Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit

Novabeads Food DNA Kit
Novabeads Food DNA Kit
Novabeads Food DNA Kit jest nowej generacji narzędziem w technikach biologii
molekularnej,
umożliwiającym
izolację
DNA
z
produktów
spożywczych
wysoko
przetworzonych. Metoda oparta jest o zastosowanie w pełni syntetycznego kompozytowego
złoża magnetycznego, selektywnie wiążącego kwasy nukleinowe. Specjalnie dobrany skład
buforów wiążących i płuczących umożliwia izolację DNA, pomimo wysokiej hydrolizy kwasów
nukleinowych w procesie przetwarzania żywności. Izolowany DNA nie ulega fragmentacji
w trakcie procesu oczyszczania. Brak inhibitorów reakcji następczych pozwala
na bezpośrednie zastosowanie oczyszczonych kwasów nukleinowych
w innych technikach biologii molekularnej, takich jak:







reakcja PCR
sekwencjonowanie DNA
defosforylacja
fosforylacja
ligacja
badanie oddziaływań DNA-białko
trawienie enzymami restrykcyjnymi.
Złoża magnetyczne, w odróżnieniu od standardowych złóż stosowanych do izolacji
i oczyszczania DNA, umożliwiają pełną automatyzację tego procesu.
W protokole przedstawiamy modyfikacje standardowego protokołu do izolacji DNA na
cząstkach magnetycznych, z wysoko przetworzonych produktów spożywczych pochodzenia
zwierzęcego. Protokoły zostały zmodyfikowane pod kątem następujących produktów:
 surowe mięso wieprzowe i wołowe
 surowe mięso drobiowe (kurczak, indyk)
 kiełbasa typu polska wędzona, kiełbasa śląska, kabanos
 pasztet.
1
Novabeads Food DNA Kit
Standardowa izolacja DNA
z nieprzetworzonych tkanek zwierzęcych
Materiały wchodzące w skład zestawu:

Cząstki magnetyczne – Magnetic Particles

Bufor do lizy - Lysis Buffer 1

Bufor do wiązania – Binding Buffer

Bufor do płukania wstępnego – PreWash Buffer

Bufor do płukania właściwego – Wash Buffer

Bufor do elucji – TE Buffer

Bufor do proteinazy K – Proteinase K Buffer

Proteinaza K [10 mg/ml]

RNaza A [10 mg/ml]
Materiały dodatkowo wymagane:

Izopropanol 70%

statyw magnetyczny

worteks
Uwagi:
Przed przystąpieniem do procedury:

dokładnie zworteksować cząstki magnetyczne i pozostawić probówkę w temp. pokojowej.
Przed podaniem cząstek magnetycznych jeszcze raz dokładnie zworteksować zawartość
probówki.
 dokładnie wymieszać wszystkie bufory.
Opis metody:
ETAP I – Trawienie tkanki Proteinazą K
1.
Fragment tkanki 100 µg – 10 mg (*) umieścić w 1,5 mL probówce typu Eppendorf.
Dodać 500 µl Proteinase K Buffer oraz 5 µl Proteinazy
K. Mieszaninę dokładnie
zworteksować.
2.
Trawienie prowadzić przez 0,5 – 3 h w temp. 56 C z wytrząsaniem 500 rpm lub
przez noc w temp. 37 C z wytrząsaniem 300 rpm. W między czasie można próby kilka razy
zworteksować.
3.
Próby dokładnie zworteksować , a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
4.
Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej
procedury.
2
Novabeads Food DNA Kit
ETAP II – Oczyszczanie DNA
1.
Do 25 - 100 µl lizatu komórkowego (w przypadku trudno lizujących się tkanek podwoić
objętość lizatu). Dodać 300 µl Lysis Buffer 1 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować
zawartość probówki.
2.
Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
3.
Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić.
Do supernatantu dodać 300 µl Binding Buffer i 25 µl Magnetic Particles (cząstek
magnetycznych). Mieszaninę dokładnie zworteksować i inkubować 10 min w temp. pokojowej.
4.
Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych
odrzucić supernatant.
0
Uwaga! W kolejnych punktach, po podaniu każdego z buforów do przemywania (PreWash Buffer ,
Wash Buffer, 70% Izopropanol) zawartość probówki mieszać delikatnie przez odwracanie, do czasu
całkowitego oderwania się cząstek magnetycznych od ścian probówki. Nie worteksować probówek!
5.
Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml PreWash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od
ścian probówki, inkubować 5 min. w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie
magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
6.
Powtórzyć czynności z punktu 5 z pominięciem inkubacji. Probówkę umieścić w statywie
magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
7.
Cząstki magnetyczne zwiesić w 1ml Wash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian
probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się
cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
8.
Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml 70% izopropanolu. Po całkowitym oderwaniu cząstek
od ścian probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po
zebraniu się cząstek magnetycznych jak najdokładniej odrzucić supernatant.
9.
W celu odparowania pozostałości izopropanolu probówkę umieszczoną w statywie
magnetycznym należy pozostawić otwartą przez 10-15 min w temp. pokojowej lub razem ze
statywem odwrócić do góry dnem i pozostawić na bibule.
10. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l H20 MiliQ lub w 50 l TE Buffer.
Mieszaninę inkubować w temp. 65 ˚C/ 5 min/ 800 rpm, a następnie przy otwartej probówce
w temp. 65 ˚C / 5 min/ 800 rpm.
11. Po inkubacji, probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek
magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki.
12. Preparat zawierający wyizolowany DNA można stosować bezpośrednio do reakcji PCR.
(*) Ilość tkanki należy dobrać eksperymentalnie w zależności od jej typu i struktury.
3
Novabeads Food DNA Kit
Modyfikacje standardowego protokołu do izolacji DNA
z tkanki zwierzęcej:
Materiały wchodzące w skład zestawów:

