Badania zależno - Wydział Chemiczny Politechniki Warszawskiej

POLITECHNIKA WARSZAWSKA
WYDZIAŁ CHEMICZNY
ul. Noakowskiego 3
00-664 Warszawa
tel.: (22) 6213115;(22) 234 7461
fax: (22) 6282741
E-mail: [email protected]
Prof. zw. dr hab. inż. Urszula Domańska-Żelazna
Warszawa, dn. 1 sierpnia 2015 r.
Ocena rozprawy doktorskiej mgr inż. Anny Wiśniewskiej na temat
„Badania zależności struktura chemiczna-aktywność biologiczna grupy
cieczy jonowych o działaniu przeciwdrobnoustrojowym”
Praca doktorska Pani mgr inż. Anny Wiśniewskiej stanowi wycinek obszernych
badań nad chemią i zastosowaniami technologicznymi cieczy jonowych, w tym w
kierunku biologicznym, zapoczątkowanych przez Prof. dr hab. Juliusza Pernaka z
Politechniki Poznańskiej wiele lat temu.
Celem recenzowanej pracy było opracowanie syntezy i synteza nowych cieczy
jonowych o charakterze przeciwbakteryjnym, identyfikacja związków otrzymanych i
badania czystości, zbadanie ich podstawowych właściwości fizyko-chemicznych, w tym
współczynnik ka podziału oktanol/woda, badania w kierunku niszczenia drobnoustrojów
oraz badania krystalograficzne wybranego związku. Otrzymano 9 nowych związków z
anionem organicznym-migdalany oraz kationem amoniowym o różnych podstawnikach, z
czego większość stanowiły nowe ciecze jonowe. Zbadano ich podstawowe właściwości
fizyczne, spektroskopowe, chemiczne i biologiczne. Wyznaczono doświadczalnie i
obliczeniowo współczynniki podziału oktanol/woda, chromatograficzny współczynnik
podziału, log kw, oraz log kIAM, na kolumnach HPLC imitujących błonę komórkową.
Badano aktywność przeciwustrojową wobec 10 szczepów bakterii i 2 szczepów grzybów
w formie MIC (minimalne stężenie związku aktywnego, które powoduje zahamowanie
rozwoju organizmu testowego) oraz MBC (minimalne stężenie związku, które powoduje
śmierć organizmu testowego). Przeprowadzono badania rentgenostrukturalne dla związku
C16 (migdalanu benzylodimetyloheksadecyloamoniowego). Wykonano analizę zależności
pomiędzy strukturą a aktywnością biologiczną programem QSAR.
Praca doktorska zawiera część teoretyczną, opisową z wnikliwym przeglądem
literatury w dziedzinie cieczy jonowych i ich zastosowań, głównie w syntezie (31 stron),
opis badań własnych z wynikami (45 stron), część doświadczalną (13 stron),
1
podsumowanie i wnioski (4 strony) oraz obszerną bibliografię, zawierającą 186 pozycji.
Ponadto przedstawiono spis rysunków, spis tabel oraz załączniki do pracy
eksperymentalnej (25 stron).
Dobrze napisany wstęp teoretyczny obejmuje trzy główne rozdziały poświęcone
kolejno:
 opisowi cieczy jonowych, kationów i anionów; opisowi syntez; przeglądowi
dotychczasowych badań, zastosowaniom cieczy jonowych chemii, zastosowaniu
w reakcjach katalitycznych;
 badaniom aktywności biologicznej cieczy jonowych, jej istoty, historii związków,
strukturze, możliwości zastosowań w chemii gospodarczej, w ochronie drewna, w
medycynie, barwnikach i herbicydach;
 wnikliwej analizie zastosowań metod obliczeniowych QSAR (Quantitative
Structure Activity Relationship) i zastosowaniu jak wyżej w projektowaniu
związków aktywnych biologicznie.
Część opisowa badań własnych zawiera:
 Opis badanych związków wyjściowych.
 Krótki opis syntezy czwartorzędowych soli amoniowych, oraz nieco odmienną
syntezę migdalanu benzetoniowego.
 Opis zastosowanych metod badawczych, opisujących czystość, takich jak: analiza
elementarna, spektroskopia 1H NMR i
13
C NMR w cieczy, badanie zawartości
wody, badanie lipofilowości, czyli współczynnika podziału oktanol/woda, log P,
oraz log kw, oraz log kIAM, badania biologiczne minimalnego stężenia hamującego
wzrost wzorcowych szczepów bakterii i grzybów (MIC) oraz stężenia biobójczego
(MBC).
