowywania próbek przedstawiono w podręczniku
Dako „Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods” (19), a takŜe odsyłacze 15 i 16.
Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu
Dla uzyskania optymalnych wyników testu naleŜy zastosować specyficzną metodę odzyskiwania
epitopu, polegającą na gotowaniu w 10 mmol/L buforu cytrynianowego. Roztwór do odmaskowania
antygenu wchodzi w skład zestawu HercepTest™. Metoda obejmuje podgrzewanie skrawków
tkanek zamontowanych na szkiełkach, które zostają zanurzone w buforze cytrynianowym
10 mmol/L (20) w skalibrowanej łaźni wodnej utrzymującej Epitope Retrieval Solution w
wymaganej temperaturze (95–99 °C). Laboratoria znaj dujące się na duŜych wysokościach powinny
określić najlepszą metodę utrzymania wymaganej temperatury łaźni wodnej. Odzyskanie epitopu
musi zostać wykonane w łaźni wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one
odtwarzalnych wyników. Niezwłocznie po odzyskaniu epitopu naleŜy rozpocząć procedurę
barwienia. Odstępstwa od opisywanej procedury mogą mieć wpływ na wyniki.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 9/56
Rak sutka
Środki ostroŜności - sutek
1.
2.
Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
3. Fiolka 1, Peroxidase-Blocking Reagent, zawiera 3% nadtlenek wodoru. Karta charakterystyki
substancji niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie.
4. Fiolka 6, DAB Chromogen, zawiera ≥5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium
tetrachloride (czterochlorek dwufenylo-3,3’, 4,4’-tetryloczteroamonowego) i jest oznaczony:
Niebezpieczeństwo
MoŜe powodować raka.
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę
twarzy. Stosować odzieŜ ochronną.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zasięgnąć porady/zgłosić
się pod opiekę lekarza.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi,
krajowymi i międzynarodowymi przepisami.
Za ogólną regułę naleŜy przyjąć, Ŝe osoby poniŜej 18 lat nie mogą pracować z tym produktem.
NaleŜy poinformować uŜytkowników testu o prawidłowej procedurze pracy, niebezpiecznych
własnościach produktu oraz o niezbędnych instrukcjach BHP. Dodatkowe informacje znajdują
się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa (SDS).
H350
H341
P201
P280
5. Fiolka 8, Wash Buffer, zawiera ≥5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol
hydrochloride i ≥0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. MoŜe wywoływać reakcje alergiczne.
Produkt Wash Buffer (10x) jest oznaczony:
Uwaga
H319
P280
P264
P305 + P351 + P338
Działa draŜniąco na oczy.
Stosować ochronę oczu lub twarzy.
Dokładnie umyć ręce po uŜyciu.
W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą
przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŜeli są i moŜna je
łatwo usunąć. Nadal płukać.
6. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci.
StęŜenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w
wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych,
mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby
zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji (21, 22).
7. Fiolki 2, 3 i 4 zawierają materiał pochodzenia zwierzęcego. Podobnie jak w przypadku
kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować odpowiednie
procedury postępowania.
8. Preparaty kontrolne i próbki (przed i po utrwaleniu) oraz wszystkie przyrządy i materiały mające
z nimi kontakt, powinny być traktowane jako mogące przenosić zakaŜenia i likwidowane z
zachowaniem odpowiednich środków ostroŜności (23). Nigdy nie pipetować odczynników
ustami i unikać naraŜania skóry i błon śluzowych na kontakt z odczynnikami i próbkami. W
razie kontaktu odczynników z wraŜliwymi okolicami skóry naleŜy je spłukać obfitą ilością wody.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 10/56
Rak sutka
9. Zminimalizować skaŜenie mikrobiologiczne odczynników, aby uniknąć nieswoistego barwienia.
10. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasów inkubacji, temperatur lub metod moŜe
powodować błędne wyniki badania. Nadmierne suszenie w temperaturze ≥60 °C przez ponad
jedną godzinę moŜe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2
związanej z odczynem błonowym (17).
11. Dostarczone odczynniki mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŜe
powodować utratę odczynu antygenów.
12. Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały przygotowane
specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z instrukcją nie
naleŜy uŜywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, posiadającego Nr kat. S3006.
13. Wystawienie Visualization Reagent i DAB Chromogenu na działanie silnego światła moŜe mieć
na nie niekorzystny wpływ. Nie naleŜy przechowywać składników systemu ani wykonywać
barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne.
14. Aby uniknąć kontaktu z oczami i skórą, naleŜy uŜywać odpowiedniego osobistego wyposaŜenia
ochronnego. Dodatkowe informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa
(SDS).
15. Pozostałości parafiny mogą być przyczyną wyników fałszywie ujemnych.
16. UŜycie objętości odczynnika innych niŜ zalecane moŜe doprowadzić do widocznej utraty
immunoreaktywności HER2. JeŜeli obwiedziony skrawek tkanki nie zostanie pokryty 3 kroplami
(100 µL) odczynnika, naleŜy dodać kolejne 3 krople.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 11/56
Rak sutka
SPOSÓB UśYTKOWANIA - sutek
A. Przygotowanie odczynników
Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia:
A.1 Epitope Retrieval Solution
Dla planowanej procedury barwienia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 7 (Epitope Retrieval
Solution 10x) w stosunku 1:10 uŜywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany
rozcieńczony roztwór moŜna przechowywać w temperaturze 2–8 °C przez jeden miesi ąc.
W przypadku zmętnienia rozcieńczony roztwór nie nadaje się do uŜycia.
A.2 Bufor płuczący
Dla etapów przemycia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 8 (Wash Buffer 10x) w stosunku 1:10
uŜywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany rozcieńczony bufor moŜna
przechowywać w temperaturze 2–8 °C przez jeden miesi ąc. W przypadku zmętnienia bufor nie
nadaje się do uŜycia.
Wodę destylowaną lub dejonizowaną moŜna uŜyć do płukania po odczynniku Peroxidase-Blocking
Reagent, Substrate-Chromogen Solution i inkubacji hematoksykliny.
Wszystkie pozostałe etapy wymagają uŜycia Wash Buffer.
A.3 Roztwór substrat-chromogen (DAB)
Następująca procedura daje 1 mL roztworu Substrate-Chromogen Solution. KaŜdy 1 mL
jednakowej objętości roztworu jest wystarczający dla dziesięciu skrawków tkanek.
Etap 1:
Etap 2:
Przenieść do probówki 1 mL zbuforowanego substratu DAB z fiolki 5.
Dodać jedną kroplę (25–30 µL) Chromogenu DAB z fiolki 6.
Wymieszać i nałoŜyć na skrawki tkanek za pomocą pipety.
Przygotowany Substrate-Chromogen Solution (DAB) jest stabilny przez około 5 dni, jeśli jest
przechowywany w temperaturze 2–8 °C. Przed u Ŝyciem roztwór naleŜy dokładnie wymieszać.
Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu.
UWAGA: DAB Chromogen w fiolce 6 moŜe przyjmować barwę od przezroczystej po lawendowobrązową. Nie ma to wpływu na działanie produktu. NaleŜy go rozcieńczyć zgodnie ze
wskazówkami podanymi w niniejszej ulotce. Dodanie nadmiernej ilości roztworu DAB Chromogen
do buforu DAB Buffered Substrate spowoduje pogorszenie jakości odczynu dodatniego.
A.4 Barwienie kontrastowe
Barwny produkt końcowy reakcji barwienia chromogenem DAB jest nierozpuszczalny w alkoholu i
wodzie. Zastosować barwienie negatywne hematoksyliną i dopasować intensywność barwienia
hematoksyliny do podobnego poziomu pokazanego w atlasie „HercepTest™ Interpretation Manual –
Breast Cancer” (Atlas interpretacji odczynów HercepTest™ - rak sutka). MoŜna uŜyć hematoksylinę
rozcieńczoną alkoholem lub wodą, taką jak Dako Mayer's Hematoxylin Nr kat. S3301. Po barwieniu
negatywnym hematoksyliną wykonać dokładne płukanie w wodzie destylowanej lub dejonizowanej,
następnie zanurzyć szkiełka z tkankami w wodzie amoniakalnej o stęŜeniu 37 mmol/L (zobacz
Część B.2, etap 6). Woda amoniakalna (37 mmol/L) jest przygotowana przez zmieszanie 2,5 mL
15 mol/L (stęŜonego) wodorotlenku amonowego z 1 litrem wody destylowanej lub dejonizowanej.
Niewykorzystana woda amoniakalna o stęŜeniu 37 mmol/L moŜe być przechowywana w
temperaturze pokojowej (20–25 °C) w szczelnie zamkn iętej butelce do 12 miesięcy.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 12/56
Rak sutka
A.5 Środek do zatapiania
Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest jednak
równieŜ zatapianie wodne. Do montowania wodnego zaleca się Dako Faramount Aqueous
Mounting Medium, gotowe do uŜycia, Nr kat. S3025 lub Glycergel™ Mounting Medium Nr
kat. C0563. Doprowadzić Glycergel™ do postaci płynnej przez podgrzewanie do około 40 (±5) °C
przed uŜyciem.
B. Procedura barwienia
B.1 Uwagi dotyczące procedury
Przed uŜyciem naleŜy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się ze wszystkimi
składnikami (patrz Środki ostroŜności).
Przed immunobarwieniem wszystkie odczynniki naleŜy doprowadzić do temperatury pokojowej
(20–25 °C). Podobnie, wszystkie inkubacje nale Ŝy przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas procedury barwienia. Wysuszone skrawki
tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. Zakryć szkiełka wystawione na działanie
przeciągów. Jeśli stosowane są wydłuŜone inkubacje umieścić tkanki w wilgotnym środowisku.
Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po inkubacji pierwszego przeciwciała
(etap 3) szkiełka moŜna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny, w temperaturze
pokojowej (20–25 °C) bez wpływu na jako ść barwienia.
Usunięcie parafiny i ponowne uwodnienie: Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŜy
odparafinować preparaty w celu usunięcia środka zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy
unikać niecałkowitego usunięcia parafiny. Pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie
odczynu nieswoistego. Ten etap powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
1.
Umieścić szkiełka w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i
jednokrotnie powtórzyć procedurę.
2.
Postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar płynu i umieścić je w bezwodnym etanolu na
3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę.
3.
Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić szkiełka w 95% etanolu na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i
4.
Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w destylowanej lub dejonizowanej wodzie na
minimum 30 sekund. Rozpocząć procedurę barwienia zgodnie z instrukcją podana w Części
B 2, etap 1, Odzyskanie epitopu.
Po wykonaniu barwienia 40 preparatów naleŜy zmienić roztwór ksylenu i alkoholu. Zamiast ksylenu
moŜna stosować zamienniki toluenu lub ksylenu np. Histoclear.
UWAGA: Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania
optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub
temperatury inkubacji moŜe spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. RóŜnice
w metodach przetwarzania tkanek oraz procedurach technicznych stosowanych w laboratorium
uŜytkownika mogą spowodować, Ŝe wyniki testu nie będą waŜną podstawą wyboru pacjentów do
terapii lekiem Herceptin™.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 13/56
Rak sutka
B.2 Wykonanie odczynu
Wykonana w temperaturze pokojowej, 20–25 °C.
Etap 1: Odmaskowanie antygenu
Pojemniki do barwienia, np. naczynka Coplina, napełnić rozcieńczonym Epitope Retrieval
Solution (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.1). Naczynia do barwienia zawierające
Epitope Retrieval Solution umieścić w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i Epitope Retrieval
Solution do 95–99 °C. Po ogrzaniu roztworu Epitope Retrieval Solution pojawia się zmętnienie.
Zakryć naczynia wieczkami, aby zapewnić stabilną temperaturę i uniknąć parowania.
Zanurzyć pozbawione parafiny skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym roztworze
odzyskiwania epitopu w naczyniach do barwienia. PONOWNIE DOPROWADZIĆ
TEMPERATURĘ ŁAŹNI WODNEJ I EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION DO 95–99 °C.
Inkubować w temperaturze 95–99 °C przez 40 (±1) minut.
Wyjąć całe naczynie ze szkiełkami z łaźni wodnej. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w
Epitope Retrieval Solution na 20 (±1) minut w temperaturze pokojowej.
Zdekantować roztwór Epitope Retrieval Solution i wypłukać skrawki w rozcieńczonym
buforze Wash Buffer (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.2).
Dla uzyskania optymalnych wyników po odzyskaniu epitopu i przed barwieniem naleŜy
nasączyć skrawki w Wash Buffer przez 5–20 minut.
UWAGA: Roztwór Epitope Retrieval Solution jest przeznaczony do jednokrotnego
stosowania. Nie uŜywać ponownie.
Etap 2: Peroxidase-Blocking Reagent:
Strząsnąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. Kimwipe lub płatka
gazy) ostroŜnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz
utrzymania odczynników w określonym miejscu. Za pomocą Dako Pen obwieść skrawek
tkanki.
NałoŜyć 3 krople (100 µL) odczynnika Peroxidase-Blocking Reagent dla zakrycia próbki.
Inkubować przez 5 (±1) minut.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną lub buforem Wash Buffer
z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŜej
kąpieli buforu.
Etap 3: Primary Antibody lub Negative Control Reagent
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano
poprzednio.
Pokryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µL) białka Anti-HER2 Protein lub odczynnika
Negative Control Reagent.
Delikatnie przepłukać buforem Wash Buffer z tryskawki (nie kierować strumienia
bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŜej kąpieli buforu.
Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po wykonaniu etapu 3
szkiełka moŜna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny w temperaturze
pokojowej (20–25 °C), bez wpływu na wykonanie barwi enia.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 14/56
Rak sutka
Etap 4: Visualization Reagent
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je
jak wskazano poprzednio.
Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µL) odczynnika Visualization Reagent.
Wypłukać szkiełka jak polecono w etapie 3.
Etap 5: Roztwór substrat-chromogen (DAB)
Wytrzeć szkiełka jak polecono wcześniej.
Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µL) roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB).
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną z butelki przemycia
(nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę). Zebrać odpady roztworu
Substrate-Chromogen Solution (DAB) do pojemnika na odpady skaŜone w celu
właściwego ich usunięcia.
Etap 6: Barwienie negatywne (instrukcje podano dla hematoksyliny)
Zanurz szkiełka w hematoksylinie. Inkubuj przez 2–5 minut, zaleŜnie od stęŜenia
zastosowanej hematoksyliny.
Delikatnie przepłukaj wodą destylowaną lub dejonizowaną. Upewnij się, Ŝe pozostałości
hematoksyliny zostały usunięte.
Opcjonalnie: Zanurz szkiełka 10 razy w wodzie amoniakalnej o stęŜeniu 37 mmol/L
(zobacz Część A.4).
Delikatnie przepłukaj szkiełka wodą destylowaną lub dejonizowaną przez 2–5 minut.
UWAGA: ZaleŜnie od czasu trwania inkubacji oraz stęŜenia uŜytej hematoksyliny
barwienie negatywne spowoduje zabarwienie jądra komórkowego od jasno do
ciemnoniebieskiego. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŜe utrudniać
prawidłową interpretację wyników.
Etap 7: Zatapianie preparatu
Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest
jednak równieŜ zatapianie wodne. Próbki moŜna montować i zakrywać szkiełkiem
nakrywkowym przy uŜyciu środka do montowania takiego, jak Dako Faramount Nr kat.
S3025 lub Glycergel™ Nr kat. C0563.
UWAGA: Odczyt odczynu moŜna przeprowadzić w dogodnym dla uŜytkownika
momencie. Jednak, jeŜeli do nakrywania zastosowano wodny środek do zatapiania,
ekspozycja na silne światło przez okres jednego tygodnia moŜe powodować zblaknięcie.
Aby ograniczyć blaknięcie, naleŜy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu,
w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 15/56
Rak sutka
Kontrola jakości - sutek
Stosowanie w laboratorium UŜytkownika innych metod utrwalania, przeprowadzania i zatapiania
tkanek moŜe spowodować istotne róŜnice wyników, wymagające regularnego wykonywania
dodatkowej wewnętrznej kontroli jakości, niezaleŜnie od standardowych załączonych preparatów
kontroli jakości Dako. W przypadku testów wykonywanych na terenie Stanów Zjednoczonych
naleŜy sprawdzić wskazówki dotyczące kontroli jakości zawarte w Programie Certyfikacji dla
Immunochemii College of American Pathologists (CAP), ponadto w celu uzyskania dalszych
informacji naleŜy sprawdzić Zapewnienie Jakości dla Badań Immunochemicznych, Zatwierdzone
Wskazówki CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for Immunochemistry, Approved Guideline
(24) oraz odsyłacz (25).
Tabela 1. Cel codziennej kontroli jakości
Rodzaj tkanki: utrwalona i
przeprowadzona identycznie jak
próbki pochodzące od pacjenta
Swoiste przeciwciało i drugie
przeciwciało
Nieswoiste przeciwciało* lub Buffer
Plus takie samo przeciwciało jak uŜyte
ze swoistym przeciwciałem
Kontrola dodatnia:
Tkanki lub komórki zawierające antygen
docelowy (mogą występować w tkankach
pacjenta). Idealna próba kontrolna jest
tkanką wykazującą słabo dodatni odczyn
i moŜliwie największą czułość na utratę
właściwości przez przeciwciała lub
antygeny.
Kontrola wszystkich etapów badania.
