106 4.3. Dyskusja wyników 4.3.1. Wewnątrzcząsteczkowe

106
4.3. Dyskusja wyników
4.3.1. Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie protonu
Wyniki badań przedstawionych w pracy (punkty 4.2.1, 4.2.2, 4.2.3, 4.2.4)
pozwalają na wyjaśnienie roli wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu w
mechanizmie utleniania rodnikiem wodorotlenkowym aminokwasów zawierających
grupę tioeterową.
Pierwotnym produktem utleniania aminokwasów tioeterowych rodnikiem
wodorotlenkowym jest rodnik hydroksysulfuranylowy, który powstaje w wyniku
addycji rodnika OH do siarki tioeterowej (reakcja [39]).
R
(CH2)n
S
CH
CO2-
+
.OH
k(OH + S)
NH3+
R
(CH2)n
CO2-
.S
CH
OH
NH3+
[39]
Rodniki hydroksysulfuranylowe zanikają w (i) reakcji spontanicznej dysocjacji (kd),
(ii) katalizowanej protonami środowiska reakcji eliminacji cząsteczki wody (kH) i
(iii) podstawienia anionu OH- przez drugą cząsteczkę aminokwasu (kS) (schemat 2)
(podobnie jak to ma miejsce w modelowych kwasach alkilotiokarboksylowych punkt
4.2.1) oraz w (iv) reakcji wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu, w której
bierze udział protonowana grupa aminowa (kNH) (schemat 2).
Schemat 2
CO2H
R
.S
OH
kd
_ OH-
CH
_H O
NH3+
kH
kNH
CO2H
2
+
+ H3O
_ 2H O
2
kS
H2N.
+. .
S
R
S
_ OHCO2H
S
R
.S+
CH
NH3+
R
CO2H
R
S.
. .+
S
CH NH3+
CH NH3+
CO2H
107
W dotychczasowej literaturze (Hiller i in. 1981) udział tego ostatniego procesu w
metioninie był brany pod uwagę tylko w roztworach słabo kwaśnych i obojętnych.
Opierając się na widmach absorpcyjnych otrzymanych dla metioniny w roztworach
silnie kwaśnych (rysunki 4.2.2_1 i 4.2.2_3) proces wewnątrzcząsteczkowego
przeniesienia protonu od protonowanej grupy aminowej (kNH, schemat 2) może
skutecznie konkurować z międzycząsteczkowym przeniesieniem protonów ze
środowiska reakcji do rodnika hydroksysulfuranylowego (kH, schemat 2), nawet w
warunkach wysokiego stężenia protonów w środowisku reakcji. W niskim pH (pH <
2) i przy stosunkowo niskim stężeniu aminokwasu (< 10-2 mol dm-3) udział
spontanicznej dysocjacji rodnika hydroksysulfuranylowego oraz podstawienia
anionu OH- przez drugą cząsteczkę aminokwasu (opisywanych odpowiednio
stałymi szybkości kd i kS) jest do zaniedbania w procesie zaniku rodnika
hydroksysulfuranylowego. W warunkach prowadzenia eksperymentu (pH 1, stężenie
aminokwasu 2*10-3 mol dm-3) obserwowane procesy rodnikowe w metioninie
sprowadzają się do konkurencji pomiędzy wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem
protonu z protonowanej grupy aminowej (kNH) i katalizowaną protonami środowiska
(kH) eliminacją cząsteczki wody. Wymienione procesy prowadzą do dwóch różnych
rodnikowych produktów pośrednich (schemat 3), których identyfikacja i ilościowe
oznaczenie umożliwiło wyznaczenie stałej szybkości wewnatrzcząsteczkowego
przeniesienia protonu (kNH) w metioninie.
Schemat 3
CH2 CH2
H3C
H
.S
CH
O
NH2
+
CO2H
CO2H
H
kH
H3O+ ( - 2 H2O)
H3C
S
+.
CH
CH2
CH2
NH3+
S
kNH
-
H2O
+
CO2H
S∴ S
S∴ NH2
H3C
+
Reakcja z udziałem protonów grupy aminowej prowadzi do powstawania
kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy
108
siarką i azotem (kNH, schematy 2 i 3), które są jednym z prekursorów
dekarboksylacji. Pasmo absorpcji z λmax ~ 390 nm można z całą pewnością
przypisać kationorodnikowi z wiązaniem trójelektronowym (S∴N)1 ponieważ
obserwowano je tylko w związkach dysponujących "kwasowymi" protonami
wolnych (nieacylowanych) grup aminowych (Met i Met-OMe, rysunki 4.2.2_1 i
4.2.2_3).
Konkurencyjna, wobec powstawania kationorodnika z wiązaniem S∴N,
reakcja dehydratacji rodników hydroksysulfuranylowych z udziałem protonów
środowiska (kH, schematy 2 i 3) prowadzi do monomerycznego kationorodnika >S.+.
Kationorodnik ten znajduje się w zależnej od stężenia aminokwasu równowadze z
kationorodnikiem dimerowym (S∴S)+ 2, którego powstawanie w metioninie i jej
pochodnych obserwuje się w niskim pH, zarówno metodą radiolizy impulsowej jak i
EPR.
Przyjęcie założeń o konkurencyjności procesów przeniesienia protonów ze
środowiska (kH) i z grupy aminowej (kNH) do rodnika hydroksysulfuranylowego
(schemat 3), oraz że stałe szybkości przeniesienia protonów środowiska (kH) i
molowe współczynniki kationorodników dimerowych z międzycząsteczkowym
wiązaniem trójelektronowym S∴S w Met i Ac-Met nie powinny się zasadniczo
różnić, pozwala obliczyć stałą szybkości (kNH) w metioninie ze wzoru (XXIII):
1
Molowy współczynnik absorpcji kationorodnika (S∴N)+ ε390 = 4600+/-200 dm3mol-1cm-1
wyznaczyłem z widma otrzymanego w roztworze Met-OMe (2*10-3 mol dm-3, pH 6,7) 2 µs po
impulsie, przy założeniu 80% konwersji rodników OH, wygenerowanych podczas napromieniania, w
kationorodniki (S∴N)+ (G((S∴N)+) = 0,8*G(OH)pH 6,7 = 4,6). Met-OMe został wybrany dlatego, że
w wyniku zablokowania grupy karboksylowej przez estryfikację jest w nim zahamowana
dekarboksylacja i w konsekwencji jest spowolniony zanik kationorodnika z wiązaniem S∴N.
Połówkowy czas życia kationorodnika z wiązaniem S∴N w Met-OMe wynosi τ1/2 > 300 µs a w Met
τ1/2 ~ 200 ns. Procent konwersji wynika z przyjęcia za Hiller i in. 1981, że około 20%
wygenerowanych w układzie rodników hydroksylowych reaguje z aminokwasem poprzez oderwanie
wodoru od węgla w pozycji α do siarki tioeterowej.
2
Molowy współczynnik absorpcji kationorodnika (S∴S)+ ε490 = 8600+/-200 dm3mol-1cm-1
wyznaczyłem z widma otrzymanego w roztworze Ac-Met-OMe (2*10-3 mol dm-3, pH 1) 2 µs po
impulsie (rysunek 3.2.2_4 krzywa b), przy założeniu 80% konwersji rodników OH wygenerowanych
podczas napromieniania w kationorodniki (S∴S)+ (G((S∴S)+) = 0,8*G(OH)pH 1 = 2,3). Ac-MetOMe został wybrany ponieważ nie występuje w nim reakcja prowadząca do kationorodnika z
wiązaniem S∴N oraz reakcja dekarboksylacji.