 Opis metod QSAR.
Część teoretyczna wprowadza w zagadnienia budowy związków badanych i
przedstawia wnikliwy przegląd dotychczasowych osiągnięć zarówno pod względem
syntezy jak i właściwości fizykochemicznych, struktury, toksyczności i możliwych
zastosowań w różnych dziedzinach techniki i biotechnologii ze wskazaniem na wiele
prac zespołu Prof. J. Pernaka. W tej części pracy omówiono również niezwykle
pomocny w określeniu ważności celu przeprowadzonych badań przegląd zastosowań
użytych i podobnych związków w badaniach biologicznych, w syntezie organicznej i
2
w medycynie. Niestety w większości opis dotyczy cieczy imidazoliowych, bo
początkowo głównie takie były badane na świecie.
Część ta przedstawia również związki, stosowane do ochrony drewna przed
grzybami. Niezwykle ciekawy jest opis zastosowań biologicznych jako związków z
anionem herbicydowym. Dzięki znikomej prężności par, herbicydowe ciecze jonowe
w przeciwieństwie do tradycyjnych związków estrowych nie są zagrożeniem dla
człowieka i dla sąsiednich upraw. Medycyna jest oddzielnym zagadnieniem-ciecze
jonowe w perspektywie mają być wykorzystywane jako nowe odmiany popularnych
leków z lepszym smakiem, lepszym wchłanianiem się do organizmu.
Wśród zastosowań omówiono reakcje katalityczne, w tym w reakcji DielsaAldera, w reakcjach katalizy przeniesienia międzyfazowego ze wspomnieniem
pierwszych reakcji Prof. M. Mąkoszy, w reakcjach Suzuki poprawiając wydajność i
skracając czas reakcji, w nowych syntezach związków heterocyklicznych t.j. piranów,
pirydyn. Opisano zastosowania w chemii polimerów-syntezy poliestru i wiele innych.
Wartym podkreślenia jest, że cytowano również prace wprowadzonych do
produkcji zastosowań cieczy jonowych, t.j. BASIL syntezy dialkoksyfenylofosfin, czy
BP Chemicals produkcji etylobenzenu.
Dużą uwagę poświęcono dotychczasowym związkom benzalkoniowym, ich
syntezie
i
zastosowaniom
biologicznym.
Szczegółowo
opisano
działanie
herbicydowych cieczy jonowych i ich działania przeciwko 400 gatunkom owadów.
Ponadto opisano metody obliczeniowe log P, MIC, ED50 i inne. Stwierdzono, że
wybór deskryptorów do modelowania QSAR aktywności biologicznej ma „kluczowe
znaczenie”.
W części badań własnych opisano racemiczny kwas migdałowy i jego
zastosowania
oraz
syntezę
9
związków,
migdalanów
benzylotrietylo,
lub
benzylodietyloamoniowych o różnych podstawnikach alkilowych od C1 do C18, oraz
2-dihydroksyetylowy. W większości były to ciecze, uzyskiwane z wydajnością 9399% (za wyjątkiem C16, 88%). Charakterystykę nowych cieczy jonowych, zawartość
wody (0,8-1,1% , rozumiem wagowy?) oraz chlorków/bromków opisano w kolejnym
rozdziale.
Otrzymano sole amoniowe (kation amoniowy z czwartorzędowym atomem azotu).
Podano wyniki badań eksperymentalnych widm NMR, aktywności względem
popularnych szczepów bakterii i grzybów, głównie w formie Tabel i wykresów oraz
dyskusję wielkości obliczonych. Badano lipofilowość cieczy jonowych. Obiektem
3
badań były również sole benzylodimetylododecyloamoniowe z różnymi anionami
organicznymi chlorkowym (razem 7 cieczy jonowych). Badano wpływ anionu na log
P. Uzyskano bardzo zbliżone wartości w granicach 1,8 do 2,3 poza mleczanem, 1,0 i
chlorkiem 1,2 (patrz Tabela 2 str. 53). Doktorantka wykazała, że są to związki o
średniej bioakumulacji. Dodatkowo wykazano, że log P cieczy jonowej z chiralnym
anionem jest identyczny dla mieszaniny racemicznej i dwu odmian optycznie
czynnych (ok. 1,9 dla C12 oraz ok. 2,8 dla C14). Badano również wpływ kationu (C1,
C6, C10, C12, C14, C16, COH) przy stałym anionie chlorkowym. Wpływ był
ogromny, od -2,53 do + 3,21. Wartości dodatni pojawiły się oczywiście dla dłuższych
atomów węgla C10, C12, C14 i C16. Następnie zbadano zasadnicze 9 cieczy
jonowych, wytypowanych do tej pracy + dziesiątą, migdalan benzetoniowy. Wyniki
log P dla C8-C18 były dodatnie a dla pozostałych ujemne. Tak więc krótkie łańcuchy
alkilowe,
grupa
hydroksylowa
w
łańcuchu
alifatycznym
zmniejszają
biokompatybilność.
