Jak ugryźć technikę FISH? - DolinaBIOtechnologiczna.pl

Informacje można magazynować w
DNA
Jerome Bonnet i Pakpoom Subsoontorn – badacze z Uniwersytetu
Stanforda w USA dowiedli w „Proceedings of the National Academy of
Sciences” (PNAS) że potrafią zapisywać i magazynować informacje – a
konkretnie zera i jedynki – w genomie bakterii. Co więcej, potrafią tak
zmagazynowaną informację również odczytywać i zmieniać.
Bonnet i Subsoontorn ogłosili w PNAS, że przy pomocy odpowiednich enzymów
potrafią modyfikować w genomie bakterii niektóre sekwencje DNA. W ten sposób
można uzyskać zapis jednego bitu – czyli w praktyce najmniejszą porcję informacji
w postaci zero-jedynkowej.
W przypadku opisanym w publikacji, która przedstawia bardzo zaawansowane
badania molekularne, trik polega na tym, że badacze tak zmodyfikowali genom
E.coli, że mogą one świecić w świetle ultrafioletowym na czerwono lub zielono.
Jeden z tych kolorów to zero, drugi to jedynka.
Mimo, że badania zajęły kilka lat i sukces przyszedł dopiero po ponad 750
próbach, można go jednak uznać za przełom. Jak podkreślają autorzy pracy
odkryty przez nich mechanizm umożliwi dokładniejsze zbadanie procesów
zachodzących we wnętrzu komórki, oraz między innymi: procesów starzenia, czy
karcynogenezy.
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
Publikacja źródłowa: Jerome Bonnet, Pakpoom Subsoontorn, and Drew Endy:
Rewritable digital data storage in live cells via engineered control of
recombination directionality.
Jak ugryźć technikę FISH?
Wygodna przeglądarka sond
Nowa przeglądarka sond od firmy Agilent Technologies jest przyjaznym
dla użytkownika i bardzo wygodnym narzędziem, które nadaje się nawet
dla osób zaczynających przygodę z techniką FISH. W tym artykule, na
przykładzie kilku print screenów pokazujemy możliwości tego
oprogramowania.
Nowa przeglądarka sond znajdująca się na stronie Agilent Technologies jest
wygodnym narzędziem bioinformatycznym. Ważną zaletą tego oprogramowania
jest bezpośrednie podpięcie do bazy danych UCSC. Co więcej –
oprogramowanie SureFISH jest podpięte do specjalistycznego programu
Cytogenomics służącego do analizy mikromacierzy aCGH.
Dzięki sondom SureFISH można obrazować nie tylko DNA ale i RNA:
http://www.genomics.agilent.com/files/LitItems/AACR_2012_Agilent_FISH_Poster
5020.pdf
Od czego zaczynamy?
1. Wejdź na stronę Agilent Technologies:
http://www.genomics.agilent.com/eFishMain.aspx.
2. Kliknij na nr chromosomu, który jest w obszarze Twojego
zainteresowania.
3. Wyświetli sie obraz chromosomu i propozycje sond, które możesz
zamówić. Nie wszystkie możliwości są dostępne, jednak Agilent cały czas
dodaje nowe produkty.
4. Wybierz fragment chromosomu, który jest w obszarze Twoich
zainteresowań:
5. Podejrzyj możliwości hybrydyzacji:
6. Z przeglądarki sond możesz bezpośrednio wejść do przeglądarki
genomowej UCSC:
7. Możesz również wyszukiwać sondy pasujące do konkretnych genów za
pomocą okienka wyszukiwarki w prawym, górnym rogu ekranu.
Teraz możesz zamówić sondę. Nie zapomnij o sondzie centromerowej
(zwykle znakowanej kolorem zielonym). Powodzenia!
Real-Time PCR (IV): Pomiar
względny i bezwzględny ilości
kopii
Ilościowy PCR znajduje zastosowanie w różnych sytuacjach: pozwala
oszacować ilość kopii matrycy, porównać kilka różnych próbek pod
względem różnic w ilości kopii albo orzec o zmianie ilości cząsteczek
matrycy w czasie. Pierwsze zastosowanie wymaga innej strategii
postępowania niż dwa kolejne: możemy tu mówić o ilościowaniu
bezwzględnym i względnym. Co wyróżnia oba podejścia i gdzie konkretnie
maja zastosowanie?
1. Co decyduje o przyjętej formie pomiaru ilości kopii?
Decyzja o sposobie pomiaru jest podyktowana zastosowaniem wykonywanego
przez nas oznaczenia. Pomiar bezwzględnej liczby kopii jest stosowany w sytuacji,
gdy zależy nam nie tylko na określeniu zmian w ilościach produktu np. w czasie
kilku eksperymentów, czy też na wykazaniu różnic w ekspresji genu pomiędzy
próbami, ale także na konkretnej, bezwzględnej wartości liczbowej. Jest to
trudniejsze, gdyż wymagane jest wybranie standardów o ściśle określonej ilości
kopii i bardzo zbliżonej kinetyce reakcji co próbka badana. Oznaczenia
bezwzględne wykonywane są dlatego rzadziej, służą np. do: szacowania ilości
mikroorganizmów w żywności, pomiaru ilości GMO w produktach spożywczych
czy też poziomu wiremii w diagnostyce wirusologicznej.
2. Pomiar bezwzględnej ilości transkryptu
Pomiar bezwzględny dokonywany jest przez porównanie wartości Ct próbki z
krzywą kalibracyjną, wykreśloną na podstawie standardów o dokładnie znanym
stężeniu. Nie jest wymagany żaden gen referencyjny, bo nie potrzebujemy
obliczać poziomu ekspresji względem niczego, potrzebujemy określonej wartości
liczbowej, zależnej tylko od zawartości żądanej matrycy w naszej próbce i od
wielkości próbki pobranej do badania z większej całości (stosujemy więc
konkretną jednostkę, np. kopie genomu na ml surowicy). W ilościowaniu GMO
stosuje się bardziej zaawansowana strategię podobną raczej do względnego
pomiaru ilości matrycy: wykonuje się 2 pomiary bezwzględne (jeden dla ilości
markera GMO, drugi dla ilości genomów), po czym wyznacza się wartość
procentową (genomy GMO/wszystkie genomy *100% lub wagowo: ilość gramów
GMO na gram biomasy roślinnej).