Weryfikacja odczynnika i procedur
stosowanych do odczynu białka HER2.
Detekcja nieswoistego odczynu tła.
Kontrola ujemna:
Tkanki lub komórki z oczekiwanym
ujemnym wynikiem odczynu (mogą
występować w tkankach pacjenta lub
dodatniej kontroli tkankowej).
Detekcja niepoŜądanej reakcji krzyŜowej
przeciwciał z komórkami lub strukturami
komórkowymi.
Tkanka pochodząca od pacjenta.
Detekcja odczynu swoistego.
Preparat kontrolny dostarczony
przez Dako.
Wyłącznie odczyn z preparatami
kontrolnymi.
* Surowica tego samego gatunku, co swoiste przeciwciało, ale nie skierowana przeciwko temu samemu antygenowi docelowemu.
SłuŜy do wykrywania nieswoistego wiązania przeciwciał, tzn. wiązania fragmentu Fc przeciwciała przez tkankę.
Preparat kontrolny (w zestawie): KaŜdy z dostarczonych preparatów kontrolnych zawiera trzy
odwirowane, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka,
dające odczyny o nasileniu 0, 1+ i 3+. W kaŜdej serii naleŜy wykonać odczyn tylko na jednym
preparacie kontrolnym. Ocena linii komórkowych preparatów kontrolnych dostarczonych przez
Dako pozwala ustalić waŜność serii odczynów.
Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Preparaty kontrolne naleŜy sporządzić ze świeŜych
materiałów sekcyjnych, biopsyjnych lub chirurgicznych, moŜliwie szybko utrwalonych i zatopionych
w sposób analogiczny do próbki (próbek) pochodzących od pacjenta. Wynik dodatniej kontroli
potwierdza właściwe przygotowanie tkanek i prawidłową technikę barwienia. Dla wszystkich
serii odczynów i dla kaŜdego rodzaju warunków badania naleŜy uwzględnić jedną dodatnią
kontrolę tkankową.
Tkanki stosowane jako dodatnie próby kontrolne powinny dawać słaby odczyn dodatni, pozwalający
na wykrywanie niewielkich zmian czułości przeciwciał pierwotnych. Preparaty kontrolne dostarczane
z opisywanym zestawem lub preparaty przeprowadzane w sposób odmienny od próbek
pochodzących od pacjenta pozwalają wyłącznie na weryfikację działania odczynników; preparaty
kontrolne nie nadają się do weryfikacji prawidłowego przygotowania tkanek. Dla najlepszej dodatniej
kontroli tkankowej naleŜy zastosować tkankę z uprzednio oznaczoną nadekspresją inwazyjnego
(naciekającego) ludzkiego raka sutka z obecnością białka 2+ HER2.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 16/56
Rak sutka
UWAGA: Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu
monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a NIE pomocniczo do
formułowania swoistych rozpoznań próbek pochodzących od pacjentów. JeŜeli nie udaje się
potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach dodatnich kontroli tkankowych naleŜy uznać,
Ŝe wyniki preparatów pochodzących od pacjentów są niewaŜne.
Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: NaleŜy stosować ujemną kontrolę za pomocą tkanki
dającej odczyn ujemny, w której nie występują białka HER2. Dla kaŜdej serii odczynów tkanka
powinna zostać utrwalona, przeprowadzona i poddana zatapianiu w sposób identyczny do próbki
(próbek) pochodzącej od pacjenta, w celu weryfikacji swoistości przeciwciał pierwotnych i
identyfikacji swoistego odczynu tła. Tkankami odpowiednimi do ujemnej próby kontrolnej są tkanki
okręŜnicy, wątroby lub tarczycy. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŜna
wykorzystywać róŜne rodzaje komórek pochodzące z większości tkanek. Preparaty do kontroli
ujemnej powinny zostać zweryfikowane przez UŜytkownika. W charakterze wewnętrznej kontroli
ujemnej moŜna stosować prawidłowe tkanki przewodów sutkowych.
Jeśli tkanka do ujemnej próby kontrolnej lub wewnętrznej kontroli ujemnej daje odczyn swoisty,
wyniki dla próbek pochodzących od pacjentów naleŜy uznać za niewaŜne, a test naleŜy powtórzyć.
Nieswoisty odczynnik Negative Control Reagent: W celu oceny występowania odczynu
nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach występowania antygenów,
dla kaŜdego wycinka pochodzącego od pacjenta, w miejsce przeciwciał pierwotnych naleŜy
stosować odczynnik do kontroli ujemnej. Czas inkubacji odczynnika Negative Control Reagent
powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych.
Weryfikacja testu: Przed pierwszym uŜyciem przeciwciała lub systemu barwienia w procedurze
diagnostycznej, uŜytkownik powinien sprawdzić swoistość przeciwciała testując go na serii
posiadanych w laboratorium komórek o znanej charakterystyce działania immunocytochemicznego,
stanowiących tkanki kontroli dodatniej i ujemnej. NaleŜy zapoznać się z procedurami kontroli jakości
omówionymi wcześniej w tej sekcji ulotki oraz z wymaganiami określonymi w dokumentach CAP
Certification Program for Immunohistochemistry oraz CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for
Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). PowyŜsze procedury kontroli jakości naleŜy
powtarzać z kaŜdą nową partią przeciwciał i za kaŜdym razem, gdy wystąpi zmiana w parametrach
odczynu. Do weryfikacji testu odpowiednie są tkanki raka sutka o znanej intensywności barwienia
białka HER2 od 0 - 3+ oraz tkanki ujemne, np. z okręŜnicy, wątroby lub tarczycy.
Interpretacja wyniku barwienia - sutek
Wykrywanie nadmiernej ekspresji białka HER2 powinno odbywać się wyłącznie w oparciu o
nasilenie odczynu błonowego, który naleŜy oceniać na podstawie skali przedstawionej w Tabeli 2.
Oceny preparatów powinien dokonywać patolog, posługując się mikroskopem świetlnym. W celu
oceny obecności i nasilenia odczynu immunocytochemicznego naleŜy stosować obiektyw o
powiększeniu 10x. Zastosowanie obiektywu o powiększeniu 20–40x jest korzystne dla
potwierdzenia wyniku. Odczyn cytoplazmatyczny naleŜy uznać za nieswoisty i nie naleŜy go brać
pod uwagę przy ocenie nasilenia odczynu błonowego (8). W rozróŜnianiu poziomów nasilenia 0,
1+, 2+ i 3+ pomocny jest wydany przez firmę Dako atlas „HercepTest™ Interpretation Manual –
Breast Cancer” (Atlas interpretacji odczynów HercepTest™ - rak sutka), który zawiera obrazy
typowych wyników barwienia o róŜnej intensywności.
Oceniać naleŜy wyłącznie próbki pochodzące od chorych, u których występuje inwazyjny rak
sutka. Jeśli w próbce występują jednocześnie komórki raka in situ oraz inwazyjnego, naleŜy
oceniać wyłącznie składnik inwazyjny.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 17/56
Rak sutka
Tabela 2. Kryteria oceny intensywności barwienia błony komórkowej
Wynik
Białko HER2
Ocena
nadmiernej ekspresji
(przekazywany lekarzowi
prowadzącemu leczenie)
(przekazywany lekarzowi
prowadzącemu leczenie)
Wzór barwienia
Brak odczynu lub odczyn błonowy w mniej niŜ
10% komórek nowotworu.
0
Ujemny
1+
Ujemny
Słaby/umiarkowany odczyn błonowy (na całych błonach) w więcej
niŜ 10% komórek nowotworu.
2+
Słabo dodatni
Silny odczyn błonowy (na całych błonach) w więcej niŜ 10%
komórek nowotworu.
3+
Silnie dodatni
Blady, ledwie rozpoznawalny odczyn błonowy w więcej niŜ 10%
komórek nowotworu. Wybarwione są tylko fragmenty błon
poszczególnych komórek.
ujemny (odczyn o intensywności 0 i 1+), słabo dodatni (intensywność odczynu 2+) albo silnie
dodatni (intensywność odczynu 3+). Pacjenci ani lekarze nie powinni wykorzystywać wyników
testu HercepTest™ jako podstawy do prognoz; test HercepTest™ nie został zatwierdzony do
takich zastosowań.
W kaŜdej serii preparaty naleŜy badać w kolejności podanej w Tabeli 3, co pozwoli na określenie
waŜności wyników z danej serii oraz półilościową ocenę nasilenia odczynu próbki tkankowej.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 18/56
Rak sutka
Tabela 3. Kolejność oceny szkiełek.
Kolejność odczytu preparatów
1.
Preparat kontrolny zawierający trzy linie komórkowe.
Uzasadnienie
Obecność 3+ brązowego zabarwienia błony komórkowej
(zabarwienie obwódkowe, rimming) w linii komórek
kontrolnych 3+ SK-BR-3, częściowe brązowe zabarwienie
obwódkowe w linii komórek kontrolnych 1+ MDA-175 oraz
brak zabarwienia w linii komórek kontrolnych 0 MDA-231
wskazuje, Ŝe test jest waŜny
Punktowe i nieciągłe wybarwienie nastąpiło w małej do
umiarkowanej liczbie komórek słabo dodatnich 1+ linii
komórek kontrolnych MDA-175. Ponadto w tej linii komórek
moŜna zaobserwować punktowe immunobarwienie ciałek
Golgiego cytoplazmy.
Obecność brązowego odczynu w kontrolnej linii komórkowej
0 MDA-231 (ujemnej w kierunku nadmiernej ekspresji białka
HER2) wskazuje na wystąpienie nieswoistego odczynu.
Wyniki testu mogą być niewaŜne w związku z
nadmiernym wybarwieniem.
2.
Preparat z tkanki do dodatniej próby kontrolnej.
Powinien być widoczny brązowy odczyn błonowy.
Wybarwienie cytoplazmy i tkanki ujemnej nie
powinno przekraczać 1+
3.
Preparat tkankowy do ujemnej próby kontrolnej.
BRAK odczynu swoistego w preparacie tkankowym do
kontroli ujemnej potwierdza brak reaktywności krzyŜowej
przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. Jeśli pojawi
się swoiste barwienie na Szkiełku Tkanki Kontroli Ujemnej,
wówczas wyniki próbki pacjentki naleŜy uwaŜać za niewaŜne.
4. Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany
działaniu odczynnika Negative Control Reagent
Brak swoistego wybarwienia błony weryfikuje
swoistość znakowania docelowego antygenu przez
pierwsze przeciwciało.
Inne jasnobrązowe lub brązowe zabarwienie występujące w
cytoplazmie próbki poddanej działaniu odczynnika kontroli
ujemnej, np. w tkance łącznej, leukocytach, erytrocytach lub
tkance martwiczej naleŜy uwaŜać za nieswoiste barwienie
tła i naleŜy je podać w części przeznaczonej na uwagi
w arkuszu danych.
5. Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany
działaniu przeciwciała pierwotnego
Jeśli wykryta jest nadekspresja białka HER2 w próbce,
będzie to widoczne jako brązowe zabarwienie obwódkowe
błony komórkowej komórek guza poddanych działaniu
pierwszego przeciwciała.
1. Preparat kontrolny (w zestawie): W pierwszej kolejności naleŜy zbadać preparat kontrolny
przebadany testem HercepTest™, aby upewnić się, Ŝe wszystkie odczynniki działają prawidłowo.
Obecność brązowego produktu reakcji (3,3’-diaminobenzydyny, DAB) na błonach komórkowych
świadczy o reaktywności dodatniej.
Obecność brązowego odczynu błonowego (na obwodzie) w kontrolnej linii komórkowej 3+ SK-BR-3,
brązowego odczynu na części obwodu w kontrolnej linii komórkowej 1+ MDA-175 oraz brak
odczynu w kontrolnej linii komórkowej 0 MDA-231 świadczy o prawidłowym przebiegu testu. Jeśli
którakolwiek z kontrolnych linii komórkowych nie spełnia powyŜszych kryteriów, wszystkie wyniki
uzyskane z próbek pochodzących od pacjentów naleŜy uznać za niewaŜne.
2. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Następnie naleŜy zbadać preparat dodatniej kontroli
tkankowej. Ten preparat słuŜy do potwierdzania skuteczności zastosowanej metody utrwalania i
procesu odmaskowania antygenu. Do interpretacji naleŜy wybierać jedynie komórki prawidłowe,
gdyŜ w komórkach z martwicą lub uszkodzonych często występują odczyny nieswoiste (26).
W komórkach nowotworu powinien występować brązowy odczyn błonowy. Nasilenie brązowego
odczyn cytoplazmatycznego w tkankach ujemnych nie powinno przekraczać wartości 1+.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 19/56
Rak sutka
3. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: Szkiełko z Tkanką Kontroli Ujemnej naleŜy badać po
tkance kontroli dodatniej, aby sprawdzić swoistość znakowania docelowego antygenu przez
pierwsze przeciwciało. Brak odczynu swoistego w preparacie tkankowym do kontroli ujemnej
potwierdza brak reaktywności krzyŜowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek.
JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki
uzyskane dla próbki pochodzącej od pacjenta naleŜy uznać za niewaŜne. W charakterze tkanki
do kontroli ujemnej moŜna równieŜ wykorzystać ujemne fragmenty preparatu tkankowego do
kontroli dodatniej, jednak w takim przypadku wymagana jest weryfikacja przeprowadzona przez
uŜytkownika. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe słabą reakcję (intensywność barwienia 0 - 1+) moŜna
zauwaŜyć w większości normalnych tkanek nabłonka. Do uŜycia w charakterze kontroli ujemnej
nadają się np. tkanki: okręŜnicy, wątroby i tarczycy.
Jeśli odczyn nieswoisty występuje, ma on charakter rozproszony (rozlany). W preparatach tkanek
poddawanych nadmiernemu utrwalaniu w formalinie moŜe niekiedy występować odczyn w obrębie
tkanki łącznej.
4 + 5. Tkanka pochodząca od pacjenta: Na końcu naleŜy zbadać próbki pochodzącej od
pacjenta, poddane działaniu testu HercepTest™. Intensywność odczynu dodatniego naleŜy
oceniać w kontekście nieswoistego odczynu tła występującego w próbce z odczynnikiem kontroli
ujemnej. Podobnie jak w kaŜdym badaniu immunocytochemicznym, wynik ujemny oznacza, Ŝe
antygen nie został wykryty, a nie Ŝe nie występował w badanych komórkach/tkankach. Konkretne
informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest™ moŜna znaleźć w sekcji
Streszczenie i wyjaśnienia, Ograniczenia oraz Charakterystyka wydajnościowa.
Dodatkowe zalecenia dotyczące interpretacji odczynu w teście HercepTest™
W testach większości tkanek przerzutowego raka sutka badanych w kierunku nadmiernej
ekspresji białka HER2 uzyskuje się wynik od 0 do 3+. W większości przypadków wynik jest
bardzo jednoznaczny, jednak niewielki odsetek próbek z wynikiem 1+ i 2+ moŜe nastręczać
trudności interpretacyjnych. PoniŜej wymieniono wskazówki dotyczące interpretacji odczynu
w teście HercepTest™.
Ocenić kontrolne linie komórkowe w celu zweryfikowania działania testu.
Ocenić preparaty do kontroli dodatniej i ujemnej.
Przy pierwszej ocenie zaleca się wybarwienie preparatu tkankowego hematoksyliną i eozyną
(H+E). (Charakter nowotworowy moŜe nie być jednoznacznie widoczny w próbkach
wybarwionych testem HercepTest™. Szkiełko wybarwione H&E jest wymagane dla patologa,
abysprawdzić obecność guza.). Test HercepTest™ naleŜy wykonać na parze skrawków
(skrawki seryjne) z tego samego bloczku parafinowego próbki.
Skrawki, na których wykonano odczyn w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2, naleŜy
najpierw badać w małym powiększeniu. Większość przypadków dodatnich będzie ewidentnie
rozpoznawalna przy małym powiększeniu.
Do ustalania odsetka dodatnich komórek nowotworowych naleŜy wykorzystać dobrze
zachowane i dobrze wybarwione obszary próbki.
Z reguły wynik testu powinien być oczywisty przy małym powiększeniu. Jeśli rozróŜnienie
przypadków granicznych 1+/2+ przy niewielkim powiększeniu jest utrudnione, to zwykle
wynik wynosi 1+.
Aby sprawdzić wybarwienie błony naleŜy uŜyć powiększenia 20–40x.
Jeśli w większości komórek nowotworu występuje odczyn na całej błonie komórkowej, to wynik
wynosi 2+ lub 3+. NaleŜy przejść do powiększenia 20–40x, aby potwierdzić wynik.
W większości przypadków 3+ co najmniej 80% komórek nowotworowych daje odczyn, zaś
odczyn błonowy jest intensywny.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 20/56
Rak sutka
Jeśli odsetek nowotworowych komórek dodatnich w próbce jest bliski granicznej wartości 10%,
zaleca się zliczenie co najmniej 100 komórek nowotworowych w celu określenia prawidłowego
odsetka komórek wybarwionych.
Jeśli w więcej niŜ 10% komórek nowotworowych występuje słaby lub umiarkowany odczyn
błonowy (na całym obwodzie), to wynik dla próbki wynosi 2+. Zwykle towarzyszy mu odczyn
na fragmentach obwodu błon większości pozostałych komórek nowotworowych.