109
k NH
k NH
G((S ∴ N ) + ) Met
=
+ k H [ H3O + ] G((S ∴ N ) + ) Met + G((S ∴ S ) + ) Met
(XXIII)
gdzie: kNH - stała szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu z grupy
aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego], kH - stała szybkości przeniesienia
protonu środowiska do rodnika hydroksysulfuranylowego, [H3O+] - stężenie
protonów, G((S∴N)+) - wydajność chemoradiacyjna kationorodników z wiązaniem
S∴N, G((S∴S)+) - wydajność chemoradiacyjna kationorodników dimerowych z
wiązaniem S∴S.
Przyjmując
G((S ∴ N ) + ) Met = G((S ∴ S ) + ) Ac − Met − G((S ∴ S ) + ) Met
otrzymujemy:
k NH
k NH
G((S ∴ S ) + ) Met
=
1
−
+ k H [ H3O + ]
G((S ∴ S ) + ) Ac − Met
(XXIV)
Podstawiając do wzoru (XXIV) [H3O+] = 0,1 mol dm-3, G((S∴S)+)Met)/G((S∴S))+Ac10
Met = 0,62 (rysunki 4.2.2_1 krzywa b i 4.2.2_2 krzywa b) oraz wartość kH = 2,52*10
mol-1dm3s-1 (uzyskaną dla Ac-Met (tabela 5)) otrzymujemy:
kNH ≅ 1,6*109 s-1
Stałą szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu z grupy
aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego (kNH) można wyznaczyć na
niezależnej drodze, wykorzystując wyniki uzyskane dla estru metylowego metioniny
(Met-OMe)3. Wydajności chemoradiacyjne powstawania kationorodników
G((S∴S)+) i G((S∴N)+) są równe gdy szybkości ich powstawania są równe, tj. gdy
spełniona jest zależność (XXV)
kNH= kH[H3O+] (XXV)
Korzystając z wykresów na rysunku 4.3_1 można stwierdzić, że zależność (XXV)
jest spełniona dla Met-OMe w pH ≈ 1,15, co pozwala na obliczenie stałej szybkości
wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu:
kNH ≅ 1,8*109 s-1
3
Patrz przypis 16.
110
Uzyskana wartość stałej szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu
(kNH) jest w bardzo dobrej zgodności z wartością obliczoną na podstawie różnic w
wydajnościach chemoradiacyjnych kationorodników dimerowych z wiązaniem S∴S
w Met i Ac-Met, co potwierdza słuszność przyjętych wcześniej założeń dotczących
stałych szybkości kH i molowych współczynników absorpcji kationorodników
dimerowych w tych związkach.
1.2
1.0
b
GX/GOH
0.8
0.6
0.4
0.2
a
0.0
0
1
2
3
4
pH
Rys. 4.3_1 Wydajność kationorodników dimerowych z wiązaniem S∴S mierzona w
490 nm (wyrażona jako GX/GOH) (a), i kationorodników z wiązaniem (S∴N) mierzona
w 390 nm (wyrażona jak (GX/GOH) (b), dla 2*10-3 mol dm-3 roztworach Met-OMe
nasyconych N2O, w zależności od pH.
Przez analogię do procesów rodnikowych prowadzących do dekarboksylacji w
metioninie i jej pochodnych obserwacja wysokiej wydajności dekarboksylacji w
słabo kwaśnych i obojętnych roztworach S-metylocysteiny (rysunek 4.2.3_8)
sugeruje, że wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie protonu z protonowanej grupy
aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego może mieć także istotne znaczenie
w mechanizmie utleniania rodnikiem wodorotlenkowym S-alkilowych pochodnych
cysteiny. Proces ten zachodzi pomimo niestabilności pierścieni czteroczłonowych i
związanych
z
tym trudności
w
powstawaniu
kationorodników
z
wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym S∴N.
111
Schemat 4
NH3+
R
kC
O
_ OH-
S ... O
R
H
S
R
_ OH-
CH NH3+
S.
+. .
S
R
CH
_H O
2
kS
CO2-
.S
O
S
.
.
H2N
+.
kd
+
H
NH2
kNH
R
NH3+
CO2-
CO2-
CH
_ OH-
CH
CO2-
S
R
R
+.
S
CH
S
+.
H2N
CO2-
NH3+
kET2
kET1
R
kD
CO2-
CO2
S
H2N
αS
_
CH
CH
.
(αN)
Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie protonu z grupy aminowej do rodnika
hydroksysulfuranylowego (kNH, schemat 4) prowadzi do utlenienia azotu grupy
aminowej i w konsekwencji do dekarboksylacji cząsteczki, poprzedzonej
przeniesieniem elektronu z grupy karboksylowej do utlenionego centrum
rodnikowego zlokalizowanego na atomie azotu (kET1, schemat 4)4. Dekarboksylacji
towarzyszy wytworzenie rodników α-aminoalkilowych, które następnie ulegają βfragmentacji (patrz punkt 4.3.3). Z kolei, procesy konkurujące z
wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem protonu prowadzą do kationorodnika
dimerowego (S∴S)+ (kS, schemat 4), do monomerycznego kationorodnika >S.+ (kd,
schemat 4), który znajduje się w zależnej od stężenia aminokwasu równowadze z
4
Wykonane eksperymenty nie dostarczyły bezpośrednich dowodów na powstawanie indywidów
umieszczonych na schemacie 4 w nawiasach kwadratowych. Jeśli nawet indywidua te powstają to
mogą charakteryzować się bardzo krótkim czasem życia - poza zasięgiem metod eksperymentalnych
którymi dysponowałem.
112
kationorodnikiem dimerowym (podobnie jak w innych tioeterach) oraz do powstania
rodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem pomiędzy siarką i tlenem (kC,
schemat 4) (przez analogię z kwasami alkilotiokarboksylowymi zawierającymi grupy
karboksylowe w pozycji β w stosunku do siarki punkt 4.2.1). Monomeryczny
kationorodnik >S.+ zanika w procesie deprotonacji (kD, schemat 4), który prowadzi
do rodników α-(alkilotio)alkilowych (αS) oraz w procesie wewnątrzcząsteczkowego
przeniesienia elektronu od grupy karboksylowej do utlenionego centrum
rodnikowego zlokalizowanego na atomie siarki (kET2, schemat 4)5. Opierając się na
schemacie 4 stałą szybkości zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego można opisać
równaniem (XXVI):
kexp = kd + kH[H3O+] + kS[S] + kC + kNH
(XXVI)
Pseudo-pierwszorzędowa stała szybkości (kexp) obliczona z kinetyki zaniku rodnika
hydroksysulfuranylowego w stężonym roztworze S-metylocysteiny (5*10-2 mol dm-3)
w pH 5,7 (rysunek 4.3_2) ma wartość 4,3*107 s-1.
G*ε (mol-1dm3cm-1)
8000
6000
4000
2000
0
-2000
-40
0
40
80
120
160
czas (ns)
Rys. 4.3_2 Kinetyka zaniku pasma absorpcji rodników hydroksysulfuranylowych
zmierzona w λmax = 330 nm, w roztworze 5*10-2 mol dm-3 Cys(Me) w pH = 5,7.
Brak wyraźnych pasm absorpcji z λmax = 390 nm i 480 nm, w słabo kwaśnych i
obojętnych roztworach S-metylocysteiny (rysunki 4.2.3_1, 4.2.3_2), przypisanych
odpowiednio rodnikom z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem S∴O i
5
Obecność tego procesu jest postulowana na bazie obserwacji dekarboksylacji w kwasie 3,3'-
tiodipropionowym, w którym obydwie grupy karboksylowe znajdują się w pozycji β w stosunku do
siarki (rysunek 4.2.1_6).