Cząstki magnetyczne – Magnetic Particles

Bufor do lizy - Lysis Buffer 1

Bufor do wiązania – Binding Buffer

Bufor do płukania wstępnego – PreWash Buffer

Bufor do płukania właściwego – Wash Buffer

Bufor do elucji – TE Buffer

Proteinaza K [10 mg/ml]

RNaza A [10 mg/ml]
Materiały dołączone opcjonalnie (w zależności od materiału):

Bufor do trawienia (PBS ?%, SDS 10%)

Bufor do lizy - Lysis Buffer 2

Bufor do precypitacji – Precipitation Buffer
Materiały dodatkowo wymagane:

Izopropanol 70%

statyw magnetyczny

worteks
Uwagi:
Przed przystąpieniem do procedury:

dokładnie zworteksować cząstki magnetyczne i pozostawić probówkę w temp. pokojowej.
Przed podaniem cząstek magnetycznych jeszcze raz dokładnie zworteksować zawartość
probówki.
 dokładnie wymieszać wszystkie bufory.
4
Novabeads Food DNA Kit
Izolacja DNA na przykładzie surowego mięsa
(do mięsa wieprzowego, wołowego i drobiowego)
ETAP I – Trawienie tkanki Proteinazą K
5.
Fragment tkanki 25 mg umieścić w 1,5 mL probówce typu Eppendorf.
Dodać 200 µl Buforu do trawienia (PBS, 100 µl SDS 10%) oraz 20 µl Proteinazy K.
Mieszaninę dokładnie zworteksować.
6.
Mieszaninę inkubować przez 1 h w temp. 50 °C z wytrząsaniem 500 rpm.
7.
Próby dokładnie zworteksować , a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
8.
Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej
procedury.
ETAP II – Oczyszczanie DNA
1.
Do nowej probówki Eppendorf pobrać 130 µl supernatantu (lizatu komórkowego).
Dodać 300 µl Lysis Buffer 2 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować zawartość probówki.
2.
Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
3.
Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić. Supernatant
dopełnić do maksymalnej objętości Precipitation Buffer, próbę zworteksować i inkubować
przez 5 min. w temp. -20 °C.
4.
Próbę zwirować 10 min/12000 rpm i usunąć supernatant przez energiczne odwrócenie
probówki.
5.
Do osadu dodać 250 µl Binding Buffer i dokładnie zworteksować, aż do rozpuszczenia się
osadu. Dodać 20 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Mieszaninę dokładnie
zworteksować i inkubować 10 min w temp. pokojowej.
6.
Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych
odrzucić supernatant.
0
Następnie, według wspólnej procedury opisanej w punktach 7 – 14 (str. 8).
5
Novabeads Food DNA Kit
Izolacja DNA na przykładzie kiełbasy polskiej wędzonej
ETAP I – Trawienie tkanki Proteinazą K
1.
Fragment tkanki 50 mg umieścić w 1,5 ml probówce typu Eppendorf.
Dodać 500 µl Proteinase K Buffer oraz 5 µl Proteinazy
K. Mieszaninę dokładnie
zworteksować.
2.
Mieszaninę inkubować przez 0,5 – 3 h w temperaturze 56 C z wytrząsaniem 500 rpm lub
przez noc w temp. 37 C z wytrząsaniem 300 rpm. W między czasie można próby kilka razy
zworteksować.
3.
Po trawieniu próby dokładnie zworteksować , a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
4.
Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej
procedury.
ETAP II – Oczyszczanie DNA
1.
Do nowej probówki Eppendorf pobrać cały supernatant (lizat komórkowy).
Dodać 500 µl Lysis Buffer 2 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować zawartość probówki.
2.
Mieszaninę inkubować przez 20 min w temp. 65 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
3.
Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić. Supernatant
dopełnić do maksymalnej objętości Precipitation Buffer, próbę zworteksować i inkubować
przez 5 min. w temp. -20 °C.
4.
Próbę zwirować 10 min/12000 rpm i usunąć supernatant przez energiczne odwrócenie