3. Pomiar względnej ilości transkyptu
Pomiar względny ilości kopii opiera się na założeniu, że informacja o zmianie
stosunku ilościowego pomiędzy dwoma parametrami jest wystarczająca dla
naszego eksperymentu. Tę strategię stosuje się podczas obserwacji zmian
ekspresji w czasie, porównywania ekspresji pomiędzy próbami oraz np. przy
pomiarze tzw. obciążenia mutacją i szacowaniu ilości kopii genu w genomie.
Żeby przeprowadzić taki pomiar potrzebujemy próby odniesienia. Może nią być:
-gen referencyjny o stałej ekspresji, tzw. housekeeping gene, czyli kontrola
endogenna
-sztucznie wprowadzona z zewnątrz cząsteczka kwasu nukleinowego (tzw.
„spike”), czyli kontrola egzogenna
-indeks referencyjny będący średnią z kilku genów referencyjnych
-średni poziom genu badanego, otrzymany przez uśrednienie wszystkich
pomiarów dla genu badanego
Ilościowanie prowadzone jest poprzez porównanie wartości Ct pomiędzy próbą
badaną a naszą próbą odniesienia. Wartość jaką otrzymujemy nie posiada
jednostki i informuje nas jaka jest ilość kopii amplikonu w odniesieniu do
kalibratora.
Można takie wartości ze sobą porównywać dzięki zastosowaniu pewnych wzorów
matematycznych, np. po to aby:
-porównać naszą próbkę z niestymulowana kontrolą
-zobaczyć jak zmienia się ekspresja w czasie w stosunku do próbki zmierzonej w
czasie T0
-zmierzyć różnice między zdrową populacją a stanami chorobowymi
-porównywać wyniki pacjenta w kilku laboratoriach diagnostycznych.
W kolejnej części cyklu zajmiemy się w szczegółach sposobami
normalizacji wyników Real-Time PCR.
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
Nowy cykl: Jak ugryźć technikę
FISH?
Jak ugryźć technikę FISH?
Planujesz rozpoczęcie badań metodą FISH i nie bardzo wiesz, jak się do tego
zabrać? W krótkiej serii artykułów o technice FISH przekonamy Cię, że metoda ta
nie jest wcale trudna i że dzięki naszym wskazówkom bez problemu
zaprojektujesz eksperyment, przeprowadzisz hybrydyzację i będziesz się cieszyć
doskonałej jakości zdjęciami. W serii tej opowiemy również o nowościach
odczynnikowych, które ostatnio ukazały się na rynku i podpowiemy Wam jakie
narzędzia bioinformatyczne ułatwią Wam pracę z tą techniką. Artykuły o technice
FISH ukażą się w najbliższych dniach!
Zobacz:
Technika
FISH
–
od
czego
zacząć:
http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/technika-fish-od-czego-zaczac/
Wygodna
przeglądarka
sond:
http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/jak-ugryzc-technike-fish-wygodna-przeg
ladarka-sond/
Innowacyjne sondy do FISH – znakomita rozdzielczość i niska cena:
http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/dont-look-bac-surefish-innowacyjne-son
dy-od-firmy-agilent-technologies/
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
Park nie zielony, ale naukowotechnologiczny
Przeciętnemu człowiekowi słowo „park” nie kojarzy się jeszcze z nauką,
techniką czy przedsiębiorczością. Większość zapewne słyszała o
fenomenalnym Central Park w Nowym Jorku, Hyde Parku w Londynie a
niektórzy o berlińskim Tiergarten, Parku Gaudiego w Barcelonie czy
parku Yellowstone w Rocky Moutains.
W Poznaniu nie ma takich atrakcji, za to od kilkunastu lat działa i dynamicznie
rozwija się utworzony przez Fundację UAM Poznański Park NaukowoTechnologiczny, zlokalizowany przy ulicy Rubież 46 na północy miasta.
Badania i
nauka na Rubieży
Sama nazwa ulicy oddaje zresztą dobrze lokalizację tej pięciohektarowej
inwestycji. Stąd blisko już do równie dynamicznie rozwijającego się kampusu
Morasko, gdzie zlokalizowane są nowe siedziby wydziałów fizyki, matematyki i
informatyki, geografii i geologii, biologii, nauk politycznych i dziennikarstwa
UAM. Poznański Park Naukowo-Technologiczny to wiodący ośrodek tego typu w
regionie. Jedną z dziedzin, wokół której skupia się funkcjonowanie parku jest
chemia. Działami Parku powiązanymi z tą dyscypliną i jej rozwojem są Centrum
Zaawansowanych Technologii Chemicznych, świadczące usługi analityczne,
syntetyczne i technologiczne. Z usług tych korzystają polskie firmy oraz i
zagraniczne koncerny chemiczne, które również mają zlokalizowane tutaj swoje
laboratoria badawcze. Poznańskie Laboratorium Izotopowe i unikatowe w skali
kraju Poznańskie Laboratorium Radiowęglowe (datowanie wieku próbek
organicznych metodą izotopową C14 z wykorzystaniem spektrometru AMS) oferują
swoje usługi naukowcom nie tylko z Polski, ale i z całej Europy, m.in. geologom i
archeologom, którzy również są lokatorami PPNT (Centrum Archeologiczne
prowadzące między innymi prace rekonstrukcyjne, badania wykopaliskowe i
powierzchniowe).
Przedsiębiorczość
PPNT to również doskonałe miejsce dla małego i dużego biznesu. Funkcjonuje tu
Centrum Wspierania Innowacji, świadczące usługi i pomoc dla firm pragnących
nawiązać kontakt z partnerami zagranicznymi, zdobyć nową technologię czy
środki z programów UE. Inkubator Technologiczny (InQbator) jest wsparciem i
miejscem działalności małych i średnich firm, inicjatorem cennych działań
probiznesowych. Służy pomocą początkującym przedsiębiorcom, osobom, które
chcą założyć własną firmę, pozyskać na nią środki i wsparcie merytoryczne.