113
kationorodnikom dimerowym z międzycząsteczkowym wiązaniem S∴S, świadczy o
niewielkim udziale procesów opisywanych stałymi szybkości kC i kS. Na podstawie
danych kinetycznych dla kwasu 3-metylotiopropionowego (tabela 4) możemy
oszacować udział procesu wymiany anionu OH- przez drugą cząsteczkę aminokwasu
kS[S] w 5*10-2 mol dm-3 Cys(Me) na ~107 s-1. Z kolei opierając się na wydajnościach
chemoradiacyjnych rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem S∴O i
kationorodników dimerowych z międzycząsteczkowym wiązaniem S∴S
otrzymanych dla różnych stężeń 3-MTPA (rysunek 4.2.1_2) oszacowana stała kC nie
powinna być wyższa od 107 s-1. W rezultacie po uwzględnieniu w równaniu (XXVI)
udziałów poszczególnych procesów6 stałą szybkości wewnątrzcząsteczkowego
przeniesienia protonu w S-metylocysteinie oszacowano na ~2*107 s-1.
Zasadniczo podobny obraz widm absorpcji jak w S-metylo- (rysunek 4.2.3_2) i
S-etylocysteinie obserwuje się w S-karboksymetylocysteinie (rysunek 4.2.3_5).
Oznacza to, że wprowadzenie do cząsteczki aminokwasu drugiej grupy
karboksylowej zlokalizowanej w podstawniku w grupie tioeterowej nie zmienia
zasadniczo obrazu procesów rodnikowych w aminokwasie. Dodatkowym procesem,
który potencjalnie może pojawić się po wprowadzeniu grupy karboksylowej
zlokalizowanej na S-końcu cząsteczki jest wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie
elektronu z S-końcowej grupy karboksylowej do kationorodnika >S.+ (kET3, schemat
5) konkurujące z wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem elektronu z N-końcowej
grupy karboksylowej do kationorodnika >S.+ (kET2, schemat 4). Następstwem
zachodzenia pierwszego procesu jest dekarboksylacja na S-końcu cząsteczki
aminokwasu z wytworzeniem rodników α-(alkilotio)alkilowych (αS). Z kolei
następstwem drugiego procesu jest dekarboksylacja na N-końcu cząsteczki
aminokwasu prowadząca do rodników α-aminoalkilowych (αN) ulegających βfragmentacji (patrz punkt 4.3.3).
6
Z danych kinetycznych (kd i kH) dla tioeterów (Bobrowski i Schöneich 1993) udział procesów
spontanicznej dysocjacji i katalizowanej protonami środowiska eliminacji cząsteczki wody (pH 5,7)
jest do zaniedbania.
114
Schemat 57
-
O2C
Ο
CH
OH
NH3+
kd
_ OH-
S.
..
Ο
CH
+.
Ο
kET3
S
CH
CO2-
NH3+
CO2-
S
CH
Ο−
NH3+
_ CO
2
.
H2C
CO2-
.S
_CO
2
kET2
_ H+
CO2-
-
O2C
S
.
CH
NH2
NH3+
Potwierdzeniem istotnego udziału wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu
z S-końcowej grupy karboksylowej do kationorodnika >S.+ jest obserwacja
wydajności kwantowej aldehydu octowego φ(Ah) (produktu β-fragmentacji
rodników α-aminoalkilowych) podczas utleniania Cys(Cm) trypletem 4karboksybenzofenonu8 (Goez i in. 1996, Rozwadowski 1996). Stanowi ona zaledwie
~10% wydajności kwantowej φ(CO2).
W tym aspekcie, komentarza wymaga obserwacja znacznie wyższych
wydajności chemoradiacyjnych produktów β-fragmentacji rodników αaminoalkilowych (tj. aldehydu octowego i rodników alkilosulfanylowych) w
stosunku do wydajności chemoradiacyjnych CO2 podczas utleniania Cys(Cm)
7
W odróżnieniu od S-metylocysteiny spontaniczna dysocjacja w S-karboksymetylocysteinie jest
katalizowana
grupą
karboksylową
w
pozycji
α
do
siarki
podobnie
jak
w
kwasach
alkilotiokarboksylowych (2-MTEA, 2,2'-TDEA) (Bobrowski i in. 1993).
8
Pierwotnym
produktem
utleniania
aminokwasów tioeterowych przez
karboksybenzofenonu jest monomeryczny kationorodnik >S.+ (Bobrowski i in. 1992).
tryplet
4-
115
rodnikiem wodorotlenkowym (G(Ah)/G(CO2) ~64% i G(RS.)/G(CO2) ~84%; na
podstawie danych z tabeli 6). Świadczy to o znacznie wydajniejszym tworzeniu się
rodników α-aminoalkilowych, gdy prekursorem procesów rodnikowych
prowadzących do ich utworzenia jest rodnik hydroksysulfuranylowy. Zjawisko to nie
miałoby miejsca, gdyby głównym kanałem reakcyjnym zaniku rodnika
hydroksysulfuranylowego były procesy prowadzące do kationorodnika >S.+.
Obserwacje te można wyjaśnić uwzględniając istotny udział w tworzeniu rodników
α-aminoalkilowych wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od grupy
aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego (kNH, schemat 4).
Fakt, że wydajność chemoradiacyjna dekarboksylacji G(CO2) jest wyraźnie
wyższa od wydajności chemoradiacyjne rodników α-aminoalkilowych G(αN)
(zarówno w procesie inicjowanym fotochemicznie jak i radiacyjnie) świadczy, że
dekarboksylacja w cząsteczce Cys(Cm) zachodzi na obu jej końcach. Proces
dekarboksylacji w bocznym łańcuchu aminokwasu jest bardzo wydajny, gdy
prekursorem reakcji rodnikowych jest kationorodnik >S.+. Szczególnego znaczenia
nabiera w tej sytuacji szybkość wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od
grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego. Jej wielkość będzie
decydować o tym w jakim stopniu cząsteczki S-alkilowych pochodnych cysteiny
ulegną β-fragmentacji, co jest bezpośrednio związane z wydajnością dekarboksylacji
N-końcowej grupy karboksylowej.
Opierając się na schematach 4 i 5, stałą szybkości wewnątrzcząsteczkowego
przeniesienia protonu w S-alkilowych pochodnych cysteiny można oszacować
posługując się równaniem (XXVII):
k NH + k Z ∗
k NH
k ET 2
G(CO2 ) αN
k ET 2 + k ET 3
=
=
+ kZ
G(CO2 ) αN + G(CO2 ) αS
1
G(CO2 ) αS
1+
G(CO2 ) αN
(XXVII)
gdzie: kz = kd + kS[S] + kH[H3O+] - jest pseudo-pierwszorzędową stałą szybkości
zaniku rodnika hydroksy-sulfuranylowego (bez procesu kNH) w Cys(Cm) dla danego
stężenia aminokwasu i protonów środowiska reakcji9; kET2 i kET3 - są odpowiednimi
stałymi szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu w schemacie 5 ;
9
Wartość kz w Cys(Cm) nie powinna się zasadniczo różnić od stałej kz obliczonej z równania
(XXI) dla danego stężenia kwasu alkilotiokarboksylowego i protonów w modelowym kwasie
alkilotiokarboksylowym (2-MTEA).