Jeśli odczyn na całym obwodzie błon komórkowych występuje w mniej niŜ 10% komórek
nowotworowych, przy odczynie na niepełnym obwodzie innych komórek nowotworowych,
wynik wynosi 1+.
Jeśli odczyn błonowy (na całym obwodzie lub na części obwodu) występuje w mniej niŜ 10%
komórek nowotworowych, wynik wynosi 0.
Ograniczenia - sutek
Ograniczenia ogólne
1. Immunocytochemia jest wieloetapową metodą diagnostyczną wymagającą specjalistycznego
przeszkolenia w doborze odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i
przeprowadzaniu, przygotowaniu preparatów do immunocytochemii i interpretacji wyników
barwienia.
2. Wybarwienie tkanek jest uzaleŜnione od obróbki i przetworzenia tkanki przed wykonaniem
odczynu. Nieprawidłowe utrwalanie, zamraŜanie, rozmraŜanie, przemywanie, suszenie,
ogrzewanie lub zanieczyszczenie skrawków domieszką innych tkanek lub płynów moŜe
powodować artefakty, ukrycie przeciwciał lub wyniki fałszywie ujemne. Przyczyną sprzecznych
wyników moŜe być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub właściwości zaleŜne
od tkanek.
3. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŜe utrudniać prawidłową interpretację
wyników.
4. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być prowadzona w kontekście
objawów klinicznych, morfologicznych i innych kryteriów histopatologicznych. Interpretacja
kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez badania
morfologiczne, wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych i innych badań diagnostycznych.
Odpowiedzialność związana z interpretacją wybarwionego preparatu spoczywa na
wykwalifikowanym histopatologu, dysponującym doświadczeniem obejmującym stosowane
przeciwciała, odczynniki i metody. Barwienie naleŜy wykonać w akredytowanej pracowni
histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę
wybarwionych preparatów i właściwe wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych.
5. Tkanki pochodzące od osób z zakaŜeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające
antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać
nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową (27).
6. W typach tkanek, które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą wykazywać
nieoczekiwane reakcje. Nie moŜna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji w
przetestowanych tkankach z uwagi na zmienność biologiczną ekspresji antygenów w tkankach
nowotworów i innych tkankach zmienionych chorobowo (28). W przypadku udokumentowanych
nieoczekiwanych reakcji naleŜy skontaktować się z Serwisem Technicznym firmy Dako.
7. Wiązanie białek lub produktów reakcji na drodze mechanizmów innych niŜ immunologiczne
moŜe być przyczyną wyników fałszywie dodatnich. Wyniki fałszywie dodatnie mogą równieŜ
wystąpić na skutek aktywności podobnej do peroksydazy (erytrocyty) i endogennej aktywności
peroksydazy (cytochromu C) (28).
8. Procedurę barwienia naleŜy wykonywać w temperaturze pokojowej 20–25 °C.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 21/56
Rak sutka
Ograniczenia specyficzne dla produktu
1. Antygen obecny w linii komórkowej 1+, MDA-175, z czasem ulega rozkładowi. Odczyn
preparatu kontrolnego naleŜy oceniać w kontekście daty waŜności tego preparatu. Ujemny
odczyn komórek MDA-175 moŜe być jedynie objawem rozkładu preparatu. Preparaty kontrolne
muszą być przechowywane w temperaturze 2–8 °C.
2. Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w
tkankach. Próbki naleŜy wybarwiać w ciągu 4-6 tygodni od zamontowania tkanek na
szkiełkach, jeŜeli są one przechowywane w temperaturze pokojowej (20–25 °C) (29).
3. JeŜeli tkanki są rutynowo utrwalane (neutralna zbuforowana formalina lub utrwalacz Bouin’a)
i zatapiane w parafinie, dla uzyskiwania optymalnego i odtwarzalnego wyniku białko HER2
wymaga odzyskiwania epitopu w podwyŜszonej temperaturze. Ta wstępna obróbka musi być
zakończona na początku całego procesu barwienia. Instrukcje podano w części
„Przygotowanie Próbek, Obróbka tkanek przed Barwieniem”
4. Wzbudzane temperaturą odzyskiwanie epitopu białka HER2 naleŜy wykonywać wyłącznie w
skalibrowanej łaźni wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one
odtwarzalnych wyników.
5. Nie wolno zastępować odczynników znajdujących się w zestawie odczynnikami posiadającymi
inne numery partii lub odczynnikami innych producentów. Jedynym wyjątkiem jest Wash Buffer,
który moŜna zastępować Dako Wash Buffer Nr kat. S3006.
6. Ocena odczynu cytoplazmatycznego moŜe doprowadzić do uzyskania fałszywych wyników.
W interpretacji naleŜy brać pod uwagę wyłącznie nasilenie odczynu błonowego.
7. Barwione preparaty kontrolne naleŜy stosować wyłącznie w celu weryfikacji wyników serii
odczynów, a nie w celu oceny odczynu w skrawkach tkankowych.
8. MoŜliwe jest sporadyczne występowanie silnego (3+) odczynu ogniskowego. MoŜe to być
efektem nierównomiernego utrwalenia i/lub przetwarzania tkanki. Zaleca się wykonanie
odczynu drugiego bloczka tkanki z tej samej próbki.
9. Nie zweryfikowano uŜycia testu HercepTest™ do próbek utrwalanych w środkach innych niŜ
obojętny roztwór buforowanej formaliny i płyn Bouina.
10. Komórki prawidłowego nabłonka sutka powinny dawać odczyn o intensywności od 0 do 1+.
W razie zaobserwowania w prawidłowym nabłonku odczynu silniejszego niŜ 1+ naleŜy
powtórzyć test. Uwaga: prawidłowy nabłonek migdałków i przełyku moŜe dawać odczyn
o intensywności dochodzącej do 2+.
Charakterystyka przebiegu testu - sutek
Test do badań klinicznych (CTA, ang. clinical trial assay) uŜywany do kwalifikacji pacjentów do
badań nad lekiem Herceptin™ był przeznaczony do badań naukowych i nie jest juŜ dostępny.
Test HercepTest™ opracowano jako porównywalny test alternatywny w stosunku do testu
uŜywanego w badaniach klinicznych.
Bezpieczeństwo i skuteczność leku Herceptin™ badano w randomizowanym kontrolowanym
badaniu klinicznym oraz w badaniu otwartym (zob. ulotka dołączona do opakowania leku
Herceptin™). U wszystkich pacjentów wybranych do badań klinicznych leku Herceptin™ test CTA
zastosowany w laboratorium centralnym wykazał nadmierną ekspresję białka HER2. Pacjentki
zostały zakwalifikowane do leczenia preparatem Herceptin™, jeŜeli ich guz wykazywał poziom
nadekspresji białka HER2 2+ lub 3+ (w oparciu o skalę 0 - 3+, gdzie 3+ stanowi najwyŜszy wynik).
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 22/56
Rak sutka
Analiza podgrup wyników tych badań nasuwa wniosek, Ŝe u pacjentów, których tkanki dają silnie
dodatni (3+) wynik w teście na nadmierną ekspresję białka HER2, stosowanie leku Herceptin™
moŜe odnieść lepszy skutek niŜ u pacjentów, których tkanki dają wynik słabo dodatni (2+). Stopień
nadmiernej ekspresji białka HER2 jest potencjalnie waŜnym wskaźnikiem pozwalającym na
przewidzenie skuteczności leczenia lekiem Herceptin™. PoniewaŜ Ŝadnego z pacjentów
uczestniczących w badaniach leku Herceptin™ nie zakwalifikowano do tych badań na podstawie
wyniku testu HercepTest™, nie jest znana korelacja między wynikami dodatnimi a
prawdopodobieństwem klinicznej skuteczności leczenia lekiem Herceptin™.
Badania porównawcze
W celu określenia charakterystyki testu HercepTest™ przeprowadzono dwa badania.
1) Porównanie z testem badania klinicznego (CTA)
2) Dokładność w porównaniu z pięcioma dodatkowymi testami.
Porównanie z testem uŜywanym w badaniach klinicznych (CTA)
HercepTest™ porównywano z testem uŜywanym do identyfikacji pacjentów kwalifikujących się do
leczenia lekiem Herceptin™. W porównaniu uŜyto 274 HER2-dodatnich (2+ lub 3+) próbek tkanki
raka sutka oraz identycznej liczby próbek HER2-ujemnych. W Tabeli 4 przedstawiono wyniki w
macierzy 2 x 2, przy czym wyniki 0 i 1+ uznano za ujemne, a 2+ i 3+ uznano za dodatnie.
Tabela 4. Zgodność 2 x 2 testu HercepTest™ z Testem Badania Klinicznego (liczba próbek).
CTA: test uŜywany w
badaniach klini cznych
Dodatni
Her cepTest™
Razem
Razem
Dodatni
216
59
275
Ujemny
58
215
273
274
274
548
Razem
Zgodność: 79%, przy 95-procentowym przedziale ufności (76–82%).
Ogólna zgodność par wyników testu HercepTest™ i CTA wynosiła 79% (431/548), przy
95-procentowym dwustronnym przedziale ufności 76–82%. W dwudziestu jeden procent (21%)
testów badane metody dały wyniki rozbieŜne.
Wyniki testu HercepTest™ są podawane w skali 0-3+ i interpretowane jako ujemne dla
nadekspresji białka HER2 przy intensywności barwienia 0 i 1+), słabo dodatnie przy intensywności
barwienia 2+) i silnie dodatnie przy intensywności barwienia 3+).
Tabela 5. Zgodność 3 x 3 testu HercepTest™ i Testu Badania Klinicznego.
CTA: test uŜywany w
badaniach klinicznych
Her cepTest™
3+
2+
3+
107
36
6
149
2+
16
57
53
126
8
50
215
273
131
143
274
548
0 - 1+
Razem
(128030-001)
0 - 1+
Razem
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 23/56
Rak sutka
Ta prezentacja 3 x 3 zgodności badania wskazuje, Ŝe istnieje wysokie prawdopodobieństwo,
Ŝe odczyt wyniku 3+ w teście HercepTest™ byłby zgodny z dodatnim wynikiem testu CTA, który
spełniałby kryteria włączenia pacjentek do badania preparatu Herceptin™ (2+ lub 3+). Wyniki 2+ w
teście HercepTest™ nie były równie dobrze skorelowane z wynikami testu badawczego. Około 42%
(53/126) wyników w teście HercepTest™ 2+ odpowiadało ujemnym wynikom testu badawczego
(0–1+), które nie spełniają kryteriów włączenia do badań klinicznych leku Herceptin™.
Dokładność
HercepTest™ testowano równieŜ na 2 szkiełkach mikroskopowych zawierających zatopione
w parafinie skrawki tkankowe z 168 nowotworów sutka. Nowotwory te przebadano wcześniej
pięcioma róŜnymi metodami w celu określenia amplifikacji genu GER2 i nadmiernej ekspresji
białka HER2, w tym wewnętrznie metodą Southern Blot, metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in
situ (FISH) w celu amplifikacji DNA, poprzez analizę RNA metodą Northern Blot, metodą Western
Blot oraz metodą immunocytochemiczną (ICC) na skrawkach mroŜakowych (29). Odpowiednie
wyniki przedstawiono w Tabeli 6.
Tabela 6. Porównanie testu HercepTest™ z łącznymi wynikami (OE) pochodzącymi z testów amplifikacji genu i nadekspresji
białka HER2.
Referencyj na klasyfikacj a O E
+
HercepTest™
-
Razem
+
43
0
43
-
26
99
125
Razem
69
99
168
Zgodność wyników dodatnich:
Zgodność wyników ujemnych:
43/69 = 62%
99/99 = 100%
Wyniki wskazują na zgodność na poziomie 85% (142/168) (przy 95-procentowym przedziale
ufności 78-89%) między odczynami dodatnimi (2+ i 3+) a ujemnymi (0 i 1+) w teście HercepTest™.
śadna z próbek dająca wynik ujemny w testach prowadzonych 5 róŜnymi metodami nie dała
wyniku dodatniego w teście HercepTest™, natomiast w łącznych wynikach 5 róŜnych metod
więcej jest przypadków dodatnich.
Powtarzalność
Odtwarzalność wewnątrz testu: Powtarzalność w ramach jednej serii odczynów testowano
w jednym laboratorium na 5 próbkach dających odczyny immunocytochemiczne o róŜnym
nasileniu. KaŜda próbka była badana trzykrotnie w randomizowanej próbie ślepej. Procedurę
zastosowano podczas barwienia ręcznego oraz ponownie barwienia na automatach. Dla
wszystkich próbek uzyskano 100% powtarzalność wyników.
Odtwarzalność pomiędzy testami: Powtarzalność między seriami odczynów testowano przez
4 dni w trzech laboratoriach na 5 próbkach dających odczyty immunocytochemiczne o róŜnym
nasileniu. Przeprowadzono randomizowaną próbę ślepą, w której odczyny wykonywane były
techniką automatyczną. Ponadto jedno laboratorium powtórzyło tę procedurę przy uŜyciu metody
ręcznej. Zaobserwowano doskonałą odtwarzalność w zakresie wyników dodatnich w stosunku do
wyników ujemnych (0 i 1+ wobec 2+ i 3+), z wyjątkiem dwóch próbek w jednym laboratorium
stosującym metodę automatyczną, gdzie wynik róŜnił się pomiędzy 1+ a 2+. Dla próbek z
wynikami 2+ i 3+ stwierdzono 100% powtarzalność.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 24/56
Rak sutka
Odtwarzalność pomiędzy laboratoriami: Powtarzalność między pracowniami testowano w trzech
pracowniach połoŜonych w róŜnych obszarach geograficznych, przy uŜyciu 40 identycznych
randomizowanych i maskowanych preparatów zawierających tkanki o róŜnych nasileniach odczynu
immunocytochemicznego. ŚwieŜo przygotowane wycinki dostarczono do kaŜdego laboratorium w
celu wykonania ręcznego i automatycznego barwienia oraz oceny przez patologa. WyraŜona
procentowo zgodność międzylaboratoryjna pod względem rozróŜnienia między wynikami
dodatnimi/ujemnymi wynosiła od 82% do 90%, przy czym za wynik ujemny uznawano odczyn o
nasileniu 0 lub 1+, a za dodatni — odczyn o nasileniu 2+ lub 3+. W porównaniu z wynikami
uzyskanymi w laboratorium referencyjnym, które wykonywało testy w badaniach klinicznych (CTA),
dla 12,5% (15/120) wyników zaszła rozbieŜność między kwalifikacją ujemną (0 lub 1+) a dodatnią
(2+ lub 3+). Dodatkowo w 10% (12/120) wyników zachodziła rozbieŜność między nasileniem 2+ a 3+.
Immunoreaktywność
W Tabeli 7 przedstawiono zbiorcze informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest™
z zalecanym panelem tkanek prawidłowych. Wszystkie tkanki zostały utrwalone w formalinie i
zatopione w parafinie oraz wybarwione testem HercepTest™ zgodnie z instrukcją podaną w ulotce
załączonej do opakowania.
Tabela 7. Zestawienie reaktywności testu HercepTest™ dla tkanek normalnych.
Rodzaj tkanki
(liczba testowanych przypadków)
Struktura wykazująca dodatni odczyn oraz rodzaj odczynu
Nadnerczowa (3)
Szpik kostny (3)
Mózgowa/móŜdŜkowa (3)
Mózgowa/mózgowa (3)
Piersiowa (3)
Szyjki macicy (3)
OkręŜnicy (3)
Przełyku (3)
Sercowa (3)
Nerkowa (3)
Brak
Brak
Brak
Brak
Gruczoł sutkowy (1 z 3 tkanek, (intensywność barwienia 1+)
Brak
Brak
Brak
Brak
Kanaliki rdzenia nerki (3 z 3 tkanek, 1 – 2+ w 5 – 50% komórek,
cytoplazmatyczny)
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Gruczoł sterczowy/przewody (3 z 3 tkanek, intensywność
barwienia 1+, 50% komórek, cytoplazmatyczny)
Brak
Brak
Gruczoły potowe (1 z 3 tkanek, 1+, 30% komórek,
cytoplazmatyczny)
Nabłonek walcowaty, powierzchnia (1 z 3 tkanek, intensywność
barwienia 2+, 25% komórek)
Brak
Nabłonek (1 z 3 tkanek, intensywność barwienia 1+, 25%
komórek)
Brak
Brak
Brak
Nabłonek płaski (3 z 3 tkanek, intensywność barwienia 1+, 80%
komórek)
Brak
W ątrobowa (3)
Płucna (3)
Komórek mezotelialnych (3)
Jajnikowa (3)
Trzustkowa (3)
Gruczołu przytarczycy (3)
Nerwu obwodowego (3)
Przysadkowa (3)
Prostaty (3)
Gruczołu ślinowego (3)
Mięśnia szkieletowego (3)
Skórna (3)
Jelita cienkiego (3)
Śledziony (3)
śołądkowa (3)
Jąder (3)
Grasicy (3)
Tarczycy (3)
Migdałków (3)
Maciczna (3)
O ile nie zaznaczono inaczej, we wszystkich tkankach stwierdzano odczyn błonowy. JeŜeli nie podano inaczej, wszystkie trzy próbki
kaŜdego typu tkanek miały taką samą intensywność barwienia.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 25/56
Rak sutka
Rozwiązywanie problemów - sutek
W celu uzyskania informacji o działaniach naprawczych naleŜy zapoznać się z wymienionym
wcześniej podręcznikiem firmy Dako (19) lub skontaktować z Działem Pomocy Technicznej firmy
Dako, aby poinformować o nietypowym wybarwieniu.
