Pobierz dokument

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
(21) Numer zgłoszenia: 351774
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
(22) Data zgłoszenia: 18.01.2002
PL
199207
(13) B1
(11)
(51) Int.Cl.
C12N 9/28 (2006.01)
C12N 9/54 (2006.01)
C12R 1/225 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
C12Q 1/40 (2006.01)
Nowy szczep bakterii Bacillus subtilis
i sposób otrzymywania α-amylazy przy użyciu tego szczepu
(73) Uprawniony z patentu:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
Akademia Rolnicza,Lublin,PL
28.07.2003 BUP 15/03
(72) Twórca(y) wynalazku:
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
29.08.2008 WUP 08/08
PL 199207 B1
(57)
Kenneth Ogbonna Udeh,Lublin,PL
Zdzisław Targoński,Lublin,PL
α-amylaza otrzymywana jest na drodze fermentacji wgłębnej przy użyciu szczepu Bacillus subtilis KU3 KKP na pożywce produkcyjnej zawierającej produkty pochodzenia roślinnego oraz mineralnego, z jedoczesnym wstrząsaniem i napowietrzaniem, a po zakończeniu hodowli odwirowaniem powstałego płynu pohodowlanego. Produkt pochodzenia roślinnego stanowi miazga ziemniaczana lub/i
inne źródła skrobi, które mogą być w formie surowej lub/i modyfikowanej jak też suszone, hydrolizowane
lub/i niehydrolizowane. Wytworzona α-amylaza wykazuje optymalną aktywność dla pH = 5,5- 6,5 i dla
temperatury 65 - 75°C. Enzym ten hydrolizuje zarówno surową skrobię o niezmienionej formie naturalnych ziaren, natywną i modyfikowaną bez procesu kleikowania lub poddaną procesowi kleikowania.
Nowy szczep bakterii oznaczony KU3 został zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych, ZMT i B, IBPRS pod numerem KKP/200 9/p.
2
PL 199 207 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Bacillus subtilis i sposób otrzymywania
α-amylazy rozkładającej skrobię, zwłaszcza surową, przy użyciu tego szczepu.
Znanych jest na świecie wiele rodzajów mezofilnych drobnoustrojów, które mają zdolność do
syntezy na drodze hodowli wgłębnej lub powierzchniowej α-amylazy. Enzymy te są wykorzystywane
w procesach technologicznych w celu upłynniania i scukrzania skrobi modyfikowanych dla potrzeb
przemysłowych do produkcji na przykład glukozy i maltozy. Badania w tym kierunku były przeprowadzone od wielu lat i są dobrze udokumentowane. Obecnie, produkcja glukozy, maltozy i innych pochodnych oligosacharydów jest prowadzona w skali przemysłowej przy użyciu termostabilnych
α-amylaz, które są aktywne w temperaturze powyżej 60°C. Taki proces technologiczny zmniejsza
zakażenia, skraca czas reakcji enzymatycznych przy jednoczesnym obniżeniu stopnia polimeryzacji
D-glukozy do izomaltozy lub maltulozy. Zmienił się także sposób scukrzania skrobi przy użyciu
α-amylaz, gdyż dawniej proces przygotowania skrobi do obróbki enzymatycznej wymagał dużych nakładów energetycznych związanych z mieszaniem i ogrzewaniem jej do 100°C.
Istnieją α-amylazy rozkładające surową skrobię wytwarzane przez grzyby i bakterie. Większość
z nich nie znalazła zastosowań w przemyśle ze względu na to, iż wykazują optymalne aktywności
w niskiej temperaturze (35 - 50°C), są niestabilne, wymagają długotrwałej reakcji enzymatycznych
a także wykazują brak zdolności do rozkładu surowej skrobi o niezmienionej formie ziaren, w szczególności surowej skrobi ziemniaczanej (Starch 41,355-357, 1989; Biochem. J., 18, 980-986, 1996;
Starch 49, 295-296, 1997). Obecnie, termostabilne α-amylazy wykazujące aktywność powyżej 60°C
przy pH = 5,5-6,5 i mające zdolność do rozkładu surowej skrobi, w szczególności surowej skrobi
ziemniaczanej są poszukiwane w skali przemysłowej (Enzyme. Microb. Technol., 25, 433-438, 1999).