116
G(CO2)αS i G(CO2)αN - wydajności chemoradiacyjne dekarboksylacji odpowiednio na
S-końcu i na N-końcu cząsteczki. Przyjmując że:
•
•
G(CO2 ) αS G(RS ) Cys(Me) − G(RS ) Cys(Cm)
≈
G(CO2 ) αN
G(RS • ) Cys(Me)
φ(Ah ) Cys(Cm)
k ET 2
≈
k ET 2 + k ET 3 φ(CO2 ) Cys(Cm)
i
gdzie: G(RS.)Cys(Me), G(RS.)Cys(Cm) -
wydajności
(XXVIII)
(XXIX)
chemoradiacyjne
rodników
alkilosulfanylowych w Cys(Me) i Cys(Cm), które odpowiadają wydajnościom
produktu utleniania kwasu askorbinowego przez te rodniki tj. G(RS.) ≈ G(VC.-), φ
(Ah)Cys(Cm) i φ(CO2)Cys(Cm) wydajności kwantowe powstawania aldehydu octowego i
CO2 w Cys(Cm) i przekształcając równanie (XXVII) otrzymujemy:
k NH = k Z *
φ(Ah ) Cys(Cm)
G(CO2 ) αN
G(CO2 ) αS
) (XXX)
* 1−
* (1 +
G(CO2 ) αS
φ(CO2 ) Cys(Cm)
G(CO2 ) αN
[
]
W roztworze Cys(Cm) o stężeniu 3*10-2 mol dm-3 w pH 5,810 obliczona wartość kz
(na podstawie danych z tabeli 4) wynosi 8,2*106 s-1. Wykorzystując równanie
(XXVII) i wydajności chemoradiacyjne utleniania kwasu askorbinowego G(VC.-) w
roztworach Cys(Me) i Cys(Cm) (tabela 6) otrzymujemy wartość G(CO2)αS/G(CO2)αN
= 0,17. Z kolei, korzystając z równania (XXIX) oraz zmierzonych wydajności
kwantowych φ(Ah)Cys(Cm) = 0,06 i φ(CO2)Cys(Cm) = 0,59 w roztworach zawierających
2*10-2 mol dm-3 Cys(Cm) i 2*10-3 mol dm-3 4-karboksybenzofenonu w pH 6,8
(Rozwadowski 1996) φ(Ah)Cys(Cm)/φ(CO2)Cys(Cm) = 0,1. Podstawiając obliczone
wartości do równania (XXX) otrzymujemy wartość stałej szybkości
wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu w S-alkilowych pochodnych
cysteiny:
kNH ≈ 4,2*107 s-1
10
Wszystkie pomiary wydajności chemoradiacyjnych CO2, aldehydów i produktów utleniania
kwasu askorbinowego były przeprowadzone w roztworach o stężeniu 3 - 5*10-2 mol dm-3 w pH 5,8.
Zapewniło to we wszystkich eksperymentach podobny udział reakcji podstawienia OH- przez drugą
cząsteczkę aminokwasu (kS[S]) oraz niewielki udział katalizowanej protonami reakcji eliminacji
cząsteczki woody (kH[H3O+]).
117
Kationorodniki z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym
pomiędzy siarką i azotem, w pH zbliżonym do obojętnego, powstają w
homometioninie z wydajnością znacznie niższą (rysunek 4.2.4_1) od obserwowanej
w metioninie (rysunek 4.2.2_1). Może to wynikać z faktu, że sześcioczłonowa
konformacja konieczna do utworzenia kationorodnika cyklicznego (S∴N)+ tworzy
się znacznie wolniej (kC1, schemat 6) od konformacji pięcioczłonowej kationorodnika
cyklicznego (S∴N)+ w metioninie. W konsekwencji powstający kationorodnik ze
zlokalizowanym miejscem rodnikowym na azocie zanika w szybkim procesie
wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu (kET1, schemat 6) i następującej po
nim dekarboksylacji. Z kolei w pH 1, brak kationorodnika z
wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i azotem
(rysunek 4.2.4_1) można wyjaśnić niższą wartością stałej szybkości
wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia elektronu (kNH, schemat 6) w porównaniu z
wartością (kNH) w metioninie (schemat 2). W tej sytuacji dominujący udział w zaniku
rodnika hydroksysulfuranylowego w homometioninie ma katalizowana protonami
środowiska reakcja eliminacji cząsteczki wody (kH, schemat 6) prowadząc do
monomerycznego kationorodnika >S.+.
Schemat 6
H3C
.S
O
H
kH
kNH
CO2-(H+)
+
H NH2
_
H2O
H3C
S
.
+ NH2
CO2-(H+)
+
+ H3O
_2H O
2
kC1
CO2-(H+)
H3C
_
S
CO2
_ H+
kET1
NH3+
S
CO2-(H+)
H3C
+
H3C
S.
. .
S
NH3+
NH3+
CO2-(H+)
H3C
S.
. .
+
NH2
CO2-(H+)
H3C
S
NH2
CH
.
118
Zakładając, że prekursorem procesu dekarboksylacji w homometioninie jest
wyłącznie utlenione centrum rodnikowe zlokalizowane na atomie azotu11 oraz
wykorzystując znajomość wydajności chemoradiacyjnych kationorodników
dimerowych G((S∴S)+) i dekarboksylacji (G(CO2) można podjąć próbę
oszacowania stałej szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu kNH
w homometioninie można oszacować w oparciu o równanie (XXXI):
⋅+
k NH
k NH
G(− NH 2 )
=
+
+ k H [ H 3 O ] G(− NH 2 + )+ G((S ∴ S ) + )
(XXXI)
gdzie:
kNH - stała szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu z
grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego, kH - stała szybkości
przeniesienia protonu środowiska do rodnika hydroksysulfuranylowego12, [H3O+] stężenie protonów, G(-NH2.+) - wydajność chemoradiacyjna utleniania azotu w
procesie wewnątrzcząsteczkowym, G((S∴S)+) - wydajność chemoradiacyjna
powstawania kationorodników dimerowych (S∴S)+.
Z widma absorpcji kationorodnika dimerowego (S∴S)+ (rysunek 4.2.4_1)
otrzymanego w roztworze homometioniny (2*10-3 mol dm-3, pH 1)13 obliczona
wydajność chemoradiacyjna G((S∴S)+) wynosi 2,114. Przyjmując, podobnie jak w
metioninie, że 20% rodników wodorotlenkowych reaguje z homometioniną poprzez
oderwanie wodoru z łańcucha alifatycznego, oszacowana wartość G(-NH2.+) = 0,2.
Podstawiając powyższe wartości do wzoru (XXXI) otrzymujemy:
kNH ≈ 2,5*108 s-1
11
Bezpośrednie przeniesienie elektronu z grupu karboksylowej do utlenionego centrum
siarkowego wzdłuż sześcioczłonowego łańcucha jest do zaniedbania. Dowodem na to jest obserwacja
bardzo niskiej wydajności kwantowej dekarboksylacji φ(CO2) = 0,03
podczas utleniania
homometioniny trypletem 4-karboksybenzofenonu (Rozwadowski 1996).
12
Przyjęto kH = 2,52*1010 mol-1dm3s-1 uzyskaną dla Ac-Met, która dla homometioniny powinna
mieć zbliżoną wartość.
13
Obliczona ze wzoru (XIII) wydajność chemoradiacyjna rodników OH reagujących z
aminokwasem o stężeniu 2*10-3 mol dm-3 w pH 1 wynosi G(OH)sum ≈ 2,9.
14
Korzystając z molowego współczynnika absorpcji kationorodnika dimerowego (S∴S)+ ε490 =
8600+/-200 dm3mol-1cm-1 wyznaczonego dla pochodnych metioniny.