Problem
1. Brak barwienia
szkiełek
2. Słabe barwienie
szkiełek
(128030-001)
Prawdopodobna przyczyna
Zalecane postępowanie
1a. Odczynniki nie zostały uŜyte w
prawidłowej kolejności
1a. Sprawdzić stosowanie
odczynników
1b. Azydek sodu w Wash Solution
1b. Zastosować świeŜy Wash Buffer
dostarczony w zestawie
1c. Nadmierne ogrzewanie
skrawków tkankowych
zatopionych na szkiełkach
przed odparafinowaniem i
cieplnym odmaskowaniem
antygenu moŜe doprowadzić do
widocznej utraty
immunoreaktywności HER2.
1c. Pozostawić na powietrzu skrawki
tkankowe w temperaturze
pokojowej przez min. 12 godzin
lub do całkowitego wysuszenia.
Lub suszyć w temperaturze 37 °C
przez noc albo suszyć w
temperaturze 60 °C przez
maksymalnie jedną godzinę.
Suszenie skrawków tkankowych
w podwyŜszonej temperaturze
moŜna przeprowadzać wyłącznie
w piecu z regulacją temperatury
i równomiernym rozkładem
ciepła (17).
2a. Nieodpowiednie odzyskiwanie
epitopu
2a. Sprawdzić, czy Epitope Retrieval
Solution osiąga temperaturę
95–99 °C przez pełne 40 minut
oraz czy jest pozostawiony
do ostygnięcia przez dalsze
20 minut.
2b. Nieodpowiednie czasy inkubacji
odczynników
2b. Sprawdzić instrukcje odnośnie
procedury barwienia
2c. Zastosowana nieodpowiednia
metoda utrwalania
2c. Zapewnić, aby tkanka pacjentki
nie była nadmiernie utrwalona,
ani nie został uŜyty
alternatywny utrwalacz
2d. Nadmierne ogrzewanie
widocznej utraty
immunoreaktywności HER2
2d. Pozostawić na powietrzu skrawki
Suszenie skrawków tkankowych w
podwyŜszonej temperaturze
w piecu z regulacją temperatury i
równomiernym rozkładem
ciepła (17).
2e. Naniesiono niedostateczną
objętość odczynnika.
2e. Sprawdzić naniesioną objętość
odczynnika.
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 26/56
Rak sutka
Problem
3. Nadmierne
barwienie tła
szkiełek
3a. Parafina nie została
całkowicie usunięta
3a. UŜyć świeŜych roztworów
czyszczących oraz postępować
zgodnie z instrukcjami podanymi
w Części B.1
3b. Do zamontowania skrawków do
szkiełek uŜyto skrobiowych
substancji dodatkowych
3b. Unikać stosowania zawierających
skrobię dodatków zwiększających
przyczepność skrawków do
szkiełek mikroskopowych.
Wiele substancji dodatkowych
jest immunoreaktywnych.
3c. Szkiełka nie zostały
dokładnie wypłukane
3c. Zastosować świeŜy roztwór dla
kąpieli buforowej i tryskawek.
3d. Skrawki wyschły podczas
procedury barwienia
3d. Zastosować komorę wilgotną.
Jednorazowo wycierać tylko trzy
do czterech szkiełek przed
nałoŜeniem odczynnika.
3e. Zastosowana nieodpowiednia
metoda utrwalania
3e. Stosować tylko zatwierdzone
środki utrwalające. Alternatywny
utrwalacz moŜe powodować
nadmierne barwienie tła.
3f.
3f.
Nieswoiste wiązanie
odczynników do tkanki
Sprawdzić metodę utrwalania
próbki i obecność martwicy
4. Tkanka odkleja się
od szkiełka
4a. Zastosowano nieprawidłowe
szkiełka
4a. Stosować silanizowane szkiełka,
takie jak Dako Silanized Slides,
Nr kat. S3003, szkiełka pokryte
SuperFrost Plus lub poli-L-lizyną
5. Nadmiernie silne
swoiste barwienie
5a. Zastosowana nieodpowiednia
metoda utrwalania
5a
5b. Zastosowanie nieprawidłowego
źródła ciepła dla odzyskiwania
epitopu np. wytwornica pary,
kuchenka mikrofalowa
lub autoklaw
5b. Zapewnić, aby tylko łaźnia
wodna była uŜywana podczas
etapu odzyskiwania epitopu.
5c. Zbyt długie okresy inkubacji
odczynników
5c. Sprawdzić instrukcje odnośnie
procedury barwienia
5d. Zastosowanie nieprawidłowego
roztworu przemywającego
5d. Stosować wyłącznie Wash Buffer
zalecany dla testu
(128030-001)
Zapewnić, aby były stosowane
tylko odpowiednie utrwalacze i
metody utrwalania
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 27/56
Rak sutka
Problem
6. Słabe barwienie
Szkiełka
kontrolnego z linią
komórek 1+
6a. Nieprawidłowo wykonana
procedura odzyskania epitopu
6a. Zanurzyć szkiełka we wstępnie
podgrzanym roztworze Epitope
Retrieval Solution. Doprowadzić
temperaturę Epitope Retrieval
Solution ponownie do 95–99 °C i
podgrzewać przez pełne 40 minut.
6b. Brak reakcji z SubstrateChromogen Solution (DAB)
6b. Zapewnić, aby zastosowano
pełne 10 minut inkubacji.
Zapewnić, aby tylko jedna kropla
DAB Chromogen została dodana
do 1 mL DAB Buffered Substrate
6c. Degeneracja szkiełka
kontrolnego
6c. Sprawdzić datę waŜności i
warunki przechowywania
zestawu podane na zewnętrznej
części opakowania
7. Po ogrzaniu
roztworu Epitope
Retrieval Solution
pojawia się
zmętnienie.
7.
Po ogrzaniu roztworu pojawia
się zmętnienie.
7.
Jest to normalne zjawisko, które
nie ma wpływu na wynik
barwienia.
8
8.
Roztwór był nieprawidłowo
przechowywany lub jest
przeterminowany.
8.
Sprawdzić datę waŜności i
zestawu podane na zewnątrz
opakowania. Usunąć roztwór
Epitope Retrieval Solution.
Przy
przechowywaniu
(przed ogrzaniem)
roztwór Epitope
Retrieval Solution
jest mętny.
UWAGA: Jeśli problemu nie moŜna przypisać Ŝadnemu z powyŜszych powodów lub, gdy
sugerowane działanie naprawcze nie rozwiązuje problemu naleŜy skontaktować się z Serwisem
Technicznym firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy.
Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŜna znaleźć we
wspomnianym wcześniej podręczniku firmy Dako (19) (dostępny w firmie Dako), Atlasie
Immunohistologii (30) oraz Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor
Diagnosis (31).
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 28/56
Rak Ŝołądka
Streszczenie i wyjaśnienia - Ŝołądek
Ludzki gen HER2 (znany takŜe jako ERBB2 lub NEU) koduje białko oznaczane najczęściej
symbolem HER2 lub p185HER2. Białko HER2 to transbłonowe białko receptorowe o aktywności
kinazy tyrozynowej, wykazujące homologię do receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR
lub HER1) (1-8). Białko HER2 jest składnikiem prawidłowym, wykazującym ekspresję w róŜnych
typach komórek nabłonkowych (8).
Nadmierną ekspresję białka HER2 i amplifikację genu HER2 raka Ŝołądka wykazano w licznych
badaniach. Wynik dodatni HER2 wykryto w ok. 20 % pacjentów w zakresie IHC lub FISH (32).
Przedkliniczne badania in vitro i in vivo wykazały skuteczność preparatu trastuzumab (Herceptin™)
na przykładzie róŜnych modeli raka Ŝołądka, co doprowadziło do rozpoczęcia badań klinicznych
(32-36). W fazie III badania BO18255 zwanym ToGA, pacjentów z dodatnim HER2 z
nieoperacyjnym miejscowo zaawansowanym gruczolakorakiem Ŝołądka i/lub przerzutowym
gruczolakorakiem Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego randomizowano do
przyjmowania preparatu 5-FU lub capecitabine i cisplatin oddzielnie lub w połączeniu z preparatem
trastuzumab. Zaobserwowano statystyczny znaczny wzrost okresu przeŜycia (OS) u pacjentów
biorących udział w leczeniu preparatem trastuzumab i chemioterapią (37, 38). Trastuzumab to
„uczłowieczone” przeciwciało monoklonalne (10), które wiąŜe się z białkiem HER2, wykazując do
niego silne powinowactwo. W badaniach in vitro i in vivo stwierdzono, Ŝe przeciwciało to blokuje
rozrost ludzkich komórek nowotworowych wykazujących nadmierną ekspresję białka HER2 (33-36).
Właściwości
Badaniu przesiewowemu pod kątem statusu HER2, w celu włączenia do badania ToGA poddano
3803 pacjentów. W tym badaniu zaobserwowano nadmierną ekspresję białka HER2 na przykładzie
metody IHC (HercepTest™, Dako) i aplikację genu HER2 na przykładzie metody FISH (HER2
FISH pharmDx™, Dako). WaŜne wyniki testów uzyskano dla 3665 próbek w testach IHC lub FISH i
dla 3280 próbek w obu testach.
Wyniki badania ToGA wykazały, Ŝe 22,1% pacjentów z zaawansowanym rakiem Ŝołądka było HER2pozytywnych przy uŜyciu metody IHC lub FISH, zgodnie z definicją kryteriów selekcji ToGA HER2 (38).
Więcej informacji na temat uŜycia preparatu HercepTest™ przy wspomaganiu badania pacjentów,
u których rozwaŜane jest podjęcie leczenia lekiem trastuzumab moŜna znaleźć w ulotce
dołączonej do opakowania Herceptin™).
Zasada testu - Ŝołądek
Test HercepTest™ zawiera odczynniki konieczne do wykonania dwuetapowej procedury barwienia
immunocytochemicznego dla rutynowo przygotowanych próbek zanurzonych w parafinie.
W omawianym zestawie po zakończeniu inkubacji pierwotnych przeciwciał króliczych z ludzkim
białkiem HER2 następuje reakcja z gotowym barwnym odczynnikiem Visualization Reagent
produkowanym w oparciu o technologię stosowaną do wytwarzania dekstranu. W skład
odczynnika wchodzą cząsteczki wtórnych przeciwciał kozich skierowanych przeciw
immunoglobulinom króliczym oraz cząsteczki peroksydazy chrzanowej połączone ze wspólnym
szkieletem polimerowym dekstranu. W ten sposób wyeliminowano konieczność sekwencyjnego
stosowania przeciwciała wtórnego i koniugatu peroksydazy. Reakcję krzyŜową odczynnika
Visualization Reagent z immunoglobulinami ludzkimi i płodową surowicą cielęcą wyeliminowano
poprzez absorpcję w fazie stałej. Po dodaniu chromogenu następuje reakcja enzymatyczna, której
efektem jest widoczny produkt, zlokalizowany w miejscu występowania antygenu. Następnie
moŜna wykonać barwienie kontrastowe i nakryć preparat szkiełkiem nakrywkowym. Wynik reakcji
ocenia się w mikroskopii świetlnej. Zestaw zawiera szkiełka kontrolne zawierające trzy utrwalone w
formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka, dające odczyny o nasileniu
odpowiednio 0, 1+ i 3+. SłuŜą one do weryfikacji serii odczynów. Nasilenie odczynu tych linii
komórkowych jest skorelowane z liczbą receptorów przypadających na komórkę.
Test HercepTest™ Nr kat. K5204 jest odpowiedni zarówno dla testów barwienia wykonywanych
ręcznie jak i na automatach przy uŜyciu Autostainera.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 29/56
Rak Ŝołądka
Odczynniki - Ŝołądek
Dostarczane materiały
Wyszczególnione poniŜej materiały wystarczają na wykonanie 35 testów (35 szkiełek
mikroskopowych inkubowanych z odczynnikiem przeciwciałem pierwotnym przeciwko białku HER2
oraz 35 szkiełek inkubowanych z odpowiednim odczynnikiem do kontroli ujemnej). Liczba testów
opiera się na zastosowaniu 3 kropli (100 µL) na sekcję tkanki fiolek z numerem 1, 2, 3 i 4 oraz
roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB). Materiał znajdujący się w zestawie wystarcza na
wykonanie co najwyŜej 5 pojedynczych serii oznaczeń.
Fiolka nr Ilość
1
Opis
1 x 7 mL
Peroxidase-Blocking Reagent: 3% roztwór nadtlenku wodoru
z dodatkiem azydku sodu (NaN3) w stęŜeniu 15 mmol/L.
2
1 x 3,5 mL
Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Gotowe do uŜycia przeciwciała
wyizolowane ze względu na powinowactwo. Dostarczany w buforze
Tris/HCl 0,05 mol/L, NaCl 0,1 mol/L, NaN3 15 mmol/L, pH 7,2,
z dodatkiem białka stabilizującego.
Immunogen: syntetyczny fragment C-końcowy
(część wewnątrzcytoplazmatyczna) białka HER2
sprzęŜony z KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).
Swoistość: białko HER2.
Metoda oczyszczania: przeciwciała są izolowane ze względu na
powinowactwo przy uŜyciu immobilizowanego peptydu białka HER2.
3
1 x 7 mL
Visualization Reagent: Polimer dekstranowy skoniugowany z
peroksydazą chrzanową oraz przeciwciała kozie izolowane ze
względu na powinowactwo, skierowane przeciw antygenom
króliczym. Dostarczany w buforze Tris/HCl zawierającym białko
stabilizujące i środek przeciwbakteryjny.
4
1 x 3,5 mL
Negative Control Reagent: Frakcja immunoglobulinowa prawidłowej
surowicy króliczej rozcieńczona do takiego samego stęŜenia białek,
jak przeciwciało przeciwko białku HER2. Dostarczany w buforze
Tris/HCl 0,05 mol/L, NaCl 0,1 mol/L, NaN3 15 mmol/L, pH 7,2,
z dodatkiem białka stabilizującego.
5
1 x 10 mL
DAB Buffered Substrate: Roztwór buforowy substratu, pH 7,5,
zawierający roztwór nadtlenku wodoru o stęŜeniu < 0,1 %, substancje
stabilizujące, substancje wzbogacające i środek przeciwbakteryjny.
6
1 x 0,5 mL
DAB Chromogen: Roztwór tetracholorowodorku
3,3’-diaminobenzydyny o stęŜeniu 5% w roztworze chromogenu
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 30/56
Rak Ŝołądka
7
1 x 500 mL
Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): Roztwór
cytrynianowy o stęŜeniu 0,1 mol/L z dodatkiem środka
przeciwbakteryjnego.
8
1 x 250 mL
Wash Buffer (10x): Bufor Tris/HCl z detergentem i
środkiem przeciwbakteryjnym.
5 szkiełek
Szkiełka kontrolne: KaŜdy preparat zawiera skrawki trzech
utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie linii komórkowych
raka sutka wykazujących róŜne poziomy ekspresji białka HER2:
MDA-231 (0), MDA-175 (1+) i SK-BR-3 (3+). Preparaty do kontroli
jakości zostały poddane obróbce cieplnej w celu uzyskania lepszego
przylegania skrawków do szkiełek. Jakakolwiek dodatkowa obróbka
cieplna preparatów do kontroli jakości przeprowadzona w celu
poprawy przylegania skrawków do szkiełek moŜe negatywnie
wpłynąć na wyniki odczynu.
UWAGA: Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały
przygotowane specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z
instrukcją nie naleŜy uŜywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, zamiast którego
moŜna uŜyć Dako Nr kat. S3006.
Materiały wymagane, lecz niedostarczone
Waciki
Wodorotlenek amonu, 15 mol/L rozcieńczony do 37 mmol/L
Barwnik kontrastowy: Hematoksylina, taka jak rozcieńczana wodą Mayer's Hematoxylin,
Dako Nr kat. S3301 (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, A.4)
Szkiełka nakrywkowe
Marker, taki jak Dako Pen, Nr kat. S2002
Woda destylowana lub dejonizowana (Washing Water)
Suszarka umoŜliwiająca utrzymanie temperatury 60°C lub niŜszej
Etanol absolutny i roztwór o stęŜeniu 95%
Komora wilgotna (opcjonalna)
Mikroskop optyczny (powiększenie obiektywu 4–40x)
Środek do montowania, taki jak Dako Faramount, Nr kat. S3025 lub Glycergel™ Nr kat. C0563
Tkanki o dodatnim i ujemnym odczynie, do stosowania w charakterze próby kontrolnej
(zobacz część Kontrola jakości)
Szkiełka, SuperFrost Plus, szkiełka opłaszczone poli-L-lizyną lub silanizowane szkiełka Dako
Silanized Slides Nr kat. S3003 (zobacz Przygotowanie próbek)
Słoje lub łaźnie barwiące
Stoper (odpowiedni do wyznaczenia 2–40-minutowych okresów)
Tryskawki
Łaźnia wodna z przykrywką (odpowiednia do utrzymywania temperatury
Epitope Retrieval Solution 95–99 °C)
Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 31/56
Rak Ŝołądka
Przechowywanie - Ŝołądek
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C.