Obszar jego działania to szkolenia, doradztwo, spotkania networkingowe,
wydawanie czasopism poświęconych przedsiębiorczości akademickiej, audyty
innowacyjności, wynajem powierzchni biurowej, sal szkoleniowych i
konferencyjnych, wsparcie działań promocyjnych, audycje radiowe – wszystko to
z myślą o początkującej i bardziej zaawansowanej działalności opartej o wiedzy,
technologiach i najnowszych osiągnięciach naukowych. Inkubator wspiera,
promuje i rozwija nowo powstające spółki technologiczne start-up i spin-off,
zapewnienia im przyjazne warunki oraz wsparcie merytoryczne rozwoju ich
działalności.
Inwestycje
Już wkrótce doskonałym miejscem dla tej działalności będzie planowany na drugą
połowę 2012 roku Zespół Inkubatorów Wysokich Technologii, gdzie firmy,
przedsiębiorcy, przyszli lokatorzy ZIWT będą mogli wynająć laboratoria
badawcze: chemiczne, biotechnologiczne, mikrobiologiczne oraz pracownie
informatyczne. Będą mogli również skorzystać z nowoczesnej, bezpiecznej i
2
niezawodnej serwerowni strefy biurowej oraz hali technologicznej. Ofertę 4500m
powierzchni dostępnej pod wynajem uzupełnia dostęp do wysoko specjalistycznej
aparatury badawczej, usług analitycznych i okołobiznesowych.
Najnowocześniejszy i największy tego typu kompleks w Wielkopolsce, inwestycja o
wartości 55 mln zł wraz z wyposażeniem, finansowana ze środków UE, oprócz
szerokopasmowego internetu z trzech niezależnych źródeł, atrakcyjnej przestrzeni
wspólnej, recepcji, przedszkola, parkingu, bufetu, sal konferencyjnych i czytelni
będzie oferować również doradztwo, szkolenia, pomoc w pozyskiwaniu środków,
technologii i kooperantów. Przyszli lokatorzy będą mogli jednocześnie korzystać
na miejscu z pozostałej, bogatej oferty już istniejących działów Poznańskiego
Parku Naukowo-Technicznego, między innymi z Centrum Zaawansowanych
Technologii Chemicznych (CZTChem).
Przyszłość
Ofertą Parku powinni zainteresować się wszyscy, którzy myślą o założeniu
własnej, konkurencyjnej i przyszłościowej działalności wykorzystującej osiągnięcia
nauki, nowoczesne media, technologie oraz ci, którzy chcą poprawić
konkurencyjność i podnieść innowacyjność swojej firmy. Bez wątpienia przyszłość
polskiej gospodarki należy do innowacyjnych przedsiębiorstw i osób potrafiących
wykorzystać kapitał wiedzy i nauki, dający przewagę, szansę przetrwania i
rozwoju na rynku w wieloletniej perspektywie. Doświadczenie, sukcesy i renoma
PPNT oraz jego śmiałe i bogate plany inwestycyjne oraz rozwojowe pozwalają
mieć przekonanie, że w tym miejscu biznes i nauka tworzą udane połączenie.
Warto się o tym przekonać już teraz.
Analiza porównawcza wskaźników
stanu zapalnego — OB i CRP
Często różnice i podobieństwa w zastosowaniu odczynu Biernackiego (OB)
i oznaczenia poziomu białka C-reaktywnego (CRP) pozostają niejasne, a
niewątpliwie warto je poznać.
OB jest tanim i łatwym do wykonania testem, chętnie wykorzystywanym przez
lekarzy.
Znany jako wskaźnik sedymentacji erytrocytów (ang. erythrocyte sedimentation
rate — ESR) jest miarą szybkości opadania krwinek czerwonych w osoczu w
jednostce czasu. Określany jest standardowo po upływie 1 godziny.
OB zależy przede wszystkim od:
— czynników osoczowych — zmiany stężenia białek w odpowiedzi zapalnej i
wzrostu stężenia immunoglobulin w surowicy, który odzwierciedla
hiperstymulację układu immunologicznego
— czynników erytrocytarnych — liczba krwinek czerwonych, ich kształt, wielkość,
a także lepkość krwi czy zjawisko aglutynacji
Wzrasta on w zapaleniu oraz wielu stanach chorobowych takich jak choroby
reumatyczne, anemia, choroby autoimmunologiczne, większość infekcji oraz
nowotwory. Odczyn nie wskazuje na konkretne schorzenie, ale pozwala na
określenie istnienia choroby podstawowej i daje podstawy do dalszej diagnostyki.
W wielu chorobach występują białka powodujące zbliżanie się erytrocytów do
siebie, przyleganie i rulonizację. Tworzą się grupy. W takich warunkach
erytrocyty są cięższe i opadają szybciej.
OB reaguje w infekcjach i wstrząsie, wzrastając po kilku dniach od wystąpienia
gorączki oraz podwyższenia poziomu leukocytów i utrzymując się przez dłuższy
czas.
Lekarze często wykorzystują OB do monitorowania zmian rozwoju choroby
podstawowej.
Gdy choroba postępuje OB wzrasta. Kiedy stanu pacjenta się polepsza, OB spada.
W chorobach nowotworowych występują odstępstwa od wyżej wymienionej
zasady.
Należy również pamiętać o stanach chorobowych, którym towarzyszy niskie OB.
Są to wszelkie schorzenia związane ze zmianą kształtu i rozmiaru erytrocytów, a
także ze zwiększeniem ilości krwinek czerwonych [1].
Zakres normy OB ustalany jest według wieku i płci. Fizjologicznie OB jest
przyspieszony w ciąży, po porodzie, podczas miesiączki, w trakcie stosowania
hormonalnej terapii zastępczej, bezpośrednio po posiłku, w silnym stresie oraz po
niewielkich zabiegach (wyrwanie zęba). W takich przypadkach często korzysta się
z oznaczenia CRP.