Wyznaczono metodą HPLC współczynniki retencji log kw
(czasów retencji
związku niezatrzymywanego) dla różnych zawartości metanolu. Współczynnik ten
rośnie od C1 do C18. Przedstawiono zależność liniową między log kw i log P.
Następnie wyznaczono eksperymentalnie log kIAM .Wartości wzrastały od C10 do
C18 (2,7 do 5,8).
Porównanie log P wartości eksperymentalnych z obliczonymi dwiema metodami
wygląda żałośnie (patrz Tabela 13 str. 66). Dokonano korelacji liniowej między tymi
wartościami.
Ostatnią część pracy stanowią badania właściwości biologicznych MIC i MBC.
Najważniejsze dotyczą badań aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Badane ciecze
jonowe charakteryzują się skutecznym działaniem biobójczym wobec 10 wybranych
szczepów bakterii i 2 szczepów grzybów. Badania przeprowadzono niezależnie dla
cieczy z kationem o zróżnicowanych podstawnikach. Te z krótkimi łańcuchami
alifatycznymi charakteryzują się nieco słabszym działaniem biologicznym a C1, C6 i
COH były zupełnie nieaktywne. Wydłużanie łańcucha od C16 powoduje spadek
aktywności.
Interesujące są wyniki obliczeń QSAR zależności pomiędzy strukturą i aktywnością
biologiczna. Obliczenia oparto na zbadanych MIC, MBC oraz log P (nie wiedzieć
dlaczego z obliczeń AlogP, które w niczym nie przypominały wartości
eksperymentalnych). Powołanie się tu na pozycję Lit 184 jest bez sensu, bo tam
4
pewnie nie było wartości eksperymentalnych. Jedynym usprawiedliwieniem może być
tutaj zdanie na str. 77, że „uzyskane równania mają służyć do celów prognostycznych
nowych pochodnych alkilobenzylodimetyloamoniowych…”, dla których log P
musiałby być obliczony. Jednak przy tak zbliżonym kationie lepsza byłaby korelacja z
log P eksperymentalnym.
Analiza krystalograficzna związku C16 jednoznacznie potwierdziła obecność
wiązań jonowych wewnątrzcząsteczkowych. Upakowanie
jest warstwowe, część
polarna cząstki agreguje i tworzy część hydrofilową łańcuchy alifatyczne tworzą
warstwę hydrofobową.
W części doświadczalnej zastrzeżenie budzi ponownie wyznaczenie log P.
Doktorantka nie pisze o termostatowanym naczyniu i o temperaturze wyznaczenia log
P. W całej pracy nie wspomniano o temperaturze, pomiaru i dokładności pomiaru
temperatury, czystości i producenta oktanolu. Stężenie metodą HPLC wyznaczano w
temp. 20-250C. Samo wyznaczenie stężenia próbki pobranej z fazy w stanie
równowagi może już nie wprowadzać dużego błędu, ale dlaczego nie było to stałe
250C?
W podsumowaniu wysunięto hipotezę na temat destrukcji drobnoustrojów pod
wpływem C16 o rozciągniętej strukturze, co ułatwia łatwiejszą penetrację.
Praca jest dobrze zaplanowana i zawiera wszystkie, konieczne elementy:
opracowanie i wykonanie 9 nowych syntez, wyniki badań eksperymentalnych
czystości, opis właściwości fizykochemicznych i dyskusję wyników. Praca napisana
jest poprawnym językiem. Autorka dokonała starannej korekty tekstu. Przedstawiam
zauważone dwa błędy:
Str. 27, linia 5 z jest zbędne, a powinno być w linii 7,
str. 60, Tabela 9, powinno być logarytmu
Pomijając
te
drobne
niedociągnięcia
Autorka
wykazuje
się
dużą
systematycznością i dokładnością w opisach i cytowaniach. Praca zawiera wiele
rysunków i struktur związków niezwykle pracochłonnych w opisie.