Nie uŜywać zestawu po dacie waŜności ostemplowanej na zewnętrznej stronie opakowania. JeŜeli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na wkładce informacyjnej do
opakowania, UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość (14a,14b). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe
równieŜ preparaty do kontroli jakości powinny być przechowywane w temperaturze 2–8 °C.
Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego teŜ
naleŜy wykonywać Kontrole Dodatnie i Ujemne jednocześnie z badaniem próbki pacjentki.
Jeśli zauwaŜone zostanie nieoczekiwane zabarwienie, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami
w procedurach laboratoryjnych i podejrzewa się, Ŝe przyczyną moŜe być HercepTest™,
naleŜy niezwłocznie skontaktować się z serwisem technicznym firmy Dako.
Przygotowanie próbek - Ŝołądek
Próbki gruczolakoraka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, pochodzące z biopsji,
wycinki lub resekcje naleŜy poddać obróbce, aby utrwalić tkanki do barwienia
immunocytochemicznego. Do wszystkich preparatów naleŜy stosować standardowe metody
przeprowadzania tkanek (15). W przypadku badania małych preparatów biopsyjnych naleŜy
upewnić się, czy do oceny IHC zachowano morfologię guza i obecność wystarczającej liczby
komórek guza. Przy analizie HercepTest™ preparatów biopsyjnych, do uzyskania wiarygodnych
danych na temat statusu HER2 wyniku naleŜy przeanalizować kilka (7-8) preparatów, pobranych z
róŜnych regionów guza.
Skrawki zatapiane w parafinie
Do uŜytku nadają się tkanki utrwalone w obojętnie buforowanej formalinie i zatopione w parafinie.
Próbki naleŜy np. pociąć na bloczki o grubości od 3 do 4 mm i utrwalać przez 18-24 godziny w
obojętnie zbuforowanej formalinie. Preparaty biopsyjne utrwalano przez 6–8 godzin w badaniu
ToGA (opis badania w punkcie (37)). Następnie tkanki zostają odwodnione w szeregu alkoholi i w
ksylenie, a następnie przesiąknięte stopioną parafiną utrzymywaną w temperaturze nie wyŜszej niŜ
60 °C. Prawidłowo utrwalone i zatopione tkanki z eksp resją białka HER2 mogą być
przechowywane przez nieograniczony czas przed podzieleniem na skrawki i zamontowaniem na
szkiełka, pod warunkiem, Ŝe są przechowywane w chłodnym miejscu (15–25 °C) (15, 16).
W Stanach Zjednoczonych dokument Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (Zmiany w
zasadach postępowania w laboratoriach klinicznych, 42 CFR 493.1259(b)) „nakłada na
uŜytkowników wymóg przechowywania wybarwionych szkiełek przez co najmniej 10 lat od daty
badania i zachowania bloczków próbek przez co najmniej dwa lata od daty badania” (16).
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach 4–5 µm, zatopić w szkiełkach i suszyć
na powietrzu w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin (lub do wysuszenia) albo w
temperaturze 37 °C przez cał ą noc lub w temperaturze 60 °C w ci ągu jednej godziny.
PRZESTROGA: Nadmierne ogrzewanie przez ponad jedną godzinę w temperaturze ≥60 °C
moŜe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2 związanej z odczynem
błonowym (17).
Aby zachować antygenowość, skrawki tkankowe zatopione na szkiełkach (SuperFrost Plus,
Poly-L-lysine lub szkiełka silanizowane) powinny zostać poddane barwieniu w ciągu 4–6 tygodni
od sporządzenia skrawków, o ile skrawki były przechowywane w temperaturze pokojowej
(20–25 °C) (18). Szkiełka wymagane do oceny białka H ER2 i zweryfikowania obecności guza
naleŜy przygotować w tym samym czasie. Zaleca się minimum 5 szkiełek, 1 szkiełko dla obecności
guza, 2 szkiełka dla oceny białka HER2 (1 dla inkubacji z fiolką nr 2 i 1 dla inkubacji z fiolką nr 4)
oraz 2 szkiełka zapasowe.
Zastosowanie HercepTest™ na tkankach odwapnionych nie zostało zatwierdzone i
nie jest zalecane.
Szczegółowe informacje dotyczące przygotowywania próbek przedstawiono w podręczniku
Dako „Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods” (19), a takŜe odsyłacze 15 i 16.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 32/56
Rak Ŝołądka
Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu
Dla uzyskania optymalnych wyników testu naleŜy zastosować specyficzną metodę odzyskiwania
epitopu, polegającą na gotowaniu w 10 mmol/L buforu cytrynianowego. Roztwór do odmaskowania
antygenu wchodzi w skład zestawu HercepTest™. Metoda obejmuje podgrzewanie skrawków tkanek
zamontowanych na szkiełkach, które zostają zanurzone w buforze cytrynianowym 10 mmol/L (20) w
skalibrowanej łaźni wodnej utrzymującej Epitope Retrieval Solution w wymaganej temperaturze
(95–99 °C). Laboratoria znajduj ące się na duŜych wysokościach powinny określić najlepszą metodę
utrzymania wymaganej temperatury łaźni wodnej. Odzyskanie epitopu musi zostać wykonane w łaźni
wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one odtwarzalnych wyników. Niezwłocznie
po odzyskaniu epitopu naleŜy rozpocząć procedurę barwienia. Odstępstwa od opisywanej procedury
mogą mieć wpływ na wyniki.
Środki ostroŜności - Ŝołądek
1.
2.
Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
3.
Fiolka 1, Peroxidase-Blocking Reagent, zawiera 3% nadtlenek wodoru. Karta charakterystyki
substancji niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie.
4.
Fiolka 6, DAB Chromogen, zawiera≥5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium
tetrachloride (czterochlorek dwufenylo-3,3’, 4,4’-tetryloczteroamonowego) i jest oznaczony:
Niebezpieczeństwo
MoŜe powodować raka.
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę
twarzy. Stosować odzieŜ ochronną.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zasięgnąć porady/zgłosić
się pod opiekę lekarza.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi,
krajowymi i międzynarodowymi przepisami.
Za ogólną regułę naleŜy przyjąć, Ŝe osoby poniŜej 18 lat nie mogą pracować z tym
produktem. NaleŜy poinformować uŜytkowników testu o prawidłowej procedurze pracy,
niebezpiecznych własnościach produktu oraz o niezbędnych instrukcjach BHP. Dodatkowe
informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa (SDS).
H350
H341
P201
P280
5.
Fiolka 8, Wash Buffer, zawiera ≥5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol
hydrochloride i ≥0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. MoŜe wywoływać reakcje alergiczne.
Produkt Wash Buffer (10x) jest oznaczony:
Uwaga
H319
P280
P264
P305 + P351 + P338
6.
Działa draŜniąco na oczy.
Stosować ochronę oczu lub twarzy.
Dokładnie umyć ręce po uŜyciu.
W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą
przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŜeli są i moŜna je
łatwo usunąć. Nadal płukać.
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej
postaci. StęŜenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 33/56
Rak Ŝołądka
Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji
kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Po usunięciu spłukać duŜą
ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji (21, 22).
7.
Fiolki 2, 3 i 4 zawierają materiał pochodzenia zwierzęcego. Podobnie jak w przypadku
kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować odpowiednie
procedury postępowania.
8.
Preparaty kontrolne i próbki (przed i po utrwaleniu) oraz wszystkie przyrządy i materiały
mające z nimi kontakt, powinny być traktowane jako mogące przenosić zakaŜenia i
likwidowane z zachowaniem odpowiednich środków ostroŜności (23). Nigdy nie pipetować
odczynników ustami i unikać naraŜania skóry i błon śluzowych na kontakt z odczynnikami i
próbkami. W razie kontaktu odczynników z wraŜliwymi okolicami skóry naleŜy je spłukać obfitą
ilością wody.
9.
Zminimalizować skaŜenie mikrobiologiczne odczynników, aby uniknąć nieswoistego barwienia.
10. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasów inkubacji, temperatur lub metod moŜe
powodować błędne wyniki badania. Nadmierne suszenie w temperaturze ≥60 °C przez ponad
jedną godzinę moŜe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2
związanej z odczynem błonowym (17).
11. Dostarczone odczynniki mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŜe
powodować utratę odczynu antygenów.
12. Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały przygotowane
specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z instrukcją nie
naleŜy uŜywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, posiadającego Nr kat. S3006.
13. Wystawienie Visualization Reagent i DAB Chromogenu na działanie silnego światła moŜe
mieć na nie niekorzystny wpływ. Nie naleŜy przechowywać składników systemu ani
wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne.
14. Aby uniknąć kontaktu z oczami i skórą, naleŜy uŜywać odpowiedniego osobistego
wyposaŜenia ochronnego. Dodatkowe informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki
Bezpieczeństwa (SDS).
15. Pozostałości parafiny mogą być przyczyną wyników fałszywie ujemnych.
16. Do precyzyjnej interpretacji metodą HercepTest™ barwienia próbek gruczolakoraka Ŝołądka,
w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, pochodzących z biopsji, zaleca się skupisko co
najmniej 5 wybarwionych komórek guza. Skupisko przynajmniej 5 wybarwionych komórek
guza składa się z 5 połączonych, wybarwionych komórek guza.
17. Ze względu na heterogenną naturę preparatów biopsyjnych raka Ŝołądka waŜne jest, aby
przeprowadzić badanie HER2 IHC na wielu skrawkach (7-8) materiału z róŜnych obszarów
guza dla uzyskania wiarygodnych wyników.
18. UŜycie objętości odczynnika innych niŜ zalecane moŜe doprowadzić do widocznej utraty
immunoreaktywności HER2. JeŜeli obwiedziony skrawek tkanki nie zostanie pokryty 3
kroplami (100 µL) odczynnika, naleŜy dodać kolejne 3 krople.
19. Zaleca się zbadanie więcej niŜ jednego bloku tkankowego wycinków raka Ŝołądka w
przypadku, gdy próbka wykazuje wysoki poziom heterogenności (41).
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 34/56
Rak Ŝołądka
SPOSÓB UśYTKOWANIA - Ŝołądek
A. Przygotowanie odczynników
Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia:
A.1 Epitope Retrieval Solution
Dla planowanej procedury barwienia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 7 (Epitope Retrieval
Solution 10x) w stosunku 1:10 uŜywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany
rozcieńczony roztwór moŜna przechowywać w temperaturze 2–8 °C przez jeden miesi ąc.
W przypadku zmętnienia rozcieńczony roztwór nie nadaje się do uŜycia.
A.2 Bufor płuczący
Dla etapów przemycia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 8 (Wash Buffer 10x) w stosunku 1:10
uŜywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany rozcieńczony bufor moŜna
przechowywać w temperaturze 2–8 °C przez jeden miesi ąc. W przypadku zmętnienia bufor nie
nadaje się do uŜycia.
Wodę destylowaną lub dejonizowaną moŜna uŜyć do płukania po odczynniku Peroxidase-Blocking
Reagent, Substrate-Chromogen Solution i inkubacji hematoksykliny.
Wszystkie pozostałe etapy wymagają uŜycia Wash Buffer.
A.3 Roztwór substrat-chromogen (DAB)
Następująca procedura daje 1 mL roztworu Substrate-Chromogen Solution. KaŜdy 1 mL
jednakowej objętości roztworu jest wystarczający dla dziesięciu skrawków tkanek.
Etap 1:
Etap 2:
Przenieść do probówki 1 mL zbuforowanego substratu DAB z fiolki 5.
Dodać jedną kroplę (25–30 µL) Chromogenu DAB z fiolki 6.
Wymieszać i nałoŜyć na skrawki tkanek za pomocą pipety.
Przygotowany Substrate-Chromogen Solution (DAB) jest stabilny przez około 5 dni, jeśli jest
przechowywany w temperaturze 2–8 °C. Przed u Ŝyciem roztwór naleŜy dokładnie wymieszać.
Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu.
UWAGA: DAB Chromogen w fiolce 6 moŜe przyjmować barwę od przezroczystej po lawendowobrązową. Nie ma to wpływu na działanie produktu. NaleŜy go rozcieńczyć zgodnie ze
wskazówkami podanymi w niniejszej ulotce. Dodanie nadmiernej ilości roztworu DAB Chromogen
do buforu DAB Buffered Substrate spowoduje pogorszenie jakości odczynu dodatniego.
A.4 Barwienie kontrastowe
Barwny produkt końcowy reakcji barwienia chromogenem DAB jest nierozpuszczalny w
alkoholu i wodzie. Zastosować barwienie negatywne hematoksyliną i dopasować intensywność
barwienia hematoksyliny do podobnego poziomu pokazanego w atlasie „HercepTest™
Interpretation Manual – Gastric Cancer” (Atlas interpretacji odczynów HercepTest™ - rak Ŝołądka).
MoŜna uŜyć hematoksylinę rozcieńczoną alkoholem lub wodą, taką jak Dako Mayer's Hematoxylin
Nr kat. S3301. Po barwieniu negatywnym hematoksyliną wykonać dokładne płukanie w wodzie
destylowanej lub dejonizowanej, następnie zanurzyć szkiełka z tkankami w wodzie amoniakalnej o
stęŜeniu 37 mmol/L (zobacz Część B.2, etap 6). Woda amoniakalna (37 mmol/L) jest
przygotowana przez zmieszanie 2,5 mL 15 mol/L (stęŜonego) wodorotlenku amonowego z 1 litrem
wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystana woda amoniakalna o stęŜeniu 37 mmol/L
moŜe być przechowywana w temperaturze pokojowej (20–25 °C) w szczelnie zamkniętej butelce
do 12 miesięcy.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 35/56
Rak Ŝołądka
A.5 Środek do zatapiania
Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest jednak
równieŜ zatapianie wodne. Do montowania wodnego zaleca się Dako Faramount Aqueous
Mounting Medium, gotowe do uŜycia, Nr kat. S3025 lub Glycergel™ Mounting Medium
Nr kat. C0563. Doprowadzić Glycergel™ do postaci płynnej przez podgrzewanie do około
40 (±5) °C przed u Ŝyciem.
B. Procedura barwienia
B.1 Uwagi dotyczące procedury
Przed uŜyciem naleŜy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się ze wszystkimi
składnikami (patrz Środki ostroŜności).
Przed immunobarwieniem wszystkie odczynniki naleŜy doprowadzić do temperatury pokojowej
(20–25 °C). Podobnie, wszystkie inkubacje nale Ŝy przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas procedury barwienia. Wysuszone skrawki
tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. Zakryć szkiełka wystawione na
działanie przeciągów. Jeśli stosowane są wydłuŜone inkubacje umieścić tkanki w wilgotnym
środowisku.
Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po inkubacji pierwszego przeciwciała
(etap 3) szkiełka moŜna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny, w temperaturze
pokojowej (20–25 °C) bez wpływu na jako ść barwienia.
Usunięcie parafiny i ponowne uwodnienie: Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŜy
odparafinować preparaty w celu usunięcia środka zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy
unikać niecałkowitego usunięcia parafiny. Pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie
odczynu nieswoistego. Ten etap powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
1.
Umieścić szkiełka w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i
2.
Postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar płynu i umieścić je w bezwodnym etanolu na
3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę.
3.
Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić szkiełka w 95% etanolu na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i
4.
Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w destylowanej lub dejonizowanej wodzie na
minimum 30 sekund. Rozpocząć procedurę barwienia zgodnie z instrukcją podana w Części
B 2, etap 1, Odzyskanie epitopu.
Po wykonaniu barwienia 40 preparatów naleŜy zmienić roztwór ksylenu i alkoholu. Zamiast ksylenu
moŜna stosować zamienniki toluenu lub ksylenu np. Histoclear.
UWAGA: Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania
optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub
temperatury inkubacji moŜe spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. RóŜnice
w metodach przetwarzania tkanek oraz procedurach technicznych stosowanych w laboratorium
uŜytkownika mogą spowodować, Ŝe wyniki testu nie będą waŜną podstawą wyboru pacjentów do
terapii lekiem Herceptin™.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 36/56
Rak Ŝołądka
B.2 Wykonanie odczynu
Wykonana w temperaturze pokojowej, 20–25 °C.
Etap 1: Odmaskowanie antygenu
Pojemniki do barwienia, np. naczynka Coplina, napełnić rozcieńczonym Epitope Retrieval
Solution (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.1). Naczynia do barwienia zawierające
Epitope Retrieval Solution umieścić w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i Epitope
Retrieval Solution do 95–99 °C. Po ogrzaniu roztworu Epitope Retrieval Solution pojawia
się zmętnienie. Zakryć naczynia wieczkami, aby zapewnić stabilną temperaturę i uniknąć
parowania.
Zanurzyć pozbawione parafiny skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym
roztworze odzyskiwania epitopu w naczyniach do barwienia. PONOWNIE DOPROWADZIĆ
TEMPERATURĘ ŁAŹNI WODNEJ I EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION DO 95–99 °C.
Inkubować w temperaturze 95–99 °C przez 40 (±1) minut.
Wyjąć całe naczynie ze szkiełkami z łaźni wodnej. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w
Epitope Retrieval Solution na 20 (±1) minut w temperaturze pokojowej.
Zdekantować roztwór Epitope Retrieval Solution i wypłukać skrawki w rozcieńczonym
buforze Wash Buffer (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.2).
Dla uzyskania optymalnych wyników po odzyskaniu epitopu i przed barwieniem naleŜy
nasączyć skrawki w Wash Buffer przez 5–20 minut.