probówki.
5.
Do osadu dodać 250 µl Binding Buffer i dokładnie zworteksować, aż do rozpuszczenia się
osadu. Dodać 25 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Mieszaninę dokładnie
zworteksować i inkubować przez 10 min w temp. pokojowej.
6.
Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych
odrzucić supernatant.
0
Następnie, według wspólnej procedury opisanej w punktach 7 – 14 (str. 8).
6
Novabeads Food DNA Kit
Izolacja DNA na przykładzie kiełbasy śląskiej
ETAP I – Trawienie tkanki Proteinazą K
1.
Fragment tkanki 50 mg umieścić w 1,5 ml probówce typu Eppendorf i dodać
500 µl Proteinase K Buffer oraz 5 µl Proteinazy K. Mieszaninę dokładnie zworteksować.
2.
Mieszaninę inkubować przez 0,5 – 3 h w temperaturze 56 C z wytrząsaniem 500 rpm lub
przez noc w temp. 37 C z wytrząsaniem 300 rpm. W między czasie można próby kilka razy
zworteksować.
3.
Próby dokładnie zworteksować , a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
4.
Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej
procedury.
ETAP II – Oczyszczanie DNA
5.
Do nowej probówki Eppendorf pobrać 100 µl supernatantu (lizatu komórkowego).
Dodać 300 µl Lysis Buffer 1 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować zawartość probówki.
6.
Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm.
7.
Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić.
Do supernatantu dodać 300 µl Binding Buffer i 50 µl Magnetic Particles (cząstek
magnetycznych). Mieszaninę dokładnie zworteksować i inkubować 10 min w temp. pokojowej.
8.
Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych
odrzucić supernatant.
0
Następnie, według wspólnej procedury opisanej w punktach 7 – 14 (str. 8).
7
Novabeads Food DNA Kit
Uwaga! W kolejnych punktach, po podaniu każdego z buforów do przemywania (PreWash Buffer ,
Wash Buffer, 70% Izopropanol) zawartość probówki mieszać delikatnie przez odwracanie, do czasu
całkowitego oderwania się cząstek magnetycznych od ścian probówki. Nie worteksować probówek!
7.
Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml PreWash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od
ścian probówki, inkubować 5 min. w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie
magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
8.
Powtórzyć czynności z punktu 7 z pominięciem inkubacji. Probówkę umieścić w statywie
magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
9.
Cząstki magnetyczne zwiesić w 1 ml Wash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian
probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się
cząstek magnetycznych odrzucić supernatant.
10. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml 70% izopropanolu. Po całkowitym oderwaniu cząstek
od ścian probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po
zebraniu się cząstek magnetycznych jak najdokładniej odrzucić supernatant.
11. W celu odparowania pozostałości izopropanolu probówkę umieszczoną w statywie
magnetycznym należy pozostawić otwartą przez 10-15 min w temp. pokojowej lub razem ze
statywem odwrócić do góry dnem i pozostawić na bibule.
12. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l TE Buffer. Mieszaninę inkubować
w temp. 65 ˚C/ 5 min/ 800 rpm, a następnie przy otwartej probówce w temp. 65 ˚C / 5 min/
800 rpm.
13. Po inkubacji, probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek
magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki.
14. Preparat zawierający wyizolowany DNA można stosować bezpośrednio do reakcji PCR.
8