119
Z kolei, wykorzystując zmierzoną wydajność chemoradiacyjną dekarboksylacji
G(CO2) = 0,4 w roztworze homometioniny (10-2 mol dm-3, pH 1)15 (rysunek 4.2.4_3
krzywa a) i przyjmując poprzednie założenia oszacowana wartość wydajności
chemoradiacyjnej tworzącego się w tych warunkach kationorodnika dimerowego (S
∴S)+ wynosi 2,25. Podstawiając powyższe wartości do wzoru (XXX) otrzymujemy:
kNH ≈ 4,7*108 s-1
Porównanie wartości stałych szybkości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia
protonu od protonowanej grupy aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego
pokazuje wyraźnie, że stałe szybkości kNH rosną w szeregu: S-alkilowe pochodne
cysteiny (kNH ≈ 3*107 s-1) < homometionina (kNH ≈ 3,6*108 s-1 (średnia)) < metionina
(kNH ≈ 1,7*109 s-1). Obserwowany trend w wartościach kNH pokrywa się wyraźnie z
jednocześnie rosnącymi wydajnościami chemoradiacyjnymi kationorodników z
wewnątrzcząsteczkowymi wiązaniami S∴N. Energia stabilizacji tego typu rodników
może być jednym z czynników zwiększających siłę napędową reakcji przeniesienia
protonu (S-alkilowe pochodne cysteiny i metionina).
Nie można również wykluczyć roli czynnika konformacyjnego w cyklicznej
strukturze wewnątrz której następuje przeniesienia protonu. W tego typu strukturach
ważną rolę mogą odgrywać wiązania wodorowe, które mogą stabilizować lub
destabilizować konformacje wewnątrz których preferowane jest przeniesienie
protonu. Wyjaśnienie tego problemu wymaga jednak intensywnych badań na
układach modelowych, w których można zmieniać w sposób kontrolowany giętkość
konformacyjną cząsteczki.
4.3.2. Dekarboksylacja
Wysoką wydajność dekarboksylacji obserwuje się dla wszystkich badanych
aminokwasów tioeterowych. Siłą napędową procesu dekarboksylacji jest, jak już
wspomniano, energia stabilizacji powstających w procesie rodników αaminoalkilowych (patrz tabela 8 punkt 6.2).
Obserwowana
korelacja
pomiędzy
wydajnością
chemoradiacyjną
kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym S∴N
(rysunek 4.3_3 krzywa c) a wydajnością chemoradiacyjną dekarboksylacji w
15
Obliczona ze wzoru (XIII) wydajność chemoradiacyjna rodników OH reagujących z
aminokwasem o stężeniu 10-2 mol dm-3 w pH 1 wynosi G(OH)sum ≈ 3,3.
120
metioninie (rysunek 4.3_3 krzywa a) dowodzi, że kationorodniki te są prekursorami
dekarboksylacji (schemat 7).
1.2
c
1.0
a
0.6
X
G /G
OH
0.8
0.4
b
0.2
0.0
0
2
4
6
8
10
pH
Rys. 4.3_3. Wydajność CO2 (wyrażona jako Gx/GOH) dla Met (a) i Ac-Met (b) oraz
wydajność kationorodników (S∴N)+ dla Met mierzona w 390 nm16 (wyrażona jako
Gx/GOH) (c) w 2*10-3 mol dm-3 nasyconych N2O roztworach aminokwasów, w
zależności od pH (dla pomiarów CO2 zakresie pH 0 - 3,5 stężenia badanych
związków wynosiło 10-2 mol dm-3).
16
Obserwowana wydajność kationorodnika (S∴N)+ nie jest wydajnością pełną, ponieważ
k
k
powstaje on jako produkt przejściowy w reakcji następczej typu A 
→ B 
→ C . Dlatego wartości
G((S∴N)+)pH zostały obliczone przy hipotetycznym założeniu, że kationorodnik (S∴N)+ nie zanika
1
2
tj. stała szybkości k2 = 0. Odpowiednie wielkości zostały uzyskane z dopasowania numerycznego
funkcji [B]t= f(t) (XXXII) do przebiegów doświadczalnych G*ε(λ390nm)t= f(t). Równanie (XXXII)
opisuje wielkość stężenia produktu przejściowego dla dwu następujących po sobie reakcji pierwszego
rzędu (Capellos i Bielski 1972, Schwetlick 1975, Emanuel i Knorre 1984).
[ B ]t =
gdzie:
[ A ]0 k1 − k1t
(e − e − k 2 t )
k 2 − k1
(XXXII)
[B]t - stężenie produktu przejściowego B ((S∴N)+) po czasie t, [A]0 - stężenie
początkowe substratu A (rodnika hydroksysulfuranylowego), k1 i k2 - stałe szybkości powstawania i
zaniku produktu przejściowego [s-1].
Wartości G((S∴N)+)*ε otrzymuje się gdy w równaniu (XXXI) podstawimy k2 = 0, wtedy dla czasu t
= t∞ G((S∴N)+)*ε = [B]t∞ = [A]0
121
Schemat 7
CO2-
CO2H2N.
+. .
S
H2N
+.
S
R
R
((S∴N)+)
kET1
.
.
CO2
kdec
H2N
S
R
CH
H2N
_ CO
S
2
R
(αN)
Wyznaczenie stałej szybkości najwolniejszego etapu limitującego szybkość
powstawania rodników α-aminoalkilowych w metioninie jest możliwe
wykorzystując reakcję z p-nitroacetofenonem (reakcja 37, punkt 4.2.2). Zależność
pseudo-pierwszorzędowej stałej szybkości powstawania anionorodnika PNAP.wykazuje dla wysokich stężeń PNAP wyraźne odchylenie od liniowości (rysunek
4.3_4). Oznacza to, że proces prowadzący do powstawania rodników
αaminoalkilowych jest procesem limitującym17 powstawanie PNAP.-. Z wartości
plateau oszacowana stała szybkości najwolniejszego etapu decydującego o szybkości
powstawania rodników α-aminoalkilowych wynosi 2,5*106 s-1. Z kolei obliczona
wartość stałej szybkości zaniku kationorodnika (S∴N)+ zmierzona bezpośrednio w
maksimum absoprcji λmax = 390 nm (rysunek 4.3_5) wynosi 3,8*106 s-1. Świadczy
to, że reakcją limitującą szybkość powstawania rodników α-aminoalkilowych w
metioninie nie jest otwarcie pięcioczłonowego pierścienia kationorodnika (S∴N)+.
Na podstawie dotychczasowych danych eksperymentalnych nie można jednak
jednoznacznie stwierdzić, która z reakcji (reakcja wewnątrzcząsteczkowego
przeniesienia elektronu kET1 czy reakcja homolitycznego pęknięcia wiązania węgielwęgiel kdec, schemat 7) decyduje o szybkości całego procesu.
17
Patrz przypis 6 punkt 4.2.1.
122
2.5
kexp*10-6 (s-1)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
4
20
-3
[PNAP]*10 (mol dm )
Rys. 4.3_4 Zależność stałej szybkości powstawania anionorodnika PNAP.- w 2*10-2
mol dm-3 roztworze Met nasyconym N2O w pH 6, od stężenia p-nitroacetofenonu
[PNAP].
G*ε (mol-1dm3cm-1)
20000
15000
10000
5000
0
-0.4
0.0
0.4
0.8
czas (µ s)
1.2
1.6
Rys. 4.3_5 Kinetyka zaniku pasma absorpcji kationorodników (S∴N)+ zmierzona w
λmax = 390 nm, w roztworze 5*10-2 mol dm-3 Met o pH = 5,9.
Bardzo wydajna dekarboksylacja zachodzi także w S-alkilowych pochodnych
cysteiny (krzywe a w rysunkach: 4.2.3_8, 4.2.3_9 i 4.2.3_10) pomimo
nieobserwowania
kationorodników z wewnątrzcząsteczkowymi wiązaniami
trójelektronowymi S∴N wśród produktów przejściowych utleniania. Prowadzą do
niej procesy przedstawione na schematach 4 i 5.