Tabela 1. Analiza porównawcza markerów stanu zapalnego – OB i CRP.
CRP należy do białek ostrej fazy. Jest syntezowane przez hepatocyty i komórki
Browicza-Kupffera. Opisano jego ekspresję także w monocytach i limfocytach.
Obserwuje się szybki wzrost jego stężenia w surowicy (4 do 8 godzin po
stymulacji) w odpowiedzi na proces zapalny oraz nieswoistej odpowiedzi na
zakażenia, jeszcze przed wystąpieniem objawów klinicznych.
CRP osiąga najwyższe stężenie w ciągu następnych 24-48 godzin (zwykle wzrost
kilkaset razy). Biologiczny okres półtrwania tego białka wynosi 19 godzin, a po
ustąpieniu czynnika stymulującego jego stężenie spada dziennie o około 50%.
Na rynku znajduje się test nefelometryczny do oznaczania CRP wysokiej czułości
(firmy Dade Behring) oparty na reakcji przeciwciał monoklonalnych z antygenem
CRP, w którym dolna granica wykrywalności tego białka wynosi 0,175 mg/l.
Oznaczenie parametru wydaje się mieć szczególne znaczenie w:
1. cukrzycy typu 1 (znamiennie wyższe stężenie osób ze zmianami w rodzaju
mikroangiopatii) [2];
2. udarze mózgu z powikłaniami zakaźnymi do siódmej doby po wystąpieniu udaru
(podwyższony poziom CRP może wyprzedzać wystąpienie gorączki nawet o 4 doby
u chorego z udarem mózgu);
3. zawale serca (wskaźnik zapalenia i martwicy tkanki) [3];
4. reumatoidalnym zapaleniu stawów (wartość predykcyjna oraz monitorująca) [2;
4]
CRP jest czynnikiem bardzo czułym, ale nieswoistym, zwykle proporcjonalnym
do nasilenia stopnia uszkodzenia tkanki.
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
W normalnych warunkach CRP jest obecne w surowicy w ilościach śladowych, do
5 mg/l. Wartości referencyjne CRP zależą od wieku, płci (nieco wyższe u
mężczyzn), badanej populacji, przyjmowanych leków. Fizjologiczne podwyższenie
stężenia CRP można obserwować w przebiegu niepowikłanej ciąży, u osób
przebywających w górach, w pierwszych trzech dobach życia noworodka. Wzrost
stężenia CRP stwierdza się w wielu nowotworach, gdzie koreluje on ze wzrostem
zaawansowania klinicznego, zajęciem węzłów chłonnych i przerzutami do
wątroby. Systematyczne badanie poziomu CRP może być pomocne w wykryciu
nawrotu choroby we wczesnej fazie. Przypisuje mu się również wartość
prognostyczną.
Zarówno OB jak i CRP są wskaźnikami stanu zapalnego. Należą one do
badań niespecyficznych — informują tylko o istnieniu i rozmiarze stanu
zapalnego, a nie jego rodzaju i lokalizacji. Bez względu na etiologię
choroby obecność CRP znacznie wyprzedza wystąpienie podwyższonego
OB. Podczas rekonwalescencji poziom CRP obniża się jeszcze przed
powrotem OB do wartości prawidłowych. Ilościowe oznaczenie CRP za
pomocą testu wysokiej czułości stało się obecnie niezwykle precyzyjnym
wskaźnikiem diagnostycznym i badawczym.
***
Notka historyczna
Według historyków medycyny pierwszym doniesieniem uważanym za oficjalne
ogłoszenie odkrycia sedymentacji krwinek czerwonych było opublikowanie w 1897
roku przez Edmunda Faustyna Biernackiego pracy „Samoistna sedymentacja krwi
jako naukowa, praktyczno-kliniczna metoda badania”. W 1923 roku w Wilnie na
Zjeździe Internistów Polskich przyjęto nazwę „Objaw Biernackiego”. Nazwa ta
obowiązywała do czasów II wojny światowej. Później ją zmieniono, między innymi
dlatego, że Edmund Biernacki był także odkrywcą jednego z objawów kiły układu
nerwowego, nazwanego objawem Biernackiego. Aby nie zmieniać skrótu OB
zwiększoną lub zmniejszoną sedymentację krwinek ochrzczono mianem „odczynu
Biernackiego”.
CRP po raz pierwszy opisane zostało w 1930 roku przez Tilleta i Francisa w
Laboratorium Bakteriologicznym Instytutu Rockefellera w Nowym Jorku.
Wyizolowano je z krwi pacjenta chorego na zapalenie płuc wywołane
Streptococcus pneumoniae. Swoją nazwę zawdzięcza zdolności reakcji z
polisacharydem C dwoinki zapalenia płuc.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Piśmiennictwo:
1. Saadeh C. The Erythrocyte Sedimentation Rate: Old and New
Clinical Applications. Mechatronics Technics, 2013.
2. Türkoğlu EI, Gürgün C, Zoghi M. et al. The relationship between serum Creactive protein levels and coronary artery disease in patients with stable angina
pectoris and positive exercise stress test. Anadolu Kardiyol Derg, 2004; 4, 3:
199-202.
3. Pandian S., Amuthan V., Sukumar P. et al. Plasma CRP level predicts left
ventricular function and exercise capacity in patients with acute myocardial
infarction. Indian Heart J, 2005; 57, 1: 54-57.
4. Buch MH., Seto Y., Bingham SJ. et al. C-reactive protein as a predictor of
infliximab treatment outcome in patients with rheumatoid arthritis: defining
subtypes of nonresponse and subsequent response to etanercept. Arthritis
Rheum, 2005; 52, 1: 42-48.
Wartości krytyczne
Kiedy uzyskane w laboratorium wyniki badań uważane są za wartości
krytyczne? Jak postępować w przypadku uzyskania takich rezultatów?