Uwagi merytoryczne do pracy:
1. Brak opisu suszenia otrzymanych cieczy jonowych, próżnia, czas,
temperatura (suszarka próżniowa, linia próżniowa, eksykator próżniowy??)
Stąd duża ilość wody w próbkach-średnio 1 % wagowy (nie napisano),
podczas gdy publikuje się w czasopismach fizykochemicznych związki o
5
zawartości wody 200-800 ppm. Ma to szczególne znaczenie w badaniach
fizykochemicznych z wodą. Powiększa błąd pomiaru log P.
2. Nie dyskutowano błędów metod eksperymentalnych a wartości liczbowe
podawane są z zawyżoną ilością cyfr znaczących w stosunku do błędów
statystycznych metody: uśredniania stężeń, ekstrapolacja do x(metanolu) = 0
itp.
3. Temperatura jest tu najważniejszym parametrem pomiaru log P. Autorka
sama stwierdza na str. 50, cytuję: Zależy on od temperatury, substancji
rozpuszczonej, nie zależy od masy, stężenia, objętości składników układu”,
Można dyskutować z drugą częścią zdania, bo zdarza się że w układzie
zmieniają się współczynniki aktywności i termodynamiczny opis pozwala
na zlekceważenia zmian stężenia.
4. Na str. 98 i 99 używa się sformułowania „temperatura pokojowa” (to
znaczy od 14 do 300C??). W badaniach fizykochemicznych nie ma takiego
określenia!
5. Ewidentnym błędem jest stwierdzenie na str. 50 „Woda i oktanol to dwie
niemieszające się ciecze”. (Proszę sprawdzić prace na ten temat Domanska
i współpracownicy; są to dwie ciecze o ograniczonej mieszalności)
6. Strona 67 i 102, wysnuto błędny wniosek na temat metod obliczeniowych
log P. Otóż nie można ich użyć do tego typu skomplikowanych związków
bo dają rozbieżne z eksperymentalnymi wyniki. Korelacja liniowa
uzależnia je od eksperymentalnych.
7. Stąd pewnie kolejny błąd zastosowania log P obliczonego (AlogP) do
korelacji metodą QSAR.
8. Str. 104 we wnioskach użyto sformułowania „z długim łańcuchem”.
Ewidentnie jest to tylko C14 i C16, dające najlepsze wyniki
bakteriobójcze.
Do najważniejszych jak się wydaje sukcesów pracy należy uzyskanie czystych,
nowych
związków
z
dużą
wydajnością
i
określenie
charakteryzujących nowe związki w stanie wosku, ciekłym,
wielu
parametrów
i krystalicznym.
Dokonano całościowych badań, w wielu ośrodkach zaprzyjaźnionych, co pozwoliło
na pełniejszą charakterystykę nowych związków.
Doktorantka wykazała udział w 6 publikacjach, 7 zgłoszeniach konferencyjnych i
8 zgłoszeniach patentowych. Praca doktorska znalazła swoje częściowe zgłoszenie w
6
1 publikacji (Tetrahedron Lett. 2011, 52, 1325) i w 1 prezentacji konferencyjnej w
Poznaniu 2013.
Podsumowując należy stwierdzić, że praca zawiera nowe, oryginalne wyniki
eksperymentalne w klasie cieczy jonowych, a więc związków bardzo trudnych w
badaniach. Praca jest uporządkowaniem stanu wiedzy w tej dziedzinie i tej grupie
związków i stanowi postęp w ogólnej dyskusji, trwającej od lat, o budowie
strukturalnej i oddziaływaniach między kationem i anionem. Wreszcie praca
poszukiwała praktycznych zastosowań poprzez pełne badania biologiczne.
Uważam, że przedstawiona do recenzji rozprawa odpowiada warunkom
określonym w Rozporządzeniu Prezesa Rady Ministrów z dnia 15 stycznia 2004 r. w
sprawie warunków i trybu przeprowadzania przewodów doktorskich i habilitacyjnych
(Dz. U. nr. 65, poz. 596 z 2004 r.) i wnioskuję o dopuszczenie tej pracy do publicznej
obrony.
7