Dotychczas, opisane α-amylazy rozkładające surową skrobię nie hydrolizują surowej skrobi ziemniaczanej lub hydrolizują ją w małym stopniu (Carbohydr. Res., 304, 251-257, 1998). Ziemniaki obok
kukurydzy, są najważniejszymi źródłami skrobi na świecie. Pod tym względem, α-amylaza, która ma
dużą zdolność do rozkładu surowej skrobi ziemniaczanej ma potencjalną możliwość znalezienia zastosowania w skali przemysłowej. Opłacalność i atrakcyjność jej użycie w wielu gałęziach przemysłu
wiąże się ze znacznym zmniejszeniem kosztów scukrzania skrobi w stosunku do kosztów jakie występują przy zastosowaniu mezofilnych α-amylaz.
Znany jest sposób produkcji α-amylazy przy użyciu bakterii Bacillus subtilis na drodze hodowli
wgłębnej na naturalnych podłożach pochodzenia roślinnego. Preparat taki jest produkowany przez
spółkę PEKTOWIN z Jasła pod nazwą Amylogal CS. Preparat ten osiąga optymalną aktywność
w temperaturze 50 - 60°C, w odniesieniu do skrobi rozpuszczalnej i przy pH = 6.
Nowy szczep bakterii Bacillus subtilis oznaczono symbolem KU3 i zdeponowano w Instytucie
Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod nr KKP/2009/p. Szczep ten został
wyizolowany z Discorea esculantum (yam).
Istota sposobu otrzymywania α-amylazy na drodze fermentacji wgłębnej przy użyciu mikroorganizmu Bacillus subtilis na pożywce produkcyjnej zawierającej produkty pochodzenia roślinnego oraz
mineralnego, z jednoczesnym wstrząsaniem i napowietrzaniem, a po zakończeniu hodowli odwirowaniem powstałego płynu pohodowlanego, polega na tym, że jako mikroorganizm stosuje się nowy
szczep Bacillus subtilis KU3 KKP/2009/p, zaś produkt pochodzenia roślinnego stanowi miazga ziemniaczana lub/i inne źródła skrobi.
Innymi źródłami skrobi są zwłaszcza yam, manihot i zboża.
Produkty pochodzenia roślinnego korzystnie mogą być w formie surowej lub/i modyfikowanej
jak też suszone hydrolizowane lub/i nie hydrolizowane.
Ilość surowej miazgi ziemniaczanej oraz innych źródeł surowej skrobi korzystnie wynosi od 6,5
do 30% mokrej masy. Natomiast w przypadku użycia suszonych produktów pochodzenia roślinnego
ilość ta korzystnie wynosi od 0,5 do 3% wagowo, w przeliczeniu na skrobię.
Pożywka produkcyjna korzystnie zawiera związki azotu w ilości od 0,2 do 1,5% wagowo lub/i
inne źródła węgla w ilości od 0,5 do 3,0% wagowo.
Hodowlę produkcyjną korzystnie prowadzi się w przedziale temperatury od 28 do 50°C i przy
pH 5,5 do 7,5 w czasie 24-72 godzin.
Jako α-amylazę rozumie się zarówno preparat uzyskany bezpośrednio z hodowli, zawierający
α-amylazę wraz z mineralnymi i organicznymi zanieczyszczeniami jak i oczyszczoną już α-amylazę
uzyskaną po wytrąceniu acetonem bądź alkoholem w znany sposób.
PL 199 207 B1
3
W wyniku hodowli szczepu Bacillus subtilis KU3 na pożywce produkcyjnej uzyskuje się
α-amylazę, która hydrolizuje surową skrobię o niezmienionej formie ziaren i inne źródła skrobi. Dzięki
zastosowaniu tańszego substratu, enzym ten jest znacznie tańszy w porównaniu ze znanymi preparatami uzyskiwanymi z modyfikowanych skrobi lub maltozy (Carbohydr. Res.; 314, 251-257, 1998). Uzyskany preparat według wynalazku posiada właściwości biochemiczne umożliwiające jego zastosowaniu w przemyśle spożywczym do jednoczesnego upłynniania i scukrzenia w tych samych warunkach
łącznie z innymi preparatami na przykład z amyloglukozydazą. Wpływa to na istotne zmniejszenie
nakładów energetycznych związanych z kiełkowaniem skrobi, zmniejszenie ilości kwasów potrzebnych
do regulacji pH podczas tych procesów oraz zmniejszenie ilości nośników jonów wymiennych potrzebnych do procesów pozaukładowych.