Kogo poinformować? Czy czynnik czasu ma jakieś znaczenie? Czy aby na
pewno oznaczenie jest w pełni wiarygodne? Te i wiele innych pytań mogą
zadawać sobie diagności autoryzujący badania laboratoryjne. Warto więc
przedstawić zasady postępowania z wartościami krytycznymi, które zostały
opracowane dzięki współpracy diagnostów laboratoryjnych i innych
specjalistów z wielu regionów Polski.
Wartość krytyczna to wynik badania laboratoryjnego, który świadczy o
bezpośrednim zagrożeniu życia pacjenta i wymaga podjęcia, w miarę możliwości,
szybkich i skutecznych działań terapeutycznych. W związku z powyższym
identyfikacja tej wartości jest niezwykle istotna.
W myśl opracowania „Zasady postępowania z wartościami krytycznymi” ustalono
kilka podstawowych zasad stanowiących niejako instrukcję prawidłowego
obchodzenia się z wartościami krytycznymi.
Po pierwsze świadomość..
Uzyskanie wartości krytycznej wiąże się z odpowiedzialnością. Dalsze
postępowanie nie powinno być chaotyczne, dlatego też laboratorium zobowiązane
jest do opracowania i wdrożenia strategii postępowania w takich przypadkach.
Taka procedura powinna obejmować sposób identyfikacji wartości krytycznej oraz
powiadomienia osoby odpowiedzialnej za zdrowie pacjenta. Dane osób
odpowiedzialnych za przekazanie informacji o zagrożeniu zdrowia i życia pacjenta
powinny być umieszczone w wykazie w odpowiedniej procedurze.
Kogo i jak powiadomić?
W przypadku uzyskania wartości krytycznej najbardziej odpowiednią osobą do
powiadomienia jest osoba kierująca pacjenta do laboratorium – w przypadku
pacjentów hospitalizowanych lekarz prowadzący, w przypadku zlecenia badań
przez inne laboratorium powiadamiane są osoby wskazane przez to laboratorium.
Osoby te określa się mianem odbiorców pierwotnych. Nie zawsze jednak możliwe
jest skontaktowanie się z odbiorcą pierwotnym. W takiej sytuacji wiadomość
przekazuje się odbiorcom zastępczym, których wykaz jest ściśle uzgodniony ze
zleceniodawcą. Jeżeli zarówno odbiorca pierwotny jak i zastępczy są nieosiągalni
laboratorium postępuje zgodnie z ustaleniami tak zwanego planu awaryjnego.
Sposób komunikacji (telefonicznie, elektronicznie) ustala laboratorium. Tekst
powiadomienia powinien być jednoznaczny, zrozumiały i obejmować dane osoby
powiadamiającej, identyfikację odbiorcy, identyfikację pacjenta, informacje o
krytycznym charakterze uzyskanej wartości oraz prośbę o potwierdzenie
przekazanego wyniku. Fakt powiadomienia odbiorcy powinien zostać odpowiednio
odnotowany z uwzględnieniem daty i godziny uzyskania zweryfikowanej wartości
krytycznej, dokładny czas powiadomienia, dane własne, odbiorcy i pacjenta,
potwierdzenie odbiorcy lub jego brak, wartość krytyczną oraz inne uwagi
(trudności związane z powiadomieniem, przyczynę braku możliwości
powiadomienia).
Właściwie które badania powinny znaleźć się w wykazie badań krytycznych?
Ustalenie wykazu badań krytycznych leży w gestii każdego laboratorium i
ostatecznie o zawartości wykazu rozstrzyga kierownik laboratorium. Decyzje takie
powinny być podjęte na postawie najnowszych publikacji, własnego
doświadczenia, sugestii klinicystów i świadczeniobiorców.
Nie należy zapominać, ze wykaz wartości krytycznych powinien znaleźć się w
miejscu ogólnie dostępnym dla wszystkich pracowników laboratorium.
Ile mam czasu na powiadomienie osoby odpowiedzialnej?
Ramy czasowe wynikają z ustaleń z kierownikiem laboratorium.
Jak nie przeoczyć wartości krytycznej wśród setek badań?
W dobie rozwoju techniki istnieją różne rozwiązania informatyczne pozwalające
na automatyczną identyfikację wartości krytycznych. Przykładowo, przekroczenie
granic krytycznych parametru powoduje podświetlenie, bądź miganie na
monitorze uzyskanej wartości.
Czasami jednak wartości krytyczne powtarzają się u tego samego pacjenta, stąd
też ich znaczenie powinno zostać właściwie zidentyfikowane. Sposób
postępowania w takim przypadku ustala laboratorium. Należy jednak pamiętać, że
powtarzająca się wartość krytyczna uzyskana wczoraj powinna być traktowana
inaczej od wartości uzyskanej miesiąc wcześniej.
Czy to na pewno nie pomyłka?
Ponieważ istnieje ryzyko uzyskania fałszywych wartości krytycznych, każda
wartość krytyczna powinna zostać zweryfikowana przed przekazaniem tej
wiadomości odbiorcy.
Weryfikacja obejmuje powtórną analizę danych ze skierowania, warunków
pobrania i transportu oraz cech próbki (hemoliza, zmętnienie, zażółcenie). W
dalszym etapie należy przeanalizować wyniki kontroli jakości, zapisy z przebiegu
badania, wykorzystanie delta check (porównanie wyniku z poprzednim), przejrzeć
wyniki innych pacjentów oraz wykonać powtórne oznaczenie z tej samej próbki
i/lub, w przypadku próbki wtórnej, oznaczenie próbki pierwotnej.
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
Strategia postępowania z wartościami krytycznymi powinna być znana wszystkim
pracownikom laboratorium oraz świadczeniobiorcom. Nie należy zapominać o
obowiązku szkolenia pracowników w tym zakresie. Okresowa ocena odsetka
zrealizowanych powiadomień, napotkanych trudności i możliwych rozwiązań
pozwoli na skuteczne doskonalenie w tym zakresie.
Wybrane
aspekty
badania
równowagi kwasowo-zasadowej
Dostęp do szerokiej gamy analizatorów kwasowo-zasadowych pozwolił na
wzrost popularności badania pomiaru pH i gazów we krwi, uważanego
kiedyś za zadanie laboratoriów wysokospecjalistycznych. Obecnie, chociaż
badanie gazometryczne wykonuje się rutynowo, to nie należy zapominać o
pewnych jego ograniczeniach.
