Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding

Monoclonal Mouse
Anti-Human
Octamer-Binding Transcription Factor 3/4
Clone N1NK
Nr kat. M3649
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Preparat Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding Transcription Factor 3/4, Clone N1NK jest
przeznaczony do stosowania w immunohistochemii. Przeciwciała przeciwko czynnikowi transkrypcji sekwencji
oktamerowej 3/4 (Oct3/4) znajdują zastosowanie w identyfikacji określonych podtypów guzów zarodkowych, w tym
nasieniaka, raka zarodkowego oraz niesklasyfikowanej wewnątrzprzewodowej neoplazji komórek zarodkowych
(IGCNU) (1-4). Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania
morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez
doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
Białko wiąŜące sekwencję oktamerową 3 (Oct3), czynnik transkrypcji sekwencji oktamerowej 3 (Otf3), białko
wiąŜące sekwencję oktamerową 4 (Oct4), czynnik transkrypcji sekwencji oktamerowej 4 (Otf4), POU5F1 (1-3, 5,
6).
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Alternatywny splicing powoduje powstanie dwóch wariantów mRNA ludzkiego genu Oct4 zlokalizowanego na
chromosomie 6, zwanych pierwotnie Oct3A oraz Oct3B (7), które ostatecznie przyjęły nazwę Oct3/4. Izoformy
Oct3A i Oct3B składają się odpowiednio z 360 i 265 aminokwasów, z których 225, zlokalizowanych w obrębie Ckońca sekwencji, jest identycznych. Czynnik Oct3/4 naleŜy do rodziny czynników transkrypcji POU (Pit-Oct-Unc)
aktywujących ekspresję swoich genów docelowych przez wiązanie sekwencji oktamerowej AGTCAAAT (6). Oct3/4
ulega ekspresji w komórkach embrionalnych oraz komórkach zarodkowych (1) i pełni kluczową rolę w układzie
regulacji transkrypcyjnej odpowiedzialnym za samoodnowę, zdolność do wielokierunkowego róŜnicowania się, a
takŜe przynaleŜność do linii embrionalnych komórek macierzystych oraz komórek macierzystych ze zdolnością do
wielokierunkowego róŜnicowania się (5). Ekspresja Oct3/4 występuje równieŜ w określonych podtypach guzów
zarodkowych, takich jak nasieniaki, rozrodczaki, dysgerminoma, rak zarodkowy, komórki zarodkowe
gonadoblastomów oraz IGCNU (1, 2, 4).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC.
Odczynnik
dostarczony
Mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci nadsączu hodowli komórkowej w buforze Tris-HCl o
stęŜeniu 0,05 mol/l, zawierającym azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/l, o pH 7,2. Produkt zawiera białko
stabilizujące.
Klon: N1NK. Izotyp: IgG1.
StęŜenie mysich lgG [mg/L]: Patrz informacja podana na etykiecie fiolki.
StęŜenie białek w róŜnych partiach moŜe się róŜnić bez wpływu na rozcieńczenie optymalne. W celu zapewnienia
jednolitości odczynów immunohistochemicznych wykonywanych przy uŜyciu róŜnych partii produktu, miano kaŜdej
partii jest porównywane i dostosowywane do partii referencyjnej.
Immunogen
Białko rekombinowane odpowiadające 147 aminokwasom na N-końcu ludzkiego białka Oct3/4.
Swoistość
W testach Western blot lizatów komórkowych hES-TW1 przeciwciało anty-Oct3/4, klon N1NK, rozpoznaje pasmo o
masie cząsteczkowej ok. 40 kDa odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej białka Oct3/4 (8).
Środki ostroŜności
1.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
2.
Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych
azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w
kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
(123641-001)
P02766PL_002/2013.08 p. 1/4
Przechowywanie
Skrócona instrukcja
uŜytkownika*
Przechowywać w temperaturze 2-8°C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego na
fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne.
W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
Krok
Komentarze
Utrwalanie
Obróbka wstępna
Formalina
EnVision FLEX™, High pH (nr kat. K8004)
ND
20 min HIER, 3 w 1 z uŜyciem PT Link
i PT Link Rinse Station
Rozcieńczenie
1:50
Inkubacja 20 min
Bufor do
rozcieńczania
Dako Antibody Diluent (nr kat. S0809).