UWAGA: Roztwór Epitope Retrieval Solution jest przeznaczony do jednokrotnego
stosowania. Nie uŜywać ponownie.
Etap 2: Peroxidase-Blocking Reagent:
Strząsnąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. Kimwipe lub
płatka gazy) ostroŜnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru
płynu oraz utrzymania odczynników w określonym miejscu. Za pomocą Dako Pen
obwieść skrawek tkanki.
NałoŜyć 3 krople (100 µL) odczynnika Peroxidase-Blocking Reagent dla zakrycia próbki.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną lub buforem Wash Buffer
z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŜej
kąpieli buforu.
Etap 3: Primary Antibody lub Negative Control Reagent
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio.
Pokryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µL) białka Anti-HER2 Protein lub odczynnika
Negative Control Reagent.
Delikatnie przepłukać buforem Wash Buffer z tryskawki (nie kierować strumienia
bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŜej kąpieli buforu.
Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po wykonaniu etapu 3
szkiełka moŜna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny w temperaturze
pokojowej (20–25 °C), bez wpływu na wykonanie barwie nia.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 37/56
Rak Ŝołądka
Etap 4: Visualization Reagent
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak
wskazano poprzednio.
Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µL) odczynnika Visualization Reagent.
Wypłukać szkiełka jak polecono w etapie 3.
Etap 5: Roztwór substrat-chromogen (DAB)
Wytrzeć szkiełka jak polecono wcześniej.
Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µL) roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB).
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną z butelki przemycia
(nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę). Zebrać odpady roztworu SubstrateChromogen Solution (DAB) do pojemnika na odpady skaŜone w celu właściwego
ich usunięcia.
Etap 6: Barwienie negatywne (instrukcje podano dla hematoksyliny)
Zanurz szkiełka w hematoksylinie. Inkubuj przez 2–5 minut, zaleŜnie od stęŜenia
zastosowanej hematoksyliny.
Delikatnie przepłukaj wodą destylowaną lub dejonizowaną. Upewnij się, Ŝe pozostałości
hematoksyliny zostały usunięte.
Opcjonalnie: Zanurz szkiełka 10 razy w wodzie amoniakalnej o stęŜeniu 37 mmol/L
(zobacz Część A.4).
Delikatnie przepłukaj szkiełka wodą destylowaną lub dejonizowaną przez 2–5 minut.
UWAGA: ZaleŜnie od czasu trwania inkubacji oraz stęŜenia uŜytej hematoksyliny
barwienie negatywne spowoduje zabarwienie jądra komórkowego od jasno do
ciemnoniebieskiego. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŜe utrudniać
prawidłową interpretację wyników.
Etap 7: Zatapianie preparatu
Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest
jednak równieŜ zatapianie wodne. Próbki moŜna montować i zakrywać szkiełkiem
nakrywkowym przy uŜyciu środka do montowania takiego, jak Dako Faramount Nr kat.
S3025 lub Glycergel™ Nr kat. C0563.
UWAGA: Odczyt odczynu moŜna przeprowadzić w dogodnym dla uŜytkownika
momencie. Jednak, jeŜeli do nakrywania zastosowano wodny środek do zatapiania,
ekspozycja na silne światło przez okres jednego tygodnia moŜe powodować zblaknięcie.
Aby ograniczyć blaknięcie, naleŜy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu,
w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 38/56
Rak Ŝołądka
Kontrola jakości - Ŝołądek
Stosowanie w laboratorium UŜytkownika innych metod utrwalania, przeprowadzania i zatapiania
tkanek moŜe spowodować istotne róŜnice wyników, wymagające regularnego wykonywania
dodatkowej wewnętrznej kontroli jakości, niezaleŜnie od standardowych załączonych preparatów
kontroli jakości Dako. W przypadku testów wykonywanych na terenie Stanów Zjednoczonych
naleŜy sprawdzić wskazówki dotyczące kontroli jakości zawarte w Programie Certyfikacji dla
Immunochemii College of American Pathologists (CAP), ponadto w celu uzyskania dalszych
informacji naleŜy sprawdzić Zapewnienie Jakości dla Badań Immunochemicznych, Zatwierdzone
Wskazówki CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for Immunochemistry, Approved Guideline
(24) oraz odsyłacz (25).
Tabela 8. Cel codziennej kontroli jakości
Rodzaj tkanki: utrwalona i
przeprowadzona identycznie jak
próbki pochodzące od pacjenta
*
Swoiste przeciwciało i drugie
przeciwciało
Nieswoiste przeciwciało* lub Buffer
Plus takie samo przeciwciało jak uŜyte
ze swoistym przeciwciałem
Kontrola dodatnia:
Tkanki lub komórki zawierające antygen
docelowy (mogą występować w tkankach
pacjenta). Idealna próba kontrolna jest
tkanką wykazującą słabo dodatni odczyn
i moŜliwie największą czułość na
utratę właściwości przez przeciwciała
lub antygeny.
Kontrola wszystkich etapów badania.
Weryfikacja odczynnika i procedur
stosowanych do odczynu białka HER2.
Kontrola ujemna:
Tkanki lub komórki z oczekiwanym
ujemnym wynikiem odczynu (mogą
występować w tkankach pacjenta lub
dodatniej kontroli tkankowej).
Detekcja niepoŜądanej reakcji krzyŜowej
przeciwciał z komórkami lub strukturami
komórkowymi.
Tkanka pochodząca od pacjenta.
Detekcja odczynu swoistego.
Preparat kontrolny dostarczony
przez Dako.
Wyłącznie odczyn z
preparatami kontrolnymi.
Surowica od tego samego gatunku i izotypu, co w przypadku przeciwciała pierwotnego, ale nie skierowana przeciwko temu
samemu antygenowi. Do wykrywania nieswoistego wiązania przeciwciał, tzn. wiązania fragmentu Fc przeciwciała przez tkankę.
Preparat kontrolny (w zestawie): KaŜdy z dostarczonych preparatów kontrolnych zawiera trzy
odwirowane, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka,
dające odczyny o nasileniu 0, 1+ i 3+. W kaŜdej serii naleŜy wykonać odczyn tylko na jednym
preparacie kontrolnym. Ocena linii komórkowych preparatów kontrolnych dostarczonych przez
Dako pozwala ustalić waŜność serii odczynów.
Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Preparaty kontrolne naleŜy sporządzić ze świeŜych
materiałów sekcyjnych, biopsyjnych lub chirurgicznych, moŜliwie szybko utrwalonych i zatopionych w
sposób analogiczny do próbki (próbek) pochodzących od pacjenta. Wynik dodatniej kontroli potwierdza
właściwe przygotowanie tkanek i prawidłową technikę barwienia. Dla wszystkich serii odczynów i dla
kaŜdego rodzaju warunków badania naleŜy uwzględnić jedną dodatnią kontrolę tkankową.
Tkanki stosowane jako dodatnie próby kontrolne powinny dawać słaby odczyn dodatni,
pozwalający na wykrywanie niewielkich zmian czułości przeciwciał pierwotnych. Preparaty
kontrolne dostarczane z opisywanym zestawem lub preparaty przeprowadzane w sposób
odmienny od próbek pochodzących od pacjenta pozwalają wyłącznie na weryfikację działania
odczynników; preparaty kontrolne nie nadają się do weryfikacji prawidłowego przygotowania
tkanek. Jako idealną kontrolę tkankową naleŜy zastosować tkankę z uprzednio oznaczoną
nadekspresją białka HER2 2+ gruczolakoraka Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 39/56
Rak Ŝołądka
UWAGA: Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu
monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a NIE pomocniczo do
formułowania swoistych rozpoznań próbek pochodzących od pacjentów. JeŜeli nie udaje się
potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach dodatnich kontroli tkankowych naleŜy uznać,
Ŝe wyniki preparatów pochodzących od pacjentów są niewaŜne.
Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: NaleŜy stosować ujemną kontrolę za pomocą tkanki
dającej odczyn ujemny, w której nie występują białka HER2. Dla kaŜdej serii odczynów tkanka
powinna zostać utrwalona, przeprowadzona i poddana zatapianiu w sposób identyczny do próbki
(próbek) pochodzącej od pacjenta, w celu weryfikacji swoistości przeciwciał pierwotnych i
identyfikacji swoistego odczynu tła. Tkankami odpowiednimi do ujemnej próby kontrolnej są tkanki
okręŜnicy, wątroby lub tarczycy. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŜna
wykorzystywać róŜne rodzaje komórek pochodzące z większości tkanek. Preparaty do kontroli
ujemnej powinny zostać zweryfikowane przez UŜytkownika.
uzyskane dla próbki pochodzącej od pacjenta naleŜy uznać za niewaŜne, a test naleŜy powtórzyć.
Nieswoisty odczynnik Negative Control Reagent: W celu oceny występowania odczynu
nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach występowania antygenów,
dla kaŜdego wycinka pochodzącego od pacjenta, w miejsce przeciwciał pierwotnych naleŜy
stosować odczynnik do kontroli ujemnej. Czas inkubacji odczynnika Negative Control Reagent
powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych.
Weryfikacja testu: Przed pierwszym uŜyciem przeciwciała lub systemu barwienia w procedurze
diagnostycznej, uŜytkownik powinien sprawdzić swoistość przeciwciała testując go na serii
posiadanych w laboratorium komórek o znanej charakterystyce działania immunocytochemicznego,
stanowiących tkanki kontroli dodatniej i ujemnej. NaleŜy zapoznać się z procedurami kontroli jakości
omówionymi wcześniej w tej sekcji ulotki oraz z wymaganiami określonymi w dokumentach CAP
Certification Program for Immunohistochemistry oraz CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for
Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). PowyŜsze procedury kontroli jakości naleŜy
powtarzać z kaŜdą nową partią przeciwciał i za kaŜdym razem, gdy wystąpi zmiana w parametrach
odczynu. Do weryfikacji testu odpowiednie są tkanki gruczolakoraka Ŝołądka, w tym połączenia
Ŝołądkowo-przełykowego, o znanej intensywności barwienia białka HER2 od 0 - 3+ oraz tkanki
ujemne, np. z okręŜnicy, wątroby lub tarczycy.
Interpretacja wyniku barwienia - Ŝołądek
Wykrywanie nadmiernej ekspresji białka HER2 powinno odbywać się wyłącznie w oparciu o
nasilenie odczynu błonowego, który naleŜy oceniać na podstawie skali przedstawionej w Tabeli 9.
Oceny preparatów powinien dokonywać patolog, posługując się mikroskopem świetlnym. W celu
oceny obecności i nasilenia odczynu immunohistochemicznego naleŜy stosować obiektyw
o powiększeniu 10x. Zastosowanie obiektywu o powiększeniu 5–40x jest korzystne dla
potwierdzenia wyniku. Odczyn cytoplazmatyczny naleŜy uznać za nieswoisty i nie naleŜy go brać
pod uwagę przy ocenie nasilenia odczynu błonowego (8). W rozróŜnianiu poziomów nasilenia 0,
1+, 2+ i 3+ pomocny jest wydany przez firmę Dako atlas „HercepTest™ Interpretation Manual –
Gastric Cancer” (Atlas interpretacji odczynów HercepTest™ - rak Ŝołądka), który zawiera obrazy
typowych wyników barwienia o róŜnej intensywności.
Oceniać naleŜy wyłącznie próbki pochodzące od chorych, u których występuje gruczolakorak
Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego. W przypadku metaplazji nabłonka Ŝołądka w
nabłonek jelitowy i gruczolakoraka Ŝołądka w tym samym preparacie, naleŜy oceniać tylko składnik
gruczolakoraka Ŝołądka. W przypadku interpretacji barwienia preparatów biopsyjnych metodą
HercepTest™ zaleca się skupisko co najmniej 5 wybarwionych komórek guza. Skupisko
przynajmniej 5 wybarwionych komórek guza składa się z 5 połączonych, wybarwionych
komórek guza.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 40/56
Rak Ŝołądka
Tabela 9. Interpretacja i ocena znakowania immunohistochemicznego HER2
Wynik
0
1+
2+
3+
Preparat chirurgiczny –
Wzór barwienia
Preparat biopsyjny –
Wzór barwienia
Ocena nadmiernej
ekspresji HER2
Brak reaktywności lub brak
reaktywności błonowej w < 10%
komórek guza
Brak reaktywności lub brak reaktywności
błonowej (lub w skupisku < 5 komórek) w
jakiejkolowiek komórce guza
Ujemny
Blada, ledwo rozpoznawalna
reaktywność błonowa w ≥ 10% komórek
guza; reaktywne są tylko fragmenty błon
poszczególnych komórek
Skupisko komórek (≥ 5 komórek) guza z
bladą, ledwo rozpoznawalną
reaktywnością błonową, niezaleŜnie od
odsetka wybarwionych komórek guza
Ujemny
Słaba/umiarkowana reaktywność na
całej powierzchni, na podstawnobocznych lub bocznych brzegach
błony w ≥ 10% komórek guza
Słaby/umiarkowany odczyn błonowy na
całej powierzchni, na podstawnobocznych lub bocznych brzegach
skupiska (≥ 5 komórek) komórek guza,
niezaleŜnie od odsetka wybarwionych
komórek guza
Niejednoznaczny
Silna reaktywność na całej powierzchni,
na podstawno-bocznych lub bocznych
brzegach błony w ≥ 10% komórek guza
Silny odczyn błonowy na całej
powierzchni, na podstawno-bocznych lub
bocznych brzegach skupiska (≥ 5
komórek) komórek guza, niezaleŜnie od
odsetka wybarwionych komórek guza
Dodatni
Wskazówki wg Hofmann i in. (40).
ujemny (odczyn o intensywności 0 i 1+), niejednoznaczny (2+) albo dodatni (3+). Pacjenci ani
lekarze nie powinni wykorzystywać wyników testu HercepTest™ jako podstawy do rokowania; test
HercepTest™ nie został zatwierdzony do takich zastosowań.
W kaŜdej serii preparaty naleŜy badać w kolejności podanej w Tabeli 10, co pozwoli na określenie
waŜności wyników z danej serii oraz półilościową ocenę nasilenia odczynu próbki tkankowej.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 41/56
Rak Ŝołądka
Tabela 10. Kolejność oceny szkiełek.
Kolejność odczytu preparatów
1.
Preparat kontrolny zawierający trzy linie komórkowe.
Uzasadnienie
Obecność 3+ brązowego zabarwienia błony komórkowej
(zabarwienie obwódkowe, rimming) w linii komórek
kontrolnych 3+ SK-BR-3, częściowe brązowe zabarwienie
obwódkowe w linii komórek kontrolnych 1+ MDA-175 oraz
brak zabarwienia w linii komórek kontrolnych 0 MDA-231
wskazuje, Ŝe test jest waŜny
Punktowe i nieciągłe wybarwienie nastąpiło w małej do
umiarkowanej liczbie komórek słabo dodatnich 1+ linii
komórek kontrolnych MDA-175. Ponadto w tej linii komórek
moŜna zaobserwować punktowe immunobarwienie ciałek
Golgiego cytoplazmy.
Obecność brązowego odczynu w kontrolnej linii komórkowej
0 MDA-231 (ujemnej w kierunku nadmiernej ekspresji
białka HER2) wskazuje na wystąpienie nieswoistego
odczynu. Wyniki testu mogą być niewaŜne w związku
z nadmiernym wybarwieniem.
2.
Preparat z tkanki do dodatniej próby kontrolnej.
Powinien być widoczny brązowy odczyn błonowy.
Wybarwienie cytoplazmy i tkanki ujemnej nie powinno
przekraczać 1+
3.
Preparat tkankowy do ujemnej próby kontrolnej.
BRAK odczynu swoistego w preparacie tkankowym do
kontroli ujemnej potwierdza brak reaktywności krzyŜowej
przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. Jeśli pojawi
się swoiste barwienie na Szkiełku Tkanki Kontroli Ujemnej,
wówczas wyniki próbki pacjentki naleŜy uwaŜać za niewaŜne.
4.
Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany
działaniu odczynnika Negative Control Reagent
Brak swoistego wybarwienia błony weryfikuje swoistość
znakowania docelowego antygenu przez pierwsze
przeciwciało.
Inne jasnobrązowe lub brązowe zabarwienie występujące
w cytoplazmie próbki poddanej działaniu odczynnika kontroli
ujemnej, np. w tkance łącznej, leukocytach, erytrocytach lub
tkance martwiczej naleŜy uwaŜać za nieswoiste barwienie
tła i naleŜy je podać w części przeznaczonej na uwagi
w arkuszu danych.
5.
Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany
działaniu przeciwciała pierwotnego
Jeśli wykryta jest nadekspresja białka HER2 w próbce,
będzie to widoczne jako brązowe zabarwienie obwódkowe
błony komórkowej komórek guza poddanych działaniu
pierwszego przeciwciała.
1. Preparat kontrolny (w zestawie): W pierwszej kolejności naleŜy zbadać preparat kontrolny
przebadany testem HercepTest™, aby upewnić się, Ŝe wszystkie odczynniki działają prawidłowo.
Obecność brązowego produktu reakcji (3,3’-diaminobenzydyny, DAB) na błonach komórkowych
świadczy o reaktywności dodatniej.