International Federation of Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine (IFCC)
określiła czynniki przedanalityczne, mogące wpływać na zmiany w wynikach
badań parametrów gospodarki wodno-elektrolitowej, kwasowo-zasadowej oraz
ciśnienia parcjalnego gazów krwi [1].
Dobrym wykładnikiem równowagi kwasowo-zasadowej jest gazometria krwi.
Opiera się ona na oznaczeniu kilku parametrów:
pH
pO2 (ciśnienie parcjalne/prężność tlenu)
pCO2 (ciśnienie parcjalne/prężność dwutlenku węgla)
TCO2 (całkowita zawartość dwutlenku węgla w osoczu)
HCO3- (stężenie wodorowęglanów)
SatO2 (saturacja)
BE (nadmiar/niedobór zasad)
Zakresy referencyjne różnią się w zależności od wieku i rodzaju badanej krwi.
Zalecenia IFCC dotyczą stosowanego antykoagulantu, pobierania próbek krwi
włośniczkowej, przechowywania i transportu, a także przygotowywania próbek.
W przypadku pomiarów prężności gazów we krwi pełnej jako antykoagulant
rekomendowana jest heparyna. Obecnie sól sodowa heparyny zastępowana jest
heparynianem litu. Okazuje się, że liofilizowany heparynian sodu może wpłynąć na
zmiany stężenia sodu, podnosząc jego poziom (w przypadku przyrządów
mierzących parametry kwasowo-zasadowe i elektrolity), obniżać pH i poziom
dwuwęglanów, a także powodować wystąpienie nadmiaru zasad. W zależności od
materiału, z którego wykonana jest probówka wykorzystywana do oznaczeń,
stosuje się różne końcowe stężenia heparyny wynoszące dla probówek szklanych
od 8 do 12IU/ml oraz plastikowych od 4 do 6 IU/ml. Co więcej, oszacowano, że
końcowe stężenie jonów w roztworze buforowanej heparyny powinno wynosić dla
sodu od 120 do 150 mmol/l, potasu od 3,5 do 4,5 mmol/l, wapnia zjonizowanego
od 1,2 do 1,4 mmol/l, chlorków od 100 do 130 mmol/l oraz pH w zakresie od 6 do
8.
Ze względu na różnice parametrów gospodarki kwasowo-zasadowej we krwi
żylnej i tętniczej, zalecenia IFCC dotyczą także pobierania i przygotowania
próbek. Najlepsze rezultaty dają oznaczenia z krwi tętniczej lub arterializowanej
krwi włośniczkowej. Warunkiem jest jednak właściwe wykonanie pobrania krwi,
ograniczając dostęp do otaczającego powietrza. Należy pamiętać o zapobieganiu
powstawania pęcherzyków powietrza w próbce. Główne różnice pomiędzy krwią
żylną a tętniczą dotyczą komponentu metabolicznego (wzrost HCO3- przy
przepływie przez tkanki) oraz komponentu oddechowego (spadek pO2, wzrost
pCO2). Spośród skutków kontaktu z powietrzem należy zwrócić uwagę na
następujące aspekty:
– większą wrażliwość pO2 niż pCO2 na kontakt z powietrzem
-w przypadku, gdy objętość pęcherzyka nie stanowi więcej niż 10% całkowitej
objętości próbki, przez 20 minut jego objętość nie zmienia istotnie zawartości
gazów o ile próbka nie była wstrząsana [2].
Podczas pobierania krwi włośniczkowej do heparynizowanej kapilary nie należy
zapominać o usunięciu pierwszej kropli krwi po nakłuciu, o niestosowaniu ucisku
podczas pobierania oraz zamknięciu kapilary odpowiednimi zatyczkami. Przed
przystąpieniem do analizy należy starannie wymieszać próbkę przy użyciu
metalowego pręcika i magnesu.
Podczas transportu i przechowywania próbki dochodzi do zmian ciśnienia
parcjalnego gazów. Wśród czynników mających wpływ na ten proces należy
wymienić:
-metabolizm komórek krwi
-wymianę gazów.
Zmiany równowagi gazów we krwi wynikające z metabolizmu komórkowego
W wyniku glikolizy, zachodzącej w głównej mierze w erytrocytach, obserwuje się
zmiany w pH, HCO3- oraz BE (nadmiar zasad we krwi). Uzyskane rezultaty
wskazują na kwasicę metaboliczną, a są jedynie wynikiem powstawania kwasu
mlekowego. Leukocyty i płytki krwi zużywają tlen, zmieniając tym samym
wykładniki komponentu oddechowego (spada pO2, wzrasta pCO2), stąd przy
wysokiej leukocytozie powinno się zachować większy krytycyzm w ocenie
wyników gazometrii.
Zmiany równowagi gazów we krwi wynikające z materiału, z którego wykonane są
probówki
Plastikowe probówki nie zatrzymują całkowicie ucieczki gazów, przy czym
nasilenie procesu następuje w niskiej temperaturze. Równowaga gazowa we krwi
jest znacznie stabilniejsza w przypadku wykorzystania szklanych probówek.
Jak zapobiec zmianom wynikającym z czasu transportu/przechowywania?
Dobrym rozwiązaniem jest schłodzenie badanej próbki, obniżenie temperatury
spowalnia bowiem procesy metaboliczne. Brak możliwości wykonania badania w
ciągu 15 minut od chwili pobrania materiału jest wskazaniem do chłodzenia
próbki. Niemniej jednak przy wykorzystaniu plastikowych probówek należy
pamiętać, że proces przechowywania w wodzie z lodem nie powinien przekraczać
30 minut ze względu na zjawisko wymiany gazów [3, 4]. Jednakże przy użyciu
probówek szklanych i schłodzeniu materiału można wydłużyć czas
przechowywania nawet do 2 godzin od momentu pobrania przy czym wynik
powinien być traktowany z ostrożnością [2].