Na uwagę zasługuje obserwacja stosunkowo wysokiej wydajności
dekarboksylacji w N-acetylometioninie (patrz rysunki 4.2.2_7 krzywa c i 4.3_3
123
krzywa b) mimo braku możliwości wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu
od grupy aminowej i utlenienia atomu azotu. Najbardziej prawdopodobnym
mechanizmem dekarboksylacji tej cząsteczki jest mechanizm typu pseudoKolbego18.
4.3.3. Fragmentacja rodników α-aminoalkilowych
Rodniki α-aminoalkilowe, powstające w liniowych S-alkilowych pochodnych
cysteiny w wyniku dekarboksylacji na N-końcu cząsteczki, tylko w niewielkim
stopniu redukują PNAP pomimo silnych własności redukujących wynikających z
niskiego potencjału jonizacji (patrz tabela 8). Tworzenie się z jednej strony aldehydu
octowego19, a z drugiej identyfikacja rodników sulfanylowych (RS.) świadczy o
fragmentacji wiązania pomiędzy atomami węgla (Cβ) i siarki. Ten typ fragmentacji
jest charakterystyczny dla rodników z miejscem rodnikowym zlokalizowanym na
węglu i zawierających heteroatom w pozycji β (Huyser i Kellogg 1966 Huang i in.
1974, Ito i Matsuda 1988, Fossey i in. 1995, Baciocchi i in. 1996). Zaproponowany
mechanizm β-fragmentacji dla rodników α-aminoalkilowych przedstawiono na
schemacie 8.
Schemat 8
.
H2C S CH CH NH2
R1
R2
kf
H2C S.
R1
+
CH CH NH2
CH2 CH NH
R2
R2
H2O
VCVC-.
O
H2C
R2
C
+
H
18
Patrz reakcja [28].
19
W tiaizoleucynie oberwowano tworzenie się aldehydu propionowego.
NH3
124
W wyniku β-fragmentacji (kf, schemat 8) powstają rodniki alkilosulfanylowe
.)
(RS i odpowiednia winyloamina. Winyloamina tautomeryzuje do odpowiedniej
iminy, która ulega hydrolizie do odpowiedniego aldehydu (octowego lub
propionowego). Mechanizm ten został potwierdzony poprzez identyfikację i
ilościowe oznaczenie w produktach reakcji utleniania S-alkilowych pochodnych
cysteiny rodnikiem wodorotlenkowym: rodników alkilosulfanylowych oraz
aldehydów octowego i propionowego (dla tiaizoleucyny). Rodniki alkilosulfanylowe
zostały zidentyfikowane pośrednio, wykorzystując ich własności utleniające, w
reakcji z kwasem askorbinowym (patrz reakcja 38).
Zmierzone stałe szybkości β-fragmentacji rodników α−aminoalkilowych
znajdują się w przedziale (1,2 - 4,7)*106 s-1 (Tabela 6). Energia aktywacji reakcji
fragmentacji rodników α−aminoalkilowych została oszacowana na około 54 kJ mol-1
(Goez i in. 1996, Rozwadowski 1996). Przy założeniu, że reakcje fragmentacji (kf) i
redukcji PNAP (k(PNAP+αN)) konkurują ze sobą (schemat 8) musi być spełniona
zależność (XXXIII), z której można obliczyć stałą szybkości fragmentacji (kf)
rodników α-aminoalkilowych.
kf
k f + k (PNAP +αN ) [ PNAP ]
=
G(CO2 )− G(PNAP .− )
G(CO2 )
(XXXIII)
gdzie:
kf - stała szybkości fragmentacji rodników α-aminoalkilowych, k(PNAP+αN) stała szybkości reakcji rodników α-aminoalkilowych z p-nitracetofenonem PNAP,
[PNAP] - stężenie p-nitroacetofenonu.
Obliczenia wykonane dla S-metylocysteiny w pH ~6 prowadzą20 do wartości kf ~
2,4*106 s-1. Wartość ta jest w doskonałej zgodności z wartością kf zmierzoną
bezpośrdnio z szybkości zaniku pasma absorpcji w λmax = 260 nm (tabela 6). Ten
fakt wyjaśnia przyczynę niskiej wydajności chemoradiacyjnej G(PNAP.-) w
roztworach zawierających S-alkilowe pochodne cysteiny.
Ważnym czynnikiem wpływającym na szybkość β-fragmentacji jest entalpia
tworzenia powstających produktów rodnikowych i cząsteczkowych (Fossey i in.
Do obliczeń przyjęto następujące wielkości: G(CO2) = 5,9, G(PNAP.-) = 0,16 (z rysunku
4.2.3_4), [PNAP] = 3*10-5 mol dm-3 oraz wartość k(PNAP+αN) = 2,39*109 mol-1dm3s-1 obliczoną dla
metioniny z tg nachylenia prostej (rysunek 4.3_4) w zakresie niskich stężeń PNAP. Ze względu na
20
zbliżone potencjały joniazcji (IP) rodników α-aminoalkilowych stałe szybkości redukcji PNAP
(k(PNAP+αN)) w metioninie i pochodnych cysteiny nie powinny różnić się zasadniczo.
125
1995). Reakcja fragmentacji rodników α-aminoalkilowych w tiaizoleucynie,
korzystniejsza energetycznie ze względu na entalpię tworzenia winyloaminy21,
zachodzi ze stałą szybkości (kf) prawie dwukrotnie wyższą niż w S-metylocysteinie
(tabela 6).
Drugim istotnym czynnikiem wpływającym na szybkość β-fragmentacji jest
czynnik entropowy (Fossey i in. 1995). Potwierdza to porównanie stałych szybkości
fragmentacji (kf) rodników α-aminoalkilowych powstałych z S-metylocysteiny i
tiaproliny (jej cyklicznego analogu) (tabela 6). Podobnie jak w innych procesach
fragmentacji rodników szybkość procesu i w tym przypadku jest kontrolowana przez
entropię, która wzrasta wraz ze zwiększającą się liczbą powstających w reakcji
indywiduów chemicznych. Ograniczenie (przez cyklizację) możliwości rozpadu
cząsteczki na małe stabilne fragmenty w przypadku tiaproliny powoduje ponad
trzydziestokrotne zmniejszenie stałej szybkości fragmentacji w stosunku do
Cys(Me).
4.3.4. Tworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań trójelektronowych
Jedną z ważniejszych dróg zaniku rodnika hydroksysulfuranylowego w
aminokwasach jest tworzenie indywiduów przejściowych z wewnątrz- i
międzycząsteczkowymi wiązaniami trójelektronowymi. Wydajność procesów
prowadzących do wewnątrzcząsteczkowych wiązań typu S∴N i S∴O jest ściśle
uwarunkowana geometrią cząsteczki aminokwasu (związaną z liczbą wiązań
kowalencyjnych oddzielających atom siarki i heteroatom), liczbą grup funkcyjnych
(aminowych i karboksylowych) w cząsteczce aminokwasu, oraz steżęniem
aminokwasu i protonów w środowisku reakcji. Szczególnie uprzywilejowaną
konformacją kationorodników i rodników z wiązaniami trójelektronowymi jest
pięcioczłonowa struktura cykliczna. Potwierdzają to obserwacje wydajności
kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym pomiędzy
siarką i azotem w metioninie i jej pochodnych (rysunki: 4.2.2_1, 4.2.2_3, 4.2.4_2)
oraz rodników i kationorodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem
trójelektronowym pomiędzy siarką i tlenem w S-metylocysteinie (rysunek 4.2.3_1) i
jej pochodnych (rysunki: 4.2.3_6, 4.2.3_7) oraz S-alkiloglutationach (rysunki:
4.2.5_2 i 4.2.5_4).