Obecność brązowego odczynu błonowego (na obwodzie) w kontrolnej linii komórkowej 3+ SK-BR-3,
brązowego odczynu na części obwodu w kontrolnej linii komórkowej 1+ MDA-175 oraz brak
odczynu w kontrolnej linii komórkowej 0 MDA-231 świadczy o prawidłowym przebiegu testu. Jeśli
którakolwiek z kontrolnych linii komórkowych nie spełnia powyŜszych kryteriów, wszystkie wyniki
uzyskane z próbek pochodzących od pacjentów naleŜy uznać za niewaŜne.
2. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Następnie naleŜy zbadać preparat dodatniej kontroli
tkankowej. Ten preparat słuŜy do potwierdzania skuteczności zastosowanej metody utrwalania i
procesu odmaskowania antygenu. Do interpretacji naleŜy wybierać jedynie komórki prawidłowe,
gdyŜ w komórkach z martwicą lub uszkodzonych często występują odczyny nieswoiste (26).
W komórkach nowotworu powinien występować brązowy odczyn błonowy. Nasilenie brązowego
odczyn cytoplazmatycznego w tkankach ujemnych nie powinno przekraczać wartości 1+.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 42/56
Rak Ŝołądka
3. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: Szkiełko z Tkanką Kontroli Ujemnej naleŜy badać po
tkance kontroli dodatniej, aby sprawdzić swoistość znakowania docelowego antygenu przez
pierwsze przeciwciało. Brak odczynu swoistego w preparacie tkankowym do kontroli ujemnej
potwierdza brak reaktywności krzyŜowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek.
uzyskane dla próbki pochodzącej od pacjenta naleŜy uznać za niewaŜne. W charakterze tkanki do
kontroli ujemnej moŜna równieŜ wykorzystać ujemne fragmenty preparatu tkankowego do kontroli
dodatniej, jednak w takim przypadku wymagana jest weryfikacja przeprowadzona przez
uŜytkownika. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe słabą reakcję (intensywność barwienia 0-1+) moŜna
zauwaŜyć w większości normalnych tkanek nabłonka. Do uŜycia w charakterze kontroli ujemnej
nadają się np. tkanki: okręŜnicy, wątroby i tarczycy.
Jeśli odczyn nieswoisty występuje, ma on charakter rozproszony (rozlany). W preparatach
tkanek poddawanych nadmiernemu utrwalaniu w formalinie moŜe niekiedy występować odczyn
w obrębie tkanki łącznej.
4 + 5. Tkanka pochodząca od pacjenta: Na końcu naleŜy zbadać próbki pochodzącej od
pacjenta, poddane działaniu testu HercepTest™. Intensywność odczynu dodatniego naleŜy
oceniać w kontekście nieswoistego odczynu tła występującego w próbce z odczynnikiem kontroli
ujemnej. Podobnie jak w kaŜdym badaniu immunocytochemicznym, wynik ujemny oznacza, Ŝe
antygen nie został wykryty, a nie Ŝe nie występował w badanych komórkach/tkankach. Konkretne
informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest™ moŜna znaleźć w sekcji
Streszczenie i wyjaśnienia, Ograniczenia oraz Charakterystyka wydajnościowa.
Dodatkowe zalecenia dotyczące interpretacji odczynu w teście HercepTest™
W testach gruczolakoraka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego badanych w
kierunku nadekspresji białka HER2, uzyskuje się wynik od 0 do 3+. W przypadkach oceny 0 i 3+
wynik jest bardzo jednoznaczny, jednak niewielki odsetek próbek z wynikiem 1+ i 2+ moŜe
nastręczać trudności interpretacyjnych. PoniŜej wymieniono wskazówki dotyczące interpretacji
odczynu w teście HercepTest™.
Ocenić kontrolne linie komórkowe w celu zweryfikowania działania testu.
Ocenić preparaty do kontroli dodatniej i ujemnej.
Przy pierwszej ocenie zaleca się wybarwienie preparatu tkankowego hematoksyliną i eozyną
(H+E). (Charakter nowotworowy moŜe nie być jednoznacznie widoczny w próbkach
wybarwionych testem HercepTest™. Szkiełko wybarwione H&E jest wymagane dla patologa,
abysprawdzić obecność guza.). Test HercepTest™ naleŜy wykonać na parze skrawków
(skrawki seryjne) z tego samego bloczku parafinowego próbki.
Skrawki, na których wykonano odczyn w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2, naleŜy
najpierw badać w małym powiększeniu. Większość przypadków dodatnich będzie ewidentnie
rozpoznawalna przy małym powiększeniu.
W przypadkach oceny 1+, w celu potwierdzenia odczynu błonowego naleŜy uŜyć 40-krotnego
powiększenia.
W przypadkach oceny 2+, w celu potwierdzenia odczynu błonowego naleŜy uŜyć 10-20-krotnego
powiększenia.
Preparaty chirurgiczne
Do ustalania odsetka dodatnich komórek nowotworowych naleŜy wykorzystać dobrze
zachowane i dobrze wybarwione obszary próbki.
Jeśli w większości komórek nowotworu występuje odczyn na całej błonie komórkowej, na
podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik wynosi 2+ lub 3+.
Jeśli w więcej niŜ 10% komórek nowotworowych występuje silny odczyn na całej błonie
komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik wynosi 3+.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 43/56
Rak Ŝołądka
Jeśli w więcej niŜ 10% komórek nowotworowych występuje słaby lub umiarkowany odczyn na
całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik dla
próbki wynosi 2+.
Jeśli w więcej niŜ 10% komórek nowotworowych w preparatach chirurgicznych, wybarwione są
tylko fragmenty błon poszczególnych komórek, mają bladą, ledwo rozpoznawalną
intensywność, to wynik dla próbki wynosi 1+.
Jeśli w mniej niŜ 10% komórek nowotworowych próbki pooperacyjnej występuje odczyn, to
niezaleŜnie od wzoru barwienia (np. na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub
bocznych jej brzegach), wynik dla próbki wynosi 0.
Jeśli nie obserwuje się barwienia, wynik dla próbki pooperacyjnej wynosi 0.
Preparaty biopsyjne
Skupisko przynajmniej 5 wybarwionych komórek guza składa się z 5 połączonych,
wybarwionych dla HER2 komórek guza.
Jeśli w skupisku co najmniej 5 komórkach nowotworu występuje silny odczyn na całej błonie
komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik wynosi 3+,
niezaleŜnie od odsetka wybarwionych komórek guza.
Jeśli w skupisku co najmniej 5 komórkach nowotworu występuje słaby lub umiarkowany odczyn
na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik
wynosi 2+, niezaleŜnie od odsetka wybarwionych komórek guza.
Jeśli w skupisku co najmniej 5 komórkach nowotworu występuje odczyn o bladej, ledwo
rozpoznawalnej intensywności i wybarwione są tylko fragmenty błon, to wynik wynosi 1+,
niezaleŜnie od odsetka wybarwionych komórek guza.
Jeśli w mniej niŜ 5 komórkach nowotworowych występuje brak odczynu lub odczynu
błonowego, to wynik dla próbki wynosi 0.
Ograniczenia - Ŝołądek
Ograniczenia ogólne
1. Immunocytochemia jest wieloetapową metodą diagnostyczną wymagającą specjalistycznego
przeszkolenia w doborze odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i
przeprowadzaniu, przygotowaniu preparatów do immunocytochemii i interpretacji
wyników barwienia.
2.
Wybarwienie tkanek jest uzaleŜnione od obróbki i przetworzenia tkanki przed wykonaniem
odczynu. Nieprawidłowe utrwalanie, zamraŜanie, rozmraŜanie, przemywanie, suszenie,
ogrzewanie lub zanieczyszczenie skrawków domieszką innych tkanek lub płynów moŜe
powodować artefakty, ukrycie przeciwciał lub wyniki fałszywie ujemne. Przyczyną sprzecznych
wyników moŜe być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub właściwości
zaleŜne od tkanek.
3.
Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŜe utrudniać prawidłową
interpretację wyników.
4.
Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być prowadzona w kontekście
objawów klinicznych, morfologicznych i innych kryteriów histopatologicznych. Interpretacja
kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez badania
morfologiczne, wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych i innych badań diagnostycznych.
Odpowiedzialność związana z interpretacją wybarwionego preparatu spoczywa na
wykwalifikowanym histopatologu, dysponującym doświadczeniem obejmującym stosowane
przeciwciała, odczynniki i metody. Barwienie naleŜy wykonać w akredytowanej pracowni
histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę
wybarwionych preparatów i właściwe wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 44/56
Rak Ŝołądka
5.
Tkanki pochodzące od osób z zakaŜeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające
antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać
nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową (27).
6.
W typach tkanek, które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą wykazywać
nieoczekiwane reakcje. Nie moŜna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji
w przetestowanych tkankach z uwagi na zmienność biologiczną ekspresji antygenów
w tkankach nowotworów i innych tkankach zmienionych chorobowo (28). W przypadku
udokumentowanych nieoczekiwanych reakcji naleŜy skontaktować się z Serwisem
Technicznym firmy Dako.
7.
Wiązanie białek lub produktów reakcji na drodze mechanizmów innych niŜ immunologiczne
moŜe być przyczyną wyników fałszywie dodatnich. Wyniki fałszywie dodatnie mogą równieŜ
wystąpić na skutek aktywności podobnej do peroksydazy (erytrocyty) i endogennej aktywności
peroksydazy (cytochromu C) (28).
8.
Procedurę barwienia naleŜy wykonywać w temperaturze pokojowej 20–25 °C.
Ograniczenia specyficzne dla produktu
1. Antygen obecny w linii komórkowej 1+, MDA-175, z czasem ulega rozkładowi. Odczyn
preparatu kontrolnego naleŜy oceniać w kontekście daty waŜności tego preparatu. Ujemny
odczyn komórek MDA-175 moŜe być jedynie objawem rozkładu preparatu. Szkiełka Control
Slide naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8 °C.
2.
Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu
w tkankach. Próbki naleŜy wybarwiać w ciągu 4-6 tygodni od zamontowania tkanek na
szkiełkach, jeŜeli są one przechowywane w temperaturze pokojowej (20–25 °C ) (29).
3.
JeŜeli tkanki są rutynowo utrwalane i zatapiane w parafinie (neutralna zbuforowana formalina),
dla uzyskiwania optymalnego i odtwarzalnego wyniku białko HER2 wymaga odzyskiwania
epitopu w podwyŜszonej temperaturze. Ta wstępna obróbka musi być zakończona na
początku całego procesu barwienia. Instrukcje podano w części „Przygotowanie Próbek,
Obróbka tkanek przed Barwieniem”
4.
Wzbudzane temperaturą odzyskiwanie epitopu białka HER2 naleŜy wykonywać wyłącznie w
skalibrowanej łaźni wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one
odtwarzalnych wyników.
5.
Nie wolno zastępować odczynników znajdujących się w zestawie odczynnikami posiadającymi
inne numery partii lub odczynnikami innych producentów. Jedynym wyjątkiem jest Wash
Buffer, który moŜna zastępować Dako Wash Buffer Nr kat. S3006.
6.
Ocena odczynu cytoplazmatycznego moŜe doprowadzić do uzyskania fałszywych wyników.
W interpretacji naleŜy brać pod uwagę wyłącznie nasilenie odczynu błonowego.
7.
Barwione preparaty kontrolne naleŜy stosować wyłącznie w celu weryfikacji wyników serii
odczynów, a nie w celu oceny odczynu w skrawkach tkankowych.
8.
MoŜliwe jest sporadyczne występowanie silnego (3+) odczynu ogniskowego. MoŜe to być
efektem nierównomiernego utrwalenia i/lub przetwarzania tkanki. Zaleca się wykonanie
odczynu drugiego bloczka tkanki z tej samej próbki.
9.
Nie zweryfikowano uŜycia testu HercepTest™ do próbek utrwalanych w środkach innych niŜ
obojętny roztwór buforowanej formaliny.
10. Uwaga: prawidłowy nabłonek migdałków i przełyku moŜe dawać odczyn o intensywności
dochodzącej do 2+.
11. NaleŜy unikać stosowania zmiaŜdŜonych próbek raka Ŝołądka i interpretacji przypadkowego
barwienia przy krawędzi preparatu biopsyjnego.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 45/56
Rak Ŝołądka
Charakterystyka przebiegu testu - Ŝołądek
Bezpieczeństwo i skuteczność metody przy uŜyciu preparatu trastuzumab (Herceptin™) zostało
wykazane w badaniach klinicznych (ToGA) (38, 39). Badanie zaprojektowano, jako otwarte,
randomizowane, wieloośrodkowe badanie fazy III, obejmujące pacjentów HER2-dodatnich, z
nieoperacyjnym, zaawansowanym miejscowo, nawracającym i/lub przerzutowym gruczolakorakiem
Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego. W badaniu ToGA, wynik HER2-dodatni
zdefiniowano jako dodatni wynik IHC (3+) (HercepTest™, Dako) i/lub dodatni wynik HER2 FISH
(HER2/CEN17 ≥ 2,0) (HER2 FISH pharmDx™ Kit, Dako). Wybrani losowo pacjenci byli poddawani
chemioterapii (preparatem 5-FU lub capecitabine oraz cisplatin) lub chemioterapii razem z
przyjmowaniem preparatu trastuzumab. Końcowym wynikiem badań był okres przeŜycia (OS).
W ramach badania, randomizacji poddano 594 pacjentów a 584 pacjentów otrzymało badany lek i
zostało ujętych w pełnym zestawie analiz (FAS). Wykazano, Ŝe statystyczne wyniki w przypadku
połączenia chemioterapii z preparatem trastuzumab były lepsze względem wyników samej
chemioterapii. Mediana OS wzrosła z 11,1 do 13,8 miesiąca (p=0,0046) ze współczynnikiem
ryzyka 0,74 (95 % CI: 0,60–0,91). Krzywą Kaplana-Meiera opisującą OS pokazano na Rysunku 1.
Prawdopodobieństwo przeŜycia
1,0
0,9
0,8
Test log-rank
P = 0,0046
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
11,1
Czas (miesiące)
13,8
Liczba próbek
Fluoro/Cisp
Tras/Fluoro/Cisp
Grupa leczonych
Fluoro/Cisp
Tras/Fluoro/Cisp
Rysunek 1. Krzywa Kaplana-Meiera opisująca OS (n=584).
Gdy dane stały się dostępne, wykonano wstępnie sprecyzowane analizy badanej podgrupy pod
kątem ich statusu HER2. Nowe dwie podgrupy HER2 zdefiniowano później w oparciu o
klasyfikację IHC:
Grupa 1 („grupa z niską
ekspresją HER2”):
Grupa 2 („grupa z wysoką
ekspresją HER2”):
(128030-001)
IHC 0/FISH+ oraz IHC 1+/FISH+ (n=131)
IHC 2+/FISH+ i IHC 3+ (FISH+ lub FISH- lub brak
wyniku FISH (n=446)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 46/56
Rak Ŝołądka
Późniejsze powtórzenie wyników analizy okresu przeŜycia (OS) w przypadku „grupy z wysoką
ekspresją HER2” (n=446) wykazało jeszcze większą przewagę metody połączonej. Mediana OS
dla grupy pacjentów przyjmujących chemioterapię oraz preparat trastuzumab wzrosła do 16,0
miesięcy w porównaniu z 11,8 miesiąca w przypadku pacjentów z samą chemioterapią.
Współczynnik ryzyka w przypadku tej metody obniŜył się do 0,65 (95 % CI: 0,51–0,83). Krzywe
Kaplana-Meiera opisujące OS dla „grupy z wysoką ekspresją HER2” są pokazane na Rysunku 2.
Prawdopodobieństwo przeŜycia
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
11,8
Czas (miesiące)
16,0
Liczba próbek
Fluoro/Cisp
Tras/Fluoro/Cisp
Grupa leczonych
Fluoro/Cisp
Tras/Fluoro/Cisp
Rysunek 2. Krzywe Kaplana-Meiera opisujące OS dla „grupy z wysoką ekspresją HER2” (n=446).
Badania ToGA wykazały, Ŝe połączenie metod testowych IHC i FISH ma znaczenie rokownicze
pod kątem wyników łączonej terapii chemioterapią i preparatem trastuzumab, jakkolwiek
późniejsza analiza statystyczna wydaje się wskazywać, Ŝe większe korzyści z jej zastosowania
odnoszą pacjenci o wyŜszej eksprecji białka HER2 (IHC2+/FISH+ i IHC3+). Otrzymane wyniki
wskazują, Ŝe białko jest punktem wyjścia dla preparatu trastuzumab. Więcej informacji na temat
badań ToGA moŜna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania Herceptin™.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 47/56
Rak Ŝołądka
Powtarzalność
Odtwarzalność wewnątrz testu: Powtarzalność w ramach jednej serii odczynów testowano w
jednym laboratorium na 11 próbkach dających róŜne odczyny w metodzie IHC. KaŜda próbka była
badana trzykrotnie. Odczyny wykonano metodą ręczną. Dla wszystkich próbek uzyskano 100%
powtarzalność wyników. Powtarzalność w ramach jednej serii odczynów testowano w jednym
laboratorium na 3 próbkach dających róŜne odczyny w metodzie IHC. KaŜda próbka była badana
trzykrotnie. Odczyny wykonywano metodą automatyczną. Dla wszystkich próbek uzyskano 100%
powtarzalność wyników.
