Kliknij aby pobrać specyfikacje PDF
Transkrypt
Kliknij aby pobrać specyfikacje PDF
NOVABEADS Amniotic Fluid DNA Preparation KIT Novabeads Amniotic Fluid DNA Preparation KIT Zestaw do izolacji DNA z płynu owodniowego (amniocyty) Novabeads Amniotic Fluid DNA Preparation KIT jest nowej generacji narzędziem w technikach biologii molekularnej umożliwiającym izolację DNA z amniocytów – komórek płodu obecnych w płynie owodniowym. Metoda oparta jest o zastosowanie w pełni syntetycznego kompozytowego złoża magnetycznego selektywnie wiążącego kwasy nukleinowe. Specjalnie dobrany skład buforów wiążących i płuczących pozwala uzyskać DNA o bardzo wysokiej jakości i czystości zarówno z krwi świeżej jak i mrożonej. Izolowany DNA nie ulega fragmentacji w trakcie procesu oczyszczania. Brak inhibitorów reakcji następczych pozwala na bezpośrednie zastosowanie oczyszczonych kwasów nukleinowych w innych technikach biologii molekularnej, takich jak: reakcja PCR sekwencjonowanie DNA (zautomatyzowane i manualne) defosforylacja fosforylacja ligacja badanie oddziaływań DNA-białko trawienie enzymami restrykcyjnymi. Złoża magnetyczne w odróżnieniu od standardowych złóż stosowanych do izolacji i oczyszczania DNA umożliwiają pełną automatyzację tego procesu. Procedura nie wymaga użycia w izolacji specjalistycznego sprzętu takiego jak wirówka lub pompa próżniowa. Cząstki magnetyczne – Magnetic Particles Bufor do lizy - Lysis Buffer Bufor do wiązania – Binding Buffer Bufor do płukania wstępnego - PreWash Buffer Bufor do płukania właściwego - Wash Buffer Bufor do elucji - TE Buffer Bufor do zagęszczania DNA – LP Buffer Bufor do przemywania komórek – PBS Buffer Bufor do trawienia komórek – Digesting Buffer Opcjonalnie: 10. RNaza A [10 mg/mL]* 11. Poteinaza K [10 mg/mL]* Zestaw nie zawiera: 1. 2. 3. Statywu magnetycznego 70% izopropanolu; 100 % izopropanolu 70% etanolu Uwagi: Przed przystąpieniem do pracy należy dokładnie wymieszać bufory oraz zworteksować cząstki magnetyczne. Pozostawić probówkę z cząstkami magnetycznymi w temp. pokojowej. Przed podaniem jeszcze raz dokładnie zworteksować zawartość probówki. 1 : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected] Zestaw zawiera: NOVABEADS Amniotic Fluid DNA Preparation KIT Protokół izolacji DNA z płynu owodniowego 1. Pobrać 2-3 mL płynu owodniowego. Wirować w temp. pokojowej przez 10 min / 13 000 rpm. 2. Usunąć supernatant, a osadzone na dnie amniocyty przemyć trzykrotnie PBS Buffer. Po każdym przemywaniu komórki krótko zwirować i usunąć supernatant. 3. Do osadu komórkowego dodać 150 µl Digesting Buffer i 15 µl Proteinazy K. Zawartość probówki dokładnie zworteksować, a następnie inkubować przez noc w temp. 37 °C lub przez 2-3 h w temp. 56 °C. 4. Do izolacji DNA pobrać 30 µl lizatu komórkowego. Dodać 320 l Lysis Buffer i 5 µl RNazy A (stężenie końcowe RNazy A w roztworze powinno wynosić 50 µg/mL). Krótko i delikatnie zworteksować zawartość probówki. 5. Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 °C, a następnie zwirować 10 min / 12 000 rpm. 6. Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, a osad odrzucić. 7. Do supernatantu dodać 320 l Binding Buffer i 30 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Mieszaninę delikatnie zworteksować i inkubować przez 10 min w temp. pokojowej. 8. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. Uwaga! W kolejnych punktach, po podaniu każdego z buforów przemywających (PreWash Buffer , Wash Buffer, 70% izopropanol) zawartość probówki należy mieszać delikatnie przez odwracanie, do czasu całkowitego oderwania się cząstek magnetycznych od ścian probówki. Nie worteksować probówek! 10. Powtórzyć czynności z punktu 9. z pominięciem inkubacji. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 11. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 mL Wash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki, nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 12. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 mL 70% izopropanolu. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki, nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych jak najdokładniej usunąć supernatant. 13. W celu usunięcia pozostałości izopropanolu pozostawić probówki otwarte w statywie magnetycznym przez 10-15 min w temp. pokojowej. 14. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l TE Buffer. Mieszaninę inkubować przez 5 min / 65 °C / 800 rpm, a następnie przy otwartych probówkach kolejne 5 min / 65 °C / 800 rpm. 15. Po inkubacji probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki. 2 : ścian probówki, inkubować 5 min w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected] 9. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 mL PreWash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od NOVABEADS Amniotic Fluid DNA Preparation KIT W przypadku niektórych aplikacji (np. MLPA) konieczne jest wyższe stężenie DNA w preparacie. Wówczas należy przeprowadzić kilka izolacji DNA z tego samego lizatu (np. 3 izolacje), a następnie zagęścić DNA za pomocą LP Buffer. 2. W tym celu należy połączyć eluaty DNA w jednej probówce. 3. Dodać 15 µl LP Buffer i wymieszać zawartość probówki przez pipetowanie. Inkubować 5 min w temp. pokojowej. 4. Uzupełnić próbę odpowiednio taką samą objętością (1:1) 100 % izopropanolu (o temp. 15 - 25°C). Delikatnie wymieszać zawartość probówki. 5. Natychmiast wirować w temp. pokojowej przez 20 min / 13 000 rpm. 6. Ostrożnie odrzucić supernatant, a osad przemyć 500 µl 70% etanolu (schłodzony 0 – 4 °C). Wirować w temp. pokojowej przez 3 min / 13 000 rpm. 7. Ostrożnie usunąć supernatant. Pozostawić probówki otwarte przez ok. 5 min, aby odparować pozostałość etanolu. 8. Osad rozpuścić w 40 µl TE Buffer. 9. Uzyskany DNA przechowywać w temp. -20 ˚C. W przypadku długotrwałego przechowywania zalecamy przechowywanie w temp. – 80 ˚C. Aby zapobiec parowaniu i krystalizacji odczynników, zalecamy zabezpieczenie parafilmem butelek z buforami po każdej izolacji. Warunki przechowywania: + 4 °C Lot nr Exp. date UWAGA! Pewne składniki buforów mogą działać silnie drażniąco. Podczas pracy ze wszystkimi związkami chemicznymi należy przestrzegać ogólnie obowiązujących przepisów BHP. Ten produkt został zaprojektowany i wykonany wyłącznie do celów badawczych. Nie został przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych z produkcją leków. 3 : 1. Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected] Protokół zagęszczania DNA