21
Obliczone metodą AM1 entalpie tworzenia (∆Hf) winyloamin CH2=CH-NH2 i CH3-CH=CH-
NH2 wynosząd odpowiednio 11,4 i 1,6 kcal mol-1.
126
Reakcja prowadząca do wewnątrzcząsteczkowego wiązania trójelektronowego
pomiędzy siarką i azotem ma istotny udział w procesie zaniku rodnika
hydroksysulfuranylowego w warunkach niskiego stężenia protonów środowiska
reakcji oraz niskiego stężenia aminokwasu. Jest to zrozumiałe w świetle
mechanizmu przedstawionego na schemacie 2. W tych warunkach jest
faworyzowana reakcja wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu od grupy
aminowej do rodnika hydroksysulfuranylowego (kNH). Z kolei podwyższenie stężenia
protonów oraz stężenia aminokwasu prowadzi odpowiednio do monomerycznego
kationorodnika >S.+ oraz dimerowego kationorodnika z międzycząsteczkowym
wiązaniem trójelektronowym S∴S, co przy jednoczesnej obecności protonowanej
grupy aminowej w cząsteczce aminokwasu (niedostępna wolna para elektronów na
atomie azotu) uniemożliwia utworzenie wewnątrzcząsteczkowego wiązania
trójelektronowego (S∴N).
Reakcja prowadząca do wewnątrzcząsteczkowego wiązania trójelektronowego
pomiędzy siarką i tlenem ma istotny udział w warunkach wysokiego stężenia
protonów środowiska reakcji oraz niskiego stężenia aminokwasu. Jest to szczególnie
widoczne dla S-metylocysteiny i jej pochodnych. W niskim pH rodnik
hydroksysulfuranylowy zanika głównie w katalizowanej protonami reakcji eliminacji
cząsteczki wody, która prowadzi do monomerycznego kationorodnika >S.+.
Jednoczesna dostępność wolnej pary elektronowej na atomie tlenu i niskie stężeniu
aminokwasu (zmniejszające udział procesu międzycząsteczkowego prowadzącego
do dimerowego kationorodnika z wiązaniem trójelektronowym S∴S) stwarza
optymalne warunki do wytworzenia rodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem
S∴O. Podwyższenie pH roztworu, czego konsekwencją jest wydłużenie czasu życia
rodnika hydroksysulfuranylowego, zwiększa udział konkurencyjnej reakcji
wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu prowadzącej do rodników ###aminoalkilowych (rysunki: 4.2.3_1, 4.2.3_2 i 4.2.3_6).
Wpływ liczby grup funkcyjnych w cząsteczce aminokwasu na kierunek reakcji
rodnikowych prowadzących do wewnątrzcząsteczkowych wiązań trójelektronowych
można było doskonale prześledzić na przykładzie S-metylocysteiny i jej dwóch
pochodnych: S-karboksyetylocysteiny i lantioniny. Wyższą wydajność rodników z
wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem S∴O w S-karboksyetylocysteinie (rysunek
4.2.3_6, krzywa b i c) w porównaniu z S-metylocysteiną (rysunek 4.2.3_1, krzywa b
i c), można wyjaśnić obecnością drugiej grupy karboksylowej znajdującej się w
pozycji ###∋ do siarki w cząsteczce aminokwasu. Umożliwia to poza powstawaniem
rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem S∴O (struktura I) obecnych
127
również w S-metylocysteinie i S-karboksymetylocysteinie, powstawanie rodników z
wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem S∴O (struktura II).
NH3+
NH3+
(H+)-O2C CH2 CH2 S .
. .
O
O
. S CH2 CH
. .
O
CO2-(H+)
O
(I)
(II)
W niskim pH (~1) proces prowadzący do ich powstania skutecznie konkuruje z
procesem prowadzącym do powstania dimerowego kationorodnika z
międzycząsteczkowym wiązaniem trójelektronowym S∴S (co przejawia się
znacznie węższym pasmem absorpcji z λmax = 390 nm ze względu na nieobecność
wyraźnego ramienia absorpcji w obszarze 450 - 500 nm). Z kolei w wyższym pH
(~3,9) proces prowadzący do ich powstania konkuruje z procesem
wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu (kNH) (co przejawia się pojawieniem
pasma absorpcji z λmax = 390 nm).
Obecność drugiej grupy aminowej w pozycji α do siarki, przy jednoczesnej
obecności dwóch grup karboksylowych w pozycji α do siarki (lantionina)
manifestuje się niższą wydajnością rodników z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem
S∴O (rysunek 4.2.3_7) w porównaniu do S-karboksyetylocysteiny (rysunek
4.2.3_6), co świadczy o zwiększeniu się ponownie udziału reakcji
wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu (kNH).
H
H2N
(H+)-O2C
H
OH
NH2
.
CH CH2 S CH2 CH
CO2-(H+)
4.3.5. Addycja rodnika wodorotlenkowego do nukleofilowego atomu azotu.
W cząsteczkach aminokwasów tioeterowych proces utleniania rodnikiem
wodorotlenkowym, może być również inicjowany przez jego atak na nukleofilowy
atom azotu w grupie aminowej. Podobnie jak to ma miejsce w aminokwasach
alifatycznych, reakcja ta może zachodzić wydajnie wtedy, gdy grupa aminowa jest
deprotonowana, a wolna para elektronowa na azocie jest odsłonięta (tj. w warunkach
pH wyższego od pKa grupy aminowej (patrz tabela 7, punkt 6.1)) (Mönig i in. 1985b,
Bobrowski i in. 1994a). Addycja rodnika OH do deprotonowanej grupy aminowej
128
(k(OH + S), schemat 9) prowadzi bezpośrdnio do utleniania azotu i w konsekwencji do
dekarboksylacji22 poprzedzonej wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem elektronu z
grupy karboksylowej do utlenionego centrum rodnikowego na azocie (kET1, schemat
9).
Schemat 9
NH2
R S (CH2)n CH
CO2-
+
.OH
k(OH + N)
k(OH + S)
OH
.
NH2
R S (CH2)n CH
CO2-
OH
NH2
.
R S (CH2)n CH
CO2kd
_ OH-
NH2
.+
R S (CH2)n CH
CO2-
_ OH-
CO2CH
H2N
.
+. .
S
R
.+
NH2
R S (CH2)n CH
CO2-
(CH2)n
kET2
kX
∗
kET1
(αS)
_ CO
2
(αN)
R = CH3 , C2H5
kX = kD
R = CH2CO2-
kX = kET3
R = CH2CH2CO2-
kX = kC
* - Jest to struktrura hipotetyczna; można również postulować obecność rodnika iminowego
będącego w równowadze kwasowo-zasadowej z kationorodnikiem -NH2.+ (Hug i in. 1996).
22
Mechanizm ten jest odpowiedzialny za wysoką wydajność dekarboksylacji w aminokwasach
alifatycznych w roztworach alkalicznych (Mönig i in. 1985b, Bobrowski i in. 1994a).
129
Pojawienie się tego kanału reakcji w roztworach alkalicznych tłumaczy wzrost
wydajności
redukcji
p-nitroacetofenonu
w
S-karboksymetylo-,
Skarboksyetylocysteinie
(rysunek 4.2.3_10 krzywe b i c), który jest odbiciem
wzrostu wydajności chemoradiacyjnej rodników α-aminoalkilowych tych
związkach. Zgodnie z mechanizmem przedstawionym na schemacie 9 jest to
spowodowane
zmniejszeniem
udziału
procesu
wewnątrzcząsteczkowego
przeniesienia elektronu (kET3), który prowdzi do rodników α-(alkilotio)alkilowych (α
S)23.