P r z y k ł a d I.
W pierwszym etapie przygotowano skos agarowy zawierający skrobię rozpuszczalną - 0,5% wagowo, (NH4)2SO4 -0,1%, KH2PO4 -0,5%, CaCl2 -0,05%, FeSO4.7H2O -0,005%, MgSO4.7H2O -0,025%,
ekstrakt drożdżowy -0,5%. Następnie skorygowano pH do 6,0, po czym poddano go sterylizacji. Tak przygotowane skosy zaszczepiono komórkami Bacillus sp. KU 3 i umieszczono w termostacie na 24 godzin
w temperaturze 30°C.
Tak uzyskane komórki zaszczepiono na wysterylizowaną i ostudzoną pożywkę posiewową o pH
= 6,0-6,5, umieszczoną w stożkowych kolbach. Pożywka posiewowa zawierała skrobię rozpuszczalną
- 0,5%, (NH4)2SO4 -0,1%, KH2PO4 -0,5%, CaCl2 -0,05%, FeSO4.7H2O -0,005%, MgSO4.7H2O -0,025%,
ekstrakt drożdżowy -0,5%. Posiewową hodowlę prowadzono na wytrząsarce przez 24 godziny
w temperaturze 45°C.
Natomiast do hodowli produkcyjnej użyto pożywkę o następującym składzie: suszona mielona
miazga ziemniaczana -2%, (NH4)2SO4 -0,16%, KH2PO4 -0,05%, CaCl2 -0,033%, FeSO4.7H2O -0,0016%,
MgSO4.7H2O -0,033%, MnSO4.H2O -0,00016%, ekstrakt drożdżowy -0,2%, polypepton -0,4%. Następnie skorygowano pH pożywki do 6,0-6,5, po czym poddano ją sterylizacji. Po sterylizacji ostudzeniu, pożywkę produkcyjną zaszczepiono hodowlą posiewową w ilości 1% i prowadzono hodowlę produkcyjną przez 48 godzin na wytrząsarce w znany sposób w temperaturze 45°C.
Po zakończeniu procesu biosyntezy uzyskany płyn pohodowlany wirowano przy 6000 x g
w temperaturze pokojowej. W uzyskanym filtracie stwierdzono obecność α-amylaz. Zgodnie z metodą
SDS PAGE stwierdzono obecność trzech prążków białek α-amylaz o masie cząsteczkowej 46,49,
51,25 i 67,3 KDa.
Aktywności objętościowe i specyficzne uzyskanego enzymu wyniosły odpowiednio 7535,0-7545,0
nkat/ml i 13289,24-13668,45 nkat/mg białka. Wytworzona α-amylaza wykazuje aktywność w przedziale pH 4,0 do 8,0 i dla temperatury od 40 do 90°C, przy czym optymalne warunki działania enzymu
przypadają dla pH = 5,5-6,5, dla temperatury 65-75°C. Enzym ten hydrolizuje zarówno surową skrobię
o niezmienionej formie naturalnych ziaren, natywną i modyfikowaną bez procesu kiełkowania lub poddaną procesowi kiełkowania.
Uzyskany enzym w ilości odpowiadającej 3334 nkat użyto do hydrolizy 200 mg surowej skrobi
3
2+
3
w 20 cm 50 mM buforu octanowego, zawierającego 5mM Ca oraz 0,2 cm toluenu, w temperaturze
55°C przy pH 5,5 w czasie 24 godzin, mieszając przy 200 rpm. Hydrolizie uległo co najmniej 90%
surowej skrobi o niezmienionej formie naturalnych ziaren do dekstryny, w tym uzyskano około 53%
cukrów redukujących w postaci glukozy, maltozy i maltotriozy. Charakterystykę działania uzyskanej
α-amylazy w zależności od wartości pH i temperatury pokazują tabele 1 i 2.