Rozcieńczyć bezpośrednio przed
uŜyciem
Kontrola ujemna
Negative Control, Mouse IgG1 (nr kat. X0931)
Inkubacja 20 min
Wizualizacja
EnVision™ FLEX+, High pH (nr kat.
K8002/K8012)
Inkubacja 20 min, inkubacja w
odczynniku Mouse (LINKER) 15 min,
inkubacja w odczynniku DAB+ 2x5 min
Barwnik
kontrastowy
Tkanka kontrolna
EnVision™ FLEX Hematoxylin (nr kat.
K8008/K8018)
Nasieniak
Inkubacja 5 min
Szkiełka
FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020)
Zaleca się stosowanie w celu
uzyskania lepszego przylegania
skrawków tkankowych do szkiełek.
Zatapianie
preparatu
Wymagane niewodne, trwałe zatapianie
preparatów
Po przeprowadzeniu barwienia,
skrawki muszą być odwodnione,
oczyszczone i zakryte za pomocą
środka do trwałego zatapiania.
Oprzyrządowanie
Autostainer Link 48 i Autostainer Plus
NaleŜy stosować fiolki dostosowane do
aparatu (nr kat. SK200-SK203 i S3425)
Odczyn jądrowy Odczyn
cytoplazmatyczny w obecności silnego
odczynu jądrowego jest akceptowalny.
*UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje
przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem.
Przygotowanie
próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków
zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm.
Obróbka wstępna: Wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej
obróbki HIER tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat.
K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie antygenu (HIER) moŜna przeprowadzić z
uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT
Link (PT Link User Guide). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące parametry: Temperatura
ogrzewania wstępnego: 65°C; temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97° C przez 20 (±1) minut; ochłodzić
do 65°C. Wyj ąć stojak na szkiełka ze zbiornika PT i niezwłocznie zanurzyć szkiełka w słoju lub zbiorniku (np.
PTLinkRinseStation, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision™ FLEXWashBuffer (20x) (nr kat.
K8007) w temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1-5 minut.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być
odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
(123641-001)
P02766PL_002/2013.08 p. 2/4
Procedura barwienia
Rozcieńczenie: Zalecane rozcieńczenie preparatu Monoclonal Mouse Anti-Human Octamer-Binding Transcription
Factor 3/4, Clone N1NK, nt. kat. M3649 wynosi 1:50. NaleŜy rozcieńczyć przeciwciało w odczynniku Dako
Antibody Diluent (nr kat. S0809). Skrawki tkanek poddane wstępnej obróbce naleŜy inkubować przez 20 minut w
temperaturze pokojowej. Są to jednak wyłącznie wytyczne. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od
rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być zatwierdzone indywidualnie w kaŜdym laboratorium.
Kontrola ujemna: Zalecana kontrola ujemna to odczynnik Dako Negative Control, Mouse IgG1 (nr kat. X0931)
rozcieńczony do tego samego stęŜenia Ig, co przeciwciało pierwotne. O ile nie potwierdzono stabilności
rozcieńczonych przeciwciał i kontroli ujemnej w rzeczywistej procedurze wykonania odczynu, naleŜy rozcieńczyć
te odczynniki bezpośrednio przed uŜyciem. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów
naleŜy wykonywać pozytywne i negatywne próby kontrolne.
Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, High pH (nr kat. K8002/K8012) łącznie z
EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (nr kat. K8021/K8022) przy stosowaniu trwającego 20 minut okresu inkubacji
w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji EnVision FLEX+ Mouse (LINKER) (nr kat. K8021/K8022) wynosi 15
minut w temperaturze pokojowej. Postępować zgodnie z procedurą dostarczoną z wybranymi systemami do
wizualizacji.
Automatyzacja: Przeciwciała dobrze nadają się do wykonywania odczynów immunohistochemicznych w
systemach zautomatyzowanych, takich jak Dako Autostainer, Autostainer Plus oraz Autostainer Link, a takŜe PT
Link do obróbki wstępnej.
