Ćwiczenie 4 Manganometryczne oznaczanie aktywności katalazy w

Ćwiczenie 4
Manganometryczne oznaczanie aktywności katalazy w krwinkach czerwonych
Wymagane zagadnienia teoretyczne:
 Sposoby wyrażania aktywności enzymów
 Klasyfikacja enzymów wprowadzona przez Międzynarodową Unię Biochemiczną
 Ogólna charakterystyka powyższych klas z uwzględnieniem koenzymów, grup prostetycznych, aktywnych
ugrupowań i jonów metali z nimi współdziałających
 Charakterystyka głównych grup enzymów z klasy oksydoreduktaz oraz współdziałających z nimi koenzymów
i grup prostetycznych
Enzymami funkcjonującymi w usuwaniu H2O2 są katalaza i peroksydaza. Katalaza, dysproporcjonuje dwie
cząsteczki H2O2 do H2O i O2 zgodnie z równaniem:
2 H2O2 → 2H2O + O2
Największą aktywność katalazy wykazano w wątrobie, nerkach, krwi (erytrocyty), szpiku, błonach śluzowych.
Katalaza pełni szczególną rolę w metabolizmie erytrocytów, które są wystawione na działanie dużych stężeń
tlenu, zapobiega szkodliwemu działaniu H2O2, chroni glutation i hemoglobinę przed utlenieniem.
W komórce nadtlenek wodoru powstaje w wielu różnych reakcjach. Jednym z jego źródeł jest reakcja
katalizowana przez dysmutazę ponadtlenkową – enzym usuwający aniony ponadtlenkowe zgodnie z reakcją:
Odczynniki
1 % roztwór nadtlenku wodoru
10 % roztwór kwasu siarkowego
0,1M roztwór nadmanganianu potasu (KMnO4)
Przygotowanie hemolizatu krwinek czerwonych:
Do erlemnajerki odmierzyć 20 ml wody destylowanej i 20 mikrolitrów krwi.
Zawartość dokładnie wymieszać i odstawić na 15 min. Rozcieńczenie krwi wodą powoduje hemolizę krwinek i
przejście katalazy do roztworu.
Wykonanie
Oznaczenie wykonujemy w szklanych chemicznych probówkach.
Próba badana:
7.0 ml wody destylowanej
2.0 ml hemolizatu
Próba kontrolna:
2.0 ml hemolizatu uprzednio ogrzanego do100°C przez 5 min
7.0 ml wody destylowanej
Następnie do obu probówek dodać po 2.0 ml 1 % roztworu H 2O2, pozostawić na 30 min. w temperaturze pokojowej.
Po tym czasie do obu probówek dodać po 3.0 ml 10 % H 2SO4 i miareczkować próbę kontrolną i badaną
roztworem nadmanganianem potasu.
Za punkt końcowy miareczkowania przyjmujemy moment gdy po dodaniu kropli KMn04 roztwór zabarwi się
na różowo i zabarwienie to będzie się utrzymywać przez minutę. Pozostałość nie rozłożonego w trakcie reakcji H 2O2
określa ilość użytego do miareczkowania KMnO4, dlatego na miareczkowanie próby kontrolnej zużyje się więcej
nadmanganianu potasu.
Uwzględniając ilość mililitrów hemolizatu zużytego do badania (2.0 ml), aktywność enzymu wyrazić ilością
mg H2O2 rozłożonych na 1 g hemoglobiny (mg H2O2/g Hb) w oparciu o poniższy wzór:
gdzie
a – ilość ml KMnO4 zużyta na miareczkowanie próby kontrolnej
b – ilość ml KMnO4 zużyta na miareczkowanie próby badanej
c – stężenie hemoglobiny (g%) (podaje prowadzący ćwiczenia)
Przyjąć, że l.0 ml 0,1 M roztworu KMnO4 odpowiada 1,7008 mg H202
Zasada oznaczania
Nadtlenek wodoru jest substancją o charakterze utleniacza ale w środowisku kwaśnym w stosunku do
silniejszego utleniacza jakim jest KMnO4 zachowuje się jak reduktor.
Metoda oznaczania polega na miareczkowaniu nadtlenku wodoru, który nie uległ rozłożeniu w przebiegu
reakcji mianowanym roztworem manganianu (VII) potasu w środowisku kwaśnym.
Manganian (VII) ulega redukcji i odbarwieniu. Po utlenieniu całości nadtlenku, nadmiar KMnO4 zabarwia
miareczkowany roztwór na różowo, co świadczy o osiągnięciu punktu końcowego miareczkowania.