Nie należy zapominać o pacjencie
Prężność O2 i CO2 oraz pH są parametrami labilnymi, podatnymi na różne
czynniki zewnętrzne. Nie należy lekceważąco podchodzić do aspektów
psychologicznych, bowiem stres może prowadzić do skrajnych zachowań nawet do
hiperwentylacji (wzrost pH, pO2, spadek pCO2) lub wstrzymywania oddechu z
obawy przed pobraniem.
Istotnym warunkiem jest także odpoczynek przed pobraniem, zwłaszcza w
przypadku pacjentów ambulatoryjnych.
W przypadku stosowania oddychania wspomaganego, należy pobrać materiał po
co najmniej 20 minutach od włączenia wentylacji. Tylko takie postępowanie może
prowadzić do właściwej oceny skuteczności zastosowanego leczenia.
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
Badanie gazometryczne krwi niewątpliwie należy do prostych testów,
oceniających równowagę kwasowo-zasadową organizmu. Odgrywa ono ważną rolę
w diagnostyce chorób układu oddechowego oraz pozwala na monitorowanie
skuteczności tlenoterapii.
Źródło : Jean-Francois Mollard. pH/Gazometria krwi. Uwagi przedanalityczne,
tłum.Anzelm Hoppe. AVL MEDICAL INSTRUMENTS AG. 1994.
Z uczelni do biznesu
Czy uczelnia wspierając pracowników naukowych komercjalizacji ich
wiedzy może zyskać? Czy i w jaki sposób zyskują na tym pracownicy
naukowi? Czy w świetle nowych rozwiązań młodzi naukowcy mogą ze
spokojem myśleć o swojej przyszłości? Na te i inne pytania odpowiedzi
poznają uczestnicy spotkania, które już 22 lutego odbędzie się w Centrum
Kongresowo-Dydaktycznym Uniwersytetu Medycznego im. Karola
Marcinkowskiego w Poznaniu.
Poznański Uniwersytet Medyczny, jako jedna z pierwszych wielkopolskich uczelni
w oparciu o nowe zasady organizuje profesjonalne procedury transferu
powstałych na uczelni technologii do biznesu. Spotkanie zaplanowane na 22
lutego ma przybliżyć przedstawicielom innych uczelni, pracownikom naukowym a
także studentom zasady funkcjonowania transferu poprzez licencjonowanie
wypracowanych rozwiązań. Ponad to uczestnicy spotkania będą mogli zapoznać
się z formalnymi i prawnymi aspektami prezentowanych rozwiązań.
Od niedawna wszystkie uczelnie w Polsce muszą wprowadzać podobne procedury.
Wielkopolskie uczelnie w tym procesie wspiera realizowany właśnie projekt Open
Code Transfer. Celem jest wypracowanie modelu transferu technologii dla
Wielkopolskich Uczelni i jednostek badawczych. Projekt realizowany jest z
wykorzystaniem doświadczeń związanych z zastosowaniem kodowania informacji
jednostek zaangażowanych w projekt tj.: koordynatora – Fundacji Forum Rozwoju
Nowoczesnych Technologii oraz partnerów projektu: ETZ Zurich – jednej z
najlepszych uczelni w Europie i dynamicznej firmy wdrażającej rozwiązania
oparte na kodach – Pammco.
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
Na przykładzie ETH Zurich, jednej z najlepszych uczelni w Europie, widać, że
tworzenie uczelnianego centrum transferu technologii się opłaca. Od 1996 roku
pracownicy ETH Zurich założyli łącznie 215 firm typu spin-off (w tym aż 104
przedsiębiorstwa powstały w latach 2006-2010). Ilość założonych firm oraz inne
działania wspierające komercjalizację wiedzy stanowią ogromną korzyść zarówno
dla uczelni macierzystej jak i jej pracowników.
Spotkanie odbędzie się 22 lutego 2012 w Sali Senackiej Centrum KongresowoDydaktycznego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w
Poznaniu. Rozpoczęcie planowane jest na godzinę 9.30
PROGRAM V SPOTKANIA OTWARTEGO Z CYKLU KONSULTACJE
MODELU OPEN CODE TRANSFER W DNIU 22 LUTEGO 2012 ROKU
SALA SENACKA UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO IM. KAROLA
MARCINKOWSKIEGO W POZNANIU
UL. PRZYBYSZEWSKIEGO 7
EFKETYWNY SYSTEM TRANSFERU TECHNOLOGII I JEGO UŻYTKOWNICY
09.30-10.00
Rejestracja uczestników
10.00-10.15
Powitanie uczestników – Prof. dr hab. Jacek Wysocki, Rektor
Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
10.15-10.30 Open Code Transfer w pigułce – główne założenia modelu – dr
Zbigniew Krzewiński, dr Krzysztof Kus
10.30-11.15
Uczelniane Centrum Transferu Technologii Uniwersytetu
Medycznego – jak efektywnie zorganizować transfer technologii na uczelni
medycznej z wykorzystaniem mechanizmu licencjonowania – dr Zdzisław Podrez
11.15-12.00 Internet i mobile w modelu OCeT – wizualizacja on-line działania
aplikacji i jej nowe funkcjonalności – Paweł Polcyn
12.00-12.15
Przerwa na kawę
12.15-13.00
Użytkownicy OCeT: Na rozdrożu między uniwersytetem i biznesem
– transfer technologii z perspektywy PostDoca (przykład Uniwersytetu w
Pensylwanii) – dr Mikołaj Pawlak
13.00-13.45
Użytkownicy OCeT: ocena przydatności aplikacji OCeT z
perspektywy pracownika naukowego Uniwersytetu Medycznego – dr Jakub
Różański
13.45-14.30
Optymalizacja podatkowa transferu technologii w naukach
medycznych –Krzysztof Budasz
14.30-15.15 Formalne uwarunkowania modelu Open Code Transfer – prawo i
medycyna – Paweł Łączkowski
15.15-15.45
Obiad i dyskusja
Aglutynacja
druga.
mieszana.