Barwienie kontrastowe: Zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (nr
kat. K8008/K8018). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka
do zatapiania.
Kontrole: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać pozytywne i
negatywne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować
nasieniaka lub raka zarodkowego, natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji, taki jak
opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Interpretacja
wybarwienia
Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Rozsiany odczyn cytoplazmatyczny w obecności silnego odczynu jądrowego
jest akceptowalny.
Charakterystyka
działania
Tkanki prawidłowe:
Przeciwciała anty-Oct3/4 nie wykazywały reaktywności w jądrze komórkowym w Ŝadnej z przebadanych
prawidłowych tkanek (9).
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Nadnercza (3)
Szpik kostny (3)
Gruczoły sutkowe (3)
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
Składniki tkankowe dające
dodatni odczyn
0/3
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Trzustka (3)
Przytarczyce (3)
Przysadka mózgowa
(3)
Gruczoł krokowy (3)
MóŜdŜek (3)
Mózgowie (3)
0/3
Ślinianki (3)
0/3
Szyjka macicy (3)
0/3
Mięśnie szkieletowe
0/3
Jelito grube (3)
0/3
Skóra (3)
0/3
Przełyk (3)
0/3
Jelito cienkie (3)
0/3
Serce (3)
0/3
Śledziona (3)
0/3
Nerki (3)
0/3
śołądek (3)
0/3
Wątroba (3)
0/3
Jądra (3)
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
Płuca (3)
0/3
Grasica (3)
0/3
Komórki
międzybłonka (3)
Nerwy obwodowe (3)
0/3
Tarczyca (3)
0/3
0/3
Migdałki (3)
0/3
Jajniki (3)
0/3
Macica (3)
0/3
Uwaga: zaobserwowano słabo dodatni odczyn immunohistochemiczny w cytoplazmie komórek nabłonka w 3
róŜnych prawidłowych typach tkanek. Składniki wykazujące reakcję obejmują komórki nabłonkowe jądra (2/3),
Ŝołądka (1/3) oraz jelita cienkiego (2/3). Słabo dodatni odczyn był obecny w części komórek nabłonkowych jądra
(10-20%), Ŝołądka (50%) i jelita cienkiego (20%).
(123641-001)
P02766PL_002/2013.08 p. 3/4
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Cheng L. Establishing a germ cell origin for metastatic tumors using OCT4 immunohistochemistry. Cancer
2004;101:2006-10.
Jones TD, Ulbright TM, Eble JN, Cheng L. OCT4: A sensitive and specific biomarker for intratubular germ cell
neoplasia of the testis. Clin Cancer Res 2004;10:8544-47.
Ulbright TM. Germ cell tumors of the gonads: a selective review emphasizing problems in differential
diagnosis, newly appreciated, and controversial issues. Modern Path 2005;18:S61-79
Hoei-Hansen CE, Kraggerud SM, Abeler VM, Karen J, Meyts ERD, Lothe RA. Ovarian dysgerminoma are
characterised by frequent KIT mutations and abundant expression of pluripotency markers. Molecular Cancer
2007;6:12
Bhartiya D, Kasiviswanathan S, Unni SK, Pethe P, Dhabalia J, Patwardhan S i inni Newer insights into
premeiotic development of germ cells in adult human testis using Oct-4 as a stem cell marker. J Histochem
Cytochem 2010;58:1093-1106.
Pan GJ, Chang ZY, Pei D. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res 2002;12:321-9.
Takeda J, Seino S, Bell GI. Human Oct3 gene family: cDNA sequences, alternative splicing, gene
organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult tissues. Nucleic Acids Res
1992;20:4613–20.
Yu J. Mouse Monoclonal Anti-Oct3/4: A test of the specificity of Anti-Oct3/4 clone N1NK by Western blotting.
2013;D15899.
Yu J. Report of normal tissue immunohistochemical testing using mouse anti-human Octamer-binding
transcription factor (Oct3/4), Clone N1NK. 2013;D13564.
Wydanie 08/13
(123641-001)
P02766PL_002/2013.08 p. 4/4