4.3.6. Reakcje rodnikowe w S-alkilowych pochodnych glutationu
Przedstawione w rozdziale 4.2.5. wyniki badań S-alkilowych pochodnych
glutationu metodą radiolizy impulsowej, uzupełnione przez wcześniejsze dane
literaturowe (Bobrowski i in. 1991) dotyczące wydajności chemoradiacyjnej
dekarboksylacji, umożliwiły zaproponowanie mechanizmu reakcji, wyjaśniającego
dotychczasowe obserwacje eksperymentalne w S-alkiloglutationach (reakcja [40] i
schematy 10 i 11).
Pomimo braku bezpośredniej obserwacji rodnika hydroksysulfuranylowego w Salkiloglutationach, opierając się na danych literaturowych dotyczących reaktywności
aminokwasów z rodnikiem wodorotlenkowym, przyjęto, że pierwotnym miejscem
jego ataku w cząsteczce S-alkiloglutationu jest jednostka S-alkilocysteiny, a
konkretnie jej grupa tioeterowa (reakcja [40]).
23
Rodniki α-(alkilotio)alkilowe ze względu na niższy potencjał utleniania-redukcji nie redukują
PNAP (patrz rysunek 4.2.1_6).
130
O
+
H3N
O
CH CH2 CH2 C NH CH C NH CH2 CO2CH2
O2C
S
R
-
+
O
+
H3N
.
OH
O
CH CH2 CH2 C NH CH C NH CH2 CO2CH
O2C
. 2
HO S
R
[40]
Utworzony rodnik hydroksysulfuranylowy ulega dalszym reakcjom następczym,
które zależą od warunków eksperymentalnych takich jak stężenie peptydu oraz pH
roztworu. W roztworach słabo kwaśnych i obojętnych istotny udział w zaniku
rodnika hydroksy-sulfuranylowego ma reakcja wewnątrzcząsteczkowego
przeniesienia protonu od grupy aminowej N-końcowego kwasu glutaminowego do
rodnika hydroksysulfuranylowego (schemat 10).
Schemat 10
O
-
O
O2C
O
CH CH2 CH2 C NH CH C NH CH2 CO2+
CH
H2N
. 2
HO S
H
R
H2C
kNH
_
C
H2C
H2O
CH
-
O2C
NH
O
CH
C NH CH2 CO2-
CH2
+
.
H2N. . S
R
O
O
H2C
H2C
. CH
H2N
C
NH
CH
O
C NH CH2 CO2-
CH2
S
C
H2C
wiązania C-C
-
+ CO2
R
H2C
homolityczne pęknięcie
O2C
NH
O
CH
C NH CH2 CO2-
CH2
CH
H2N S
+.
przeniesienie
elektronu
R
131
Reakcja ta prowadzi do utworzenia kationorodnika z wewnątrzcząsteczkowym
wiązaniem trójelektronowym S∴N, którego obecność zidentyfikowano w widmie
absorpcyjnym w nanosekundowej skali czasowej (rysunek 4.2.5_3). Indywiduum to
jest w równowadze dynamicznej z kationorodnikiem -NH2.+, w którym
wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie elektronu i homolityczne pęknięcie wiązania
węgiel-węgiel prowadzi w konsekwencji do dekarboksylacji cząsteczki z
jednoczesnym utworzeniem rodników α-aminoalkilowych. Zarówno CO2 jak i
rodniki α-aminoalkilowe zostały zidentyfikowane jako produkty fragmentacji Salkiloglutationów (Bobrowski i in. 1991a). Fakt, że wyznaczone wydajności CO2 i
rodników α−aminoalkilowych były niższe od wydajności rodników
wodorotlenkowych sugerował, że w cząsteczkach S-alkiloglutationów mają miejsce
inne procesy rodnikowe, które konkurują z wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniem
protonu. Opierając się na mechanizmach utleniania rodnikami wodorotlenkowymi
opracowanych dla aminokwasów tioeterowych takimi reakcjami konkurującymi
mogą być: (i) reakcja spontanicznej dysocjacji rodnika hydroksysulfuranylowego
(kd), (ii) reakcja katalizowanej protonami środowiska eliminacji cząsteczki wody
(kH), (iii) oraz reakcja podstawienia anionu OH- przez drugą cząsteczkę peptydu (kS)
(schemat 11).
Schemat 11
O
+
H3N
O
CH CH2 CH2 C NH CH C NH CH2 CO2CH
O2C
. 2
HO S
R
-
kNH
_H O
2
kd
_ OH-
kH
H3O+
_HO
2
.
H2N CH CH2
+
CO2
_
S
S .+
R
OH-
kS
S
+
.
S. .S
R
_
kC
OH-
CH
H2C
C NH
+
R
R
.
S . .O
Obecność w widmie absorpcji S-alkiloglutationów zarówno w roztworach kwaśnych
jak i obojętnych intensywnego długożyciowego pasma absorpcji z λmax = 390 nm,
132
przy jednoczesnym braku wyraźnej i charakterystycznej absorpcji kationorodników
dimerowych z wiązaniem S∴S świadczy, że ważnym procesem konkurującym nie
jest zgodnie z oczekiwaniami proces tworzenia kationorodnika dimerowego z
wiązaniem S∴S lecz proces tworzenia kationorodnika z wewnątrzcząsteczkowym
wiązaniem trójelektronowym pomiędzy siarką i tlenem w wiązaniu peptydowym (kC,
schemat 11). Przypisanie pasma absorpcji konkretnie temu indywiduum ma swoje
uzasadnienie, poparte zarówno obserwacjami eksperymentalnymi jak i
wcześniejszymi doniesieniami literaturowymi. Po pierwsze, położenie maksimum i
szerokość pasma absorpcji wskazywało, że jest to indywiduum z wiązaniem
trójelektronowym pomiędzy siarką i tlenem; po drugie, względnie długi czas życia
indywiduum wykluczał, że jest to atom tlenu z N- lub C-końcowej grupy
karboksylowej; po trzecie, znacznie niższa wydajność tworzenia się tego
indywiduum w Glu(MetGly), w którym taki kationorodnik miałby cykliczną
strukturę sześcioczłonową; oraz po czwarte tego typu wiązania pomiędzy siarką i
tlenem „karbonylowym” obserwowano w estrze metylowym kwasu 2(metylotio)etanowego (Bobrowski i Schöneich 1993). Jest to obserwacja
interesująca, ponieważ pokazuje na ważną rolę wiązania peptydowego w stabilizacji
utlenionego centrum zlokalizowanego na atomie siarki.
Zmniejszenie wydajności dekarboksylacji w S-alkilowych pochodnych
glutationu wraz ze wzrostem własności elektrodonorowych podstawnika R (nBu >
Me) (Bobrowski 1990, Bobrowski i in. 1991b) można wyjaśnić zwiększoną
rezonansową stabilizacją protonowanej formy rodnika hydroksysulfuranylowego.
Prowadzi to w konsekwencji do zwiększonej wydajności monomerycznego
kationorodnika >S.+ i następnie jego stabilizacji w wyniku utworzenia
wewnątrzcząsteczkowego wiązania S∴O (kC, schemat 11). Proces ten zachodzi
kosztem reakcji wewnątrzcząsteczkowego przeniesienia protonu prowadzącej do
kationorodnika z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem S∴N (kNH, schemat 11).
Potwierdza to większy udział w widmie absorpcji Glu(Cys(nBu)Gly) (rysunek
4.2.5_4,) pasm absorpcji przypisanych rodnikom z wewnątrzcząsteczkowym
wiązaniem S∴O oraz rodnikom α−(alkilotio)alkilowym w porównaniu do widma
absorpcji w Glu(Cys(Me)Gly), gdzie istotny udział w krótkofalowym zakresie
widma mają rodniki α-aminoalkilowe (rysunek 4.2.5_3).