Część
Można wymienić szereg przyczynowo-skutkowy związany z wystąpieniem
dwóch populacji krwinek w mikrometodzie kolumnowej. Część pierwsza
objaśniała aspekty oznaczeń z krwi pępowinowej, allogenicznej transfuzji
krwi, reakcje u biorców szpiku kostnego i komórek macierzystych,
częściową utratę antygenu w niektórych chorobach mieloproliferacyjnych i
wiele innych. Istnieją jednak pewne rzadsze stany takie jak mozaicyzm czy
chimeryzm, które także mogą powodować zaobserwowanie aglutynacji
mieszanej.
W zaburzeniach mieloproliferacyjnych można zaobserwować zjawisko Rhmozaicyzmu (dwie populacje krwinek wywodzące się z tej smej zygoty). Wizualnie
powstaje podwójna populacja krwinek w mikrokolumnie zawierającej odczynnik
anty-D. Pierwsze doniesienia na ten temat pojawiły się w latach 80. XX wieku.
Pacjent z przewlekła białaczką szpikowa (CML) wykazywał odchylenia od
standardowo uzyskiwanych rezultatów [1]. W innych badaniach także stwierdzono
Rh- mozaicyzm, gdzie skład podwójnej populacji krwinek przedstawiał się
następująco: 30% DCe/dce oraz 70% dce/dce [2]. Udowodniono także związek
dwóch populacji krwinek czerwonych z XX/XY mozaicyzmem. Zjawisko
zaobserwowano u 12- letniego chłopca z pewną wrodzoną wadą serca, u którego
stwierdzono obecność 85% krwinek O, Jk(a—b+) oraz 15% B, Jk(a+b+) [3].
Mozaicyzm może być źródłem problemów diagnostycznych, a uzyskanie wyników
wskazujących na to zjawisko wymaga dogłębnej analizy.
U niektórych pacjentów mogło dojść do pojawienia się tak zwanego nabytego
antygenu B. Zjawisko ograniczone jest głownie do osób posiadających grupę A1 z
równoczesnym występowaniem obstrukcji jelit, raka i innych schorzeń układu
pokarmowego, a także w sepsie wywołanej bakteriami Gram-ujemnymi
(przykładowo E.coli) [4]. Obecność nabytego B obserwowano dotychczas u
pacjentów chorych na raka okrężnicy [5] czy raka żołądka [6]. Za pojawienie się
nabytego antygenu B mogą być odpowiedzialne deacetylazy, mogące w przypadku
grupy A przekształcić N-acetylogalaktozaminę (specyficzną dla antygenu A),
poprzez odszczepienie grupy acetylowej, w galaktozoaminę, co z kolei mogłyby
powodować reakcje krzyżowe z surowicą anty-B ze względu na jej podobieństwo
do struktury D-galaktozy w antygenie B [5]. Na potwierdzenie występowania
nabytego antygenu B pozwalają metody biochemiczne, serologiczne i
genotypowanie. Ostatnia metoda wskazuje na brak allelu B w locus ABO [7].
Niemniej jednak należy ostrożnie dobierać odczynniki monoklonalne
sprawdzające obecność B nabytego, ponieważ niektóre mogą dawać fałszywie
pozytywne reakcje, a tym samym osoba z grupą a i B nabytym może zostać
potraktowana jako pacjent z grupą AB [8].
Obserwowano również przypadki poliaglutynacji krwinek czerwonych z powodu
Tn-aktywacji czerwonych krwinek. Tn aktywacja to nieprawidłowość wywołana
anormalnym klonem komórek pnia, który powstał w wyniku mutacji somatycznej.
Mutacja ta prowadzi do powstania deficytu T- syntazy, co z kolei powoduje, ze w
skład wielu O-glikanów wchodzi tylko N-acetylgalaktozamina. Skutkiem takiego
stanu jest obniżenie zawartości antygenu M i N, utrata kwasu sjalowego i inne.
Wizualnie uzyskujemy reakcję mieszanej aglutynacji, ponieważ anty-Tn, obecne w
prawidłowej surowicy dorosłego czlowieka, aglutynują tylko niektóre erytrocyty.
Dwie populacje obserwuje się także w obrębie płytek krwi [9]. Badana pacjentka
posiadała właściwą grupę krwi B, podczas gdy jej komórki wykazywały
specyficzność A-podobną [10]. Przykłady Tn-aktywacji obserwowano między
innymi u pacjentów chorych na białaczkę szpikową [11] oraz innych schorzeniach
takich jak anemia hemolityczna i trombocytopenia [12].
Można rozpatrywać także zjawisko chimeryzmu biorcy manifestującego się
początkowym wykryciem we krwi biorcy czerwonych krwinek dawcy [13]. Ale co
to jest właściwie chimera? W medycynie chimera oznacza organizm, który posiada
dwie lub więcej różne genetycznie populacje komórek, które wywodzą się z
różnych zygot, przy czym zjawisko zdarza się w sposób spontaniczny lub
stymulowany. W transplantologii chimera to osoba, która otrzymała przeszczep
jakiejś tkanki [14]. Chimeryzm może dotyczyć także bliźniąt, jednakże zjawisko to
jest znacznie rzadsze niż mozaicyzm. Może on wynikać z wymiany
wewnątrzmacicznej prekursorów erytrocytów między bliźniętami lub też fuzji
dwóch zygot. Bliźniak może w ten sposób uzyskać dwie populacje krwinek w
rożnej proporcji [15].
Autorzy pracy (J. Bonnet po prawej), prezentują bakterie na szalce
petriego.
Pojawienie się w mikrometodzie kolumnowej reakcji aglutynacji mieszanej nie
zaskakuje już tak bardzo jak było to kilkadziesiąt lat temu. W chwili obecnej
istnieją już sposoby na wyjaśnienie obserwowanej reakcji. Niemniej jednak nie
należy zapominać, że obserwowane odchylenie od prawidłowego schematu
wyniku badania grupy krwi w niektórych przypadkach może być tylko artefaktem.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Artykuł został oparty o Transfusion Science Course, April 2010, Switzerland