P r z y k ł a d II.
Do hodowli produkcyjnej użyto komórek uzyskanych z hodowli posiewowej jak w Przykładzie I.
Natomiast do hodowli produkcyjnej użyto surowej skrobi w ilości 1%, którą wcześniej poddano
sterylizacji na sucho w temperaturze 105°C przez dwie godziny. Następnie substrat ten dodano do
uprzednio przygotowanej, wysterylizowanej i ostudzonej pożywki o składzie: (NH4)2SO4 -0,16%, KH2PO4
-0,05%, CaCl2 -0,033%, FeSO4.7H2O -0,0016%, MgSO4.7H2O -0,033%, MnSO4.H2O -0,00016%, ekstrakt drożdżowy -0,2%, polypepton -0,4%. Następnie pożywkę produkcyjną o pH = 6,0-6,5 zaszczepiono
hodowlą posiewową w ilości 1% i prowadzono hodowlę produkcyjną przez 48 godzin na wytrząsarce
w znany sposób w temperaturze 45°C. Dalsze postępowanie prowadzono jak w Przykładzie I.
Aktywności objętościowe i specyficzne uzyskanego enzymu wyniosły odpowiednio 3115,5 - 3119,6
nkat/ml i 6423,2 - 6464,8 nkat/mg białka. Wytworzona α-amylaza wykazuje aktywność w przedziale
pH 4,0 do 8,0 i dla temperatury od 40 do 90°C, przy czym optymalne warunki działania enzymu przypadają dla pH= 5,5-6,5, dla temperatury 65-75 C. Enzym ten hydrolizuje zarówno surową skrobię
4
PL 199 207 B1
o niezmienionej formie naturalnych ziaren, natywną jak i modyfikowaną poddaną wcześniej procesowi
kiełkowania lub nie.
Tabela 1
Wpływ wartości pH na aktywność α-amylazy
Wartość pH
Aktywność w %
4,0
22,5
5,0
95,8
6,0
100
7,0
57,2
8,0
12,7
Tabela 2
Wpływ wartości temperatury na aktywność α-amylazy
Wartość temperatury °C
Aktywność w %
40,0
38,0
50,0
55,0
60,0
80,0
65,0
90,0
70,0
100,0
75,0
92,0
80,0
45,0
90,0
22,12
Zastrzeżenia patentowe
1. Nowy szczep bakterii Bacillus subtilis KU3 KKP/2009/p.
2. Sposób otrzymywania α-amylazy na drodze fermentacji wgłębnej przy użyciu mikroorganizmu Bacillus subtilis na pożywce produkcyjnej zawierającej produkty pochodzenia roślinnego oraz
mineralnego, z jednoczesnym wstrząsaniem i napowietrzaniem, a po zakończeniu hodowli odwirowaniem powstałego płynu pohodowlanego, znamienny tym, że jako mikroorganizm stosuje się nowy
szczep Bacillus subtilis KU3 KKP/2009/p, zaś produkt pochodzenia roślinnego stanowi miazga ziemniaczana lub/i inne źródło skrobi.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że produkty pochodzenia roślinnego mogą być
w formie surowej lub/i modyfikowanej jak też suszone, hydrolizowane lub/i nie hydrolizowane.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ilość surowej miazgi ziemniaczanej oraz innych
źródeł surowej skrobi wynosi od 6,5 do 30% mokrej masy.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ilość suszonych produktów pochodzenia roślinnego wynosi od 0,5 do 3% wagowo, w przeliczeniu na skrobię.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że pożywka produkcyjna zawiera związki azotu
w ilości od 0,2 do 1,5% wagowo.
7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że pożywka produkcyjna zawiera inne źródła węgla w ilości od 0,5 do 3,0% wagowo.
8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że hodowlę produkcyjną prowadzi się w przedziale temperatury od 28 do 50°C i przy pH 5,5 do 7,5 w czasie 24-72 godzin.
Departament Wydawnictw UP RP
Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.