Odtwarzalność pomiędzy seriami i laboratoriami: Analizę HercepTest™ 60 róŜnych próbek
raka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, uzyskanych podczas operacji lub
biopsji, przeprowadzonej w ciągu pięciu dni nienastępujących po sobie, w trzech róŜnych
ośrodkach. Wśród 60 próbek z badania rozkład trzech kategorii statusu HER2 był równomierny.
Sześciu patologów wykonało łącznie 2040 ocen HER2.
Zgodność wyników pomiędzy dniami badań (ujemny, wątpliwy, dodatni) wynosiła od 83,1% do
98,3%. W 47 z 60 moŜliwych porównań współczynnik zgodności wynosił przynajmniej 90,0%.
W Tabela 11, poszczególne przykłady porównań wyników badań pomiędzy dniami wskazują
średnią zgodność na poziomie 91,2%, 92,5% i 92,5% dla trzech ośrodków.
Pomiędzy ośrodkami uzyskano odpowiednio zgodność równą 82,7%, 75,0% i 88,0% przy
porównaniu parami (patrz tabela 12). Zgodnie z dokładnym testem Fishera, wyniki nie róŜniły się
pomiędzy ośrodkami.
Pomiędzy obserwatorami uzyskano odpowiednio zgodność równą 88,0%, 83,6% i 81,0% w trzech
ośrodkach (Tabela 13). Podsumowując, analiza HercepTest™ próbek raka Ŝołądka w trzech
ośrodkach wykazała wysoki poziom zgodności pomiędzy patologami, dniami badania, ośrodkami i
obserwatorami.
Tabela 11. Ogólna zgodność pomiędzy dniami w procentach - podzbiór 12 z 60 porównań
Obserwator 1
Ośrodek 1
Ośrodek 2
Ośrodek 3
1
Średnia
Obserwator 2
1
1
Zgodność
CI95 LL
Zgodność
CI95 LL
Dzień 2 a dzień 1
85,0
74,4
93,3
84,9
Dzień 3 a dzień 4
93,3
84,9
93,3
84,9
Dzień 1 a dzień 2
95,0
87,3
83,1
72,0
Dzień 3 a dzień 4
96,7
89,7
95,0
87,3
Dzień 1 a dzień 2
90,0
80,5
91,7
82,7
Dzień 3 a dzień 4
96,7
89,7
91,7
82,7
Zgodność
91,2
92,5
92,5
CI95 LL: 95% dolna granica przedziału ufności.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 48/56
Rak Ŝołądka
Tabela 12. Ogólna zgodność pomiędzy ośrodkami w procentach
1
Zgodność
CI95 LL1
Ośrodek 1 a
Dzień 1 a dzień 1
83,3
72,4
ośrodek 2
Dzień 2 a dzień 2
85,0
74,4
Dzień 3 a dzień 3
85,0
74,4
Dzień 4 a dzień 4
81,7
70,5
Dzień 5 a dzień 5
78,3
66,7
Ośrodek 1 a
Dzień 1 a dzień 1
80,0
68,6
ośrodek 3
Dzień 2 a dzień 2
73,3
61,2
Dzień 3 a dzień 3
78,3
66,7
Dzień 4 a dzień 4
68,3
55,9
Dzień 5 a dzień 5
75,0
63,0
Ośrodek 2 a
Dzień 1 a dzień 1
88,3
78,5
ośrodek 3
Dzień 2 a dzień 2
86,7
76,4
Dzień 3 a dzień 3
90,0
80,5
Dzień 4 a dzień 4
86,7
76,4
Dzień 5 a dzień 5
88,3
78,5
Średnia
zgodność
82,7
75,0
88,0
CI95 LL: Dolna granica przedziału ufności 95%.
Tabela 13. Ogólna zgodność pomiędzy obserwatorami w procentach
Ośrodek 1
Ośrodek 2
Ośrodek 3
1
1
Zgodność
CI 95 LL
Dzień 1
91,7
82,7
Dzień 2
91,7
82,7
Dzień 3
93,3
84,9
Dzień 4
83,3
72,4
Dzień 5
80,0
68,6
Dzień 1
86,4
76,0
Dzień 2
83,3
72,4
Dzień 3
83,3
72,4
Dzień 4
83,3
72,4
Dzień 5
81,7
70,5
Dzień 1
80,0
68,6
Dzień 2
78,3
66,7
Dzień 3
80,0
68,6
Dzień 4
78,3
66,7
Dzień 5
90,0
80,5
Średnia
zgodność
88,0
83,6
81,0
CI95 LL: Dolna granica przedziału ufności 95%.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 49/56
Rak Ŝołądka
Immunoreaktywność
W Tabeli 14 przedstawiono zbiorcze informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest™
z zalecanym panelem tkanek prawidłowych. Wszystkie tkanki zostały utrwalone w formalinie i
zatopione w parafinie oraz wybarwione testem HercepTest™ zgodnie z instrukcją podaną w ulotce
załączonej do opakowania.
Tabela 14. Zestawienie reaktywności testu HercepTest™ dla tkanek normalnych.
Rodzaj tkanki
(liczba testowanych przypadków)
Struktura wykazująca dodatni odczyn oraz rodzaj odczynu
Nadnerczowa (3)
Szpik kostny (3)
Mózgowa/móŜdŜkowa (3)
Mózgowa/mózgowa (3)
Piersiowa (3)
Szyjki macicy (3)
OkręŜnicy (3)
Przełyku (3)
Sercowa (3)
Nerkowa (3)
Brak
Brak
Brak
Brak
Gruczoł sutkowy (1 z 3 tkanek, (intensywność barwienia 1+)
Brak
Brak
Brak
Brak
Kanaliki rdzenia nerki (3 z 3 tkanek, 1 – 2+ w 5 – 50% komórek,
cytoplazmatyczny)
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Brak
Gruczoł sterczowy/przewody (3 z 3 tkanek, intensywność
barwienia 1+, 50% komórek, cytoplazmatyczny)
Brak
Brak
Gruczoły potowe (1 z 3 tkanek, 1+, 30% komórek,
cytoplazmatyczny)
Nabłonek walcowaty, powierzchnia (1 z 3 tkanek, intensywność
barwienia 2+, 25% komórek)
Brak
Nabłonek (1 z 3 tkanek, intensywność barwienia 1+, 25%
komórek)
Brak
Brak
Brak
Nabłonek płaski (3 z 3 tkanek, intensywność barwienia 1+, 80%
komórek)
Brak
W ątrobowa (3)
Płucna (3)
Komórek mezotelialnych (3)
Jajnikowa (3)
Trzustkowa (3)
Gruczołu przytarczycy (3)
Nerwu obwodowego (3)
Przysadkowa (3)
Prostaty (3)
Gruczołu ślinowego (3)
Mięśnia szkieletowego (3)
Skórna (3)
Jelita cienkiego (3)
Śledziony (3)
śołądkowa (3)
Jąder (3)
Grasicy (3)
Tarczycy (3)
Migdałków (3)
Maciczna (3)
O ile nie zaznaczono inaczej, we wszystkich tkankach stwierdzano odczyn błonowy. JeŜeli nie podano inaczej, wszystkie trzy próbki
kaŜdego typu tkanek miały taką samą intensywność barwienia.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 50/56
Rak Ŝołądka
Rozwiązywanie problemów - Ŝołądek
W celu uzyskania informacji o działaniach naprawczych naleŜy zapoznać się z wymienionym
wcześniej podręcznikiem firmy Dako (19) lub skontaktować z Działem Pomocy Technicznej firmy
Dako, aby poinformować o nietypowym wybarwieniu.
Problem
1. Brak barwienia
szkiełek
2. Słabe barwienie
szkiełek
(128030-001)
1a. Odczynniki nie zostały uŜyte w
prawidłowej kolejności
1a. Sprawdzić stosowanie
odczynników
1b. Azydek sodu w Wash Solution
1b. Zastosować świeŜy Wash Buffer
dostarczony w zestawie
1c. Nadmierne ogrzewanie
widocznej utraty
immunoreaktywności HER2.
1c. Pozostawić na powietrzu skrawki
Lub suszyć w temperaturze
37 °C przez noc albo suszy ć w
w piecu z regulacją temperatury
i równomiernym rozkładem
ciepła (17).
2a. Nieodpowiednie odzyskiwanie
epitopu
2a. Sprawdzić, czy Epitope Retrieval
Solution osiąga temperaturę
95–99 °C przez pełne 40 minut
oraz czy jest pozostawiony do
ostygnięcia przez dalsze 20 minut.
2b. Nieodpowiednie czasy inkubacji
odczynników
2b. Sprawdzić instrukcje odnośnie
procedury barwienia
2c. Zastosowana nieodpowiednia
metoda utrwalania
2c. Zapewnić, aby tkanka pacjentki
nie była nadmiernie utrwalona,
ani nie został uŜyty alternatywny
utrwalacz
2d. Nadmierne ogrzewanie
widocznej utraty
immunoreaktywności HER2
2d. Pozostawić na powietrzu skrawki
w piecu z regulacją temperatury i
równomiernym rozkładem
ciepła (17).
2e. Naniesiono niedostateczną
objętość odczynnika.
2e. Sprawdzić naniesioną objętość
odczynnika.
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 51/56
Rak Ŝołądka
Problem
3. Nadmierne
barwienie tła
szkiełek
3a. Parafina nie została całkowicie
usunięta
3a. UŜyć świeŜych roztworów
czyszczących oraz postępować
zgodnie z instrukcjami podanymi
w Części B.1
3b. Do zamontowania skrawków do
szkiełek uŜyto skrobiowych
substancji dodatkowych
3b. Unikać stosowania
zawierających skrobię dodatków
zwiększających przyczepność
skrawków do szkiełek
mikroskopowych. Wiele
substancji dodatkowych jest
immunoreaktywnych.
3c. Szkiełka nie zostały dokładnie
wypłukane
3c. Zastosować świeŜy roztwór dla
kąpieli buforowej i tryskawek.
3d. Skrawki wyschły podczas
procedury barwienia
3d. Zastosować komorę wilgotną.
Jednorazowo wycierać tylko trzy
do czterech szkiełek przed
nałoŜeniem odczynnika.
3e. Zastosowana nieodpowiednia
metoda utrwalania
3e. Stosować tylko zatwierdzone
środki utrwalające. Alternatywny
utrwalacz moŜe powodować
nadmierne barwienie tła.
3f.
3f.
Nieswoiste wiązanie
odczynników do tkanki
Sprawdzić metodę utrwalania
próbki i obecność martwicy
4. Tkanka odkleja się
od szkiełka
4a. Zastosowano nieprawidłowe
szkiełka
4a. Stosować silanizowane szkiełka,
takie jak Dako Silanized Slides,
Nr kat. S3003, szkiełka pokryte
SuperFrost Plus lub poli-L-lizyną
5. Nadmiernie silne
swoiste barwienie
5a. Zastosowana nieodpowiednia
metoda utrwalania
5a
5b. Zastosowanie nieprawidłowego
źródła ciepła dla odzyskiwania
epitopu np. wytwornica pary,
kuchenka mikrofalowa
lub autoklaw
5b. Zapewnić, aby tylko łaźnia
wodna była uŜywana podczas
etapu odzyskiwania epitopu.
5c. Zbyt długie okresy
inkubacji odczynników
5c. Sprawdzić instrukcje odnośnie
procedury barwienia
5d. Zastosowanie nieprawidłowego
roztworu przemywającego
5d. Stosować wyłącznie Wash Buffer
zalecany dla testu
(128030-001)
Zapewnić, aby były stosowane
tylko odpowiednie utrwalacze i
metody utrwalania
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 52/56
Rak Ŝołądka
Problem
6. Słabe barwienie
Szkiełka
kontrolnego z linią
komórek 1+
6a. Nieprawidłowo wykonana
procedura odzyskania epitopu
6a. Zanurzyć szkiełka we wstępnie
podgrzanym roztworze Epitope
Retrieval Solution. Doprowadzić
temperaturę Epitope Retrieval
Solution ponownie do 95–99 °C i
podgrzewać przez pełne 40 minut.
6b. Brak reakcji z SubstrateChromogen Solution (DAB)
6b. Zapewnić, aby zastosowano
pełne 10 minut inkubacji.
Zapewnić, aby tylko jedna kropla
DAB Chromogen została dodana
do 1 mL DAB Buffered Substrate
6c. Degeneracja szkiełka
kontrolnego
6c. Sprawdzić datę waŜności i
zestawu podane na zewnętrznej
części opakowania
7. Po ogrzaniu
roztworu Epitope
Retrieval Solution
pojawia się
zmętnienie.
7.
Po ogrzaniu roztworu pojawia
się zmętnienie.
7.
Jest to normalne zjawisko, które
nie ma wpływu na wynik
barwienia.
8
8.
Roztwór był nieprawidłowo
przechowywany lub jest
przeterminowany.
8.
Sprawdzić datę waŜności i
zestawu podane na zewnątrz
opakowania. Usunąć roztwór
Epitope Retrieval Solution.
Przy
przechowywaniu
(przed ogrzaniem)
roztwór Epitope
Retrieval Solution
jest mętny.
UWAGA: Jeśli problemu nie moŜna przypisać Ŝadnemu z powyŜszych powodów lub, gdy
sugerowane działanie naprawcze nie rozwiązuje problemu naleŜy skontaktować się z Serwisem
Technicznym firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy.
Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŜna znaleźć we
wspomnianym wcześniej podręczniku firmy Dako (19) (dostępny w firmie Dako), Atlasie
Immunohistologii (30) oraz Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor
Diagnosis (31).
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 53/56
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with
extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science
1985;230:1132-9.
King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbB-related gene in a human mammary
carcinoma. Science 1985;229:974-6.
Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbB-related protooncogene, c-erbB-2, is distinct
from the c-erbB-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland
adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:6497-501.
Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded
by the human c-erb-B-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319:230-4.
Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu
gene: an erbB-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor.
Science 1985;229:976-8.
Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor
receptor-related protein. Nature 1986;319:226-30.
Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185
encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45:457-61.
Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal
human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5:953-62.
Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbB-2 product
is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New
Biologist 1990;2:992-1003.
Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an antiHER2
p185
antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:4285-9.
Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185HER2 monoclonal antibody
has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor.
Mol Cell Biol 1989;9:1165-72.
Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human
tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37:255-63.
Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-HER2 antibody
(Herceptin™) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu
overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58:2825-31.
a. Medical Laboratories – Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003.
b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, 1992.
Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby
Company; 1980.
Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; 1981.
Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to
deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry
2008;6,119-22.
DakoCytomation California Inc., Data on file.
Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria,
California; 2009.
Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and
EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4:201-7.
"Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides",
Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health,
Rockville, MD, 1976.
"Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts." Center for Disease Control Manual
Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, 1976.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From
Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN
1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for
immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West
Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 54/56
25. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality
control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92:836-43.
26. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14:767-71.
27. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to
hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path
1980;73:626-32.
28. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech &
Histochem 1991; 66:194-9.
29. Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue
samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res
1994;54:2771-7.
30. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of
immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986:16-27.
31. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago:
Amer Soc Clin Pathol Press; 1986.
32. Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010 (in press).
33. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric
carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis
and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: 273-278.
34. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in
human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-HER2 antibody in a murine model. Int J
Oncol 2005; 27: 681-685.
35. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of
trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer
Chemother Pharmacol 2007; 59: 795-805.
36. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric
cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: 89-95.
37. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in
combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced
gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial.
Lancet 2010
38. Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric
Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global
screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556).
39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA
trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth
factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009).
40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring
system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52:797-805.
41. Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching
heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer.
Human Pathol 2012; 43;11: 2070-2079.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 55/56
Objaśnienie symboli
Kod serii
Piktogram GHS
(przestrzegać zaleceń
zawartych w części
dotyczącej środków
ostroŜności)
Nie rzucać, nie
przewracać
Stosować do
Piktogram GHS
(przestrzegać zaleceń
zawartych w części
dotyczącej środków
ostroŜności)
Zawiera ilość materiału
wystarczającą do <n>
badań.
Producent
Nr katalogowy
Ograniczenia
temperatury
Materiał medyczny
przeznaczony do badań
in vitro
Sprawdzić w instrukcji
uŜycia
Wyprodukowano przez:
Dystrybutor w USA:
Dako Denmark A/S
Produktionsvej 42
DK-2600 Glostrup
Dania
Tel. +45 44 85 95 00
Faks +45 44 85 95 95
Dako North America, Inc.
6392 Via Real,
Carpinteria, California 93013, USA
Tel. 805/566-6655,
Linia bezpłatna: 800/235-5743
Informacje nt. zamawiania:
Tel. 800/235-5763
Faks 805/566-6688
Wsparcie techniczne: Tel. 800/424-0021
HercepTest™ i Herceptin™ są znakami towarowymi firmy Genentech, Inc. i są wykorzystywane na licencji
udzielonej firmom Dako Denmark A/S oraz F. Hoffmann-La Roche Ltd.
(128030-001)
P04085PL_01/K520421-2/2015.05 s. 56/56

HercepTest

Transkrypt

Podobne dokumenty

Dako Mayer`s Hematoxylin (Lillie`s Modification)

RYNEK WŁAŚCIWY

Popularnonaukowy opis badań Chemio

Wiersz Nigdy więcej Józef Kuźba

kupon rabatowy

Wakacyjne zagro¿enia Czerwiec 2007

Oświadczenie od kiedy może nastapić zatrudnienie

7 grzechów glównychx

Dako Antibody Diluent with Background Reducing

Dako Ultramount Aqueous Permanent Mounting Medium