Instrukcja-analiza gleby - WF - Katedra i Zakład Mikrobiologii i

Diagnostyka mikrobiologiczna
Analityka medyczna III rok
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Instrukcja do ćwiczeń
Temat: Gleba jako środowisko życia mikroorganizmów. Badanie aktywności mikrobiologicznej
gleby – Cz.1/Cz.2.
I. Sporządzenie zawiesiny wyjściowej i szeregu rozcieńczeń gleby
·
·
·
odważyć 10 g badanej gleby i zawiesić w 90 mi sterylnej soli fizjologicznej (rozcieńczenie 10-1).
wytrząsać przez min. 5 min. i pozostawić do opadnięcia większych cząstek.
z tak przygotowanej zawiesiny sporządzić szereg rozcieńczeń w roztworze soli fizjologicznej od 10-2 do
10-5, a następnie wykonać poniższe oznaczenia.
II. Oznaczanie ogólnej liczby bakterii na agarze odżywczym metodą płytek lanych (posiew
wgłębny)
·
·
·
·
jałową pipetą przenieść po 1 ml badanego materiału z trzech wybranych rozcieńczeń do jałowych
płytek Petriego (bakterie: 10-3, 10-4, 10-5 / grzyby: 10-3, 10-4, 10-5)
do tak przygotowanych płytek wlać około 12-15 ml schłodzonego do 45°C agaru odżywczego (do
każdej z trzech) dla określenia liczebności bakterii i 12-15 ml schłodzonego podłoża Sabourauda do
trzech pozostałych dla określenia liczebności grzybów.
płytki inkubować w temperaturze 27oC przez 72h (ogólna liczebność bakterii) i w temp. 27oC przez 96
godzin do 7 dni (ogólna liczebność grzybów).
policzyć liczbę wyrosłych kolonii i podać ich liczbę w przeliczeniu na 1 g gleby.
III. Oznaczenie liczebności bakterii amylolitycznych
·
wykonać posiew metodą płytek tartych (posiew powierzchniowy - 0,1 ml) z rozcieńczeń (10-4, 10-5)
na agar skrobiowy. Płytki inkubować w temperaturze 27oC przez okres 96 godzin do 7 dni;
·
po inkubacji zalać hodowle płynem Lugola. Po upływie kilku minut odczytać wynik licząc kolonie
wokół których wystąpiła żółta strefa; barwa granatowa świadczy o braku rozkładu skrobi;
policzyć liczbę wyrosłych kolonii i podać ich liczbę w przeliczeniu na 1 g gleby.
·
IV. Oznaczenie liczebności bakterii proteolitycznych
·
wykonać posiew metodą płytek tartych (posiew powierzchniowy – 0,1 ml) z trzech rozcieńczeń (10-3,
10-4, 10-5) na agar odżywczy z dodatkiem żelatyny wg. Fraziera. Płytki inkubować w temperaturze
22°C przez okres 96 godzin;
·
po inkubacji sprawdzić czy na podłożu rozwinęły się kolonie otoczone przeźroczystymi strefami
powstałymi na skutek proteolizy żelatyny. Jeżeli strefy są słabo widoczne, powierzchnie podłoża zalać
odczynnikiem Fraziera (rtęć w kwasie solnym);
·
w celu określenia liczby bakterii saprofitycznych, a wśród nich bakterii o właściwościach
proteolitycznych, w badanym środowisku należy policzyć wszystkie kolonie na płytce i osobno ze
strefami przejaśnienia;
policzyć liczbę wyrosłych kolonii i podać ich liczbę w przeliczeniu na 1 g gleby.
·
·
z koloni ze strefami rozjaśnienia różniącymi się między sobą cechami morfologicznymi (kształt,
wielkość, barwa itp.) sporządzić preparaty trwałe i zabarwic je metodą Grama.
V. Oznaczenie NPL bakterii amonifikacyjnych
·
·
·
·
dla oznaczenia NPL posłużyć się systemem posiewów: 3 x 10 ml (1g), 3 x 1 ml (0,1g), 3 x 0,1 ml (0,01g)
z zawiesiny wyjściowej (rozcieńczenie 10-1) na pożywkę peptonową;
probówki inkubować w temperaturze 27oC przez 96 godzin;
po inkubacji sprawdzić wytwarzanie amoniaku: na płytkę Petriego wprowadzić po 0,3 ml roztworu
czerwieni fenolowej, a następnie dodać z każdej hodowli po 0,2 ml. Ilość amoniaku określa się na
podstawie intensywności powstałego zabarwienia: jasnoczerwona oznacza ślady NH3, intensywnie
różowa - bardzo dużą ilość NH3;
odczytać NPL bakterii amonifikacyjnych z odpowiednich tabel i podać wynik w przeliczeniu na 1 g
gleby.
VI. Oznaczenie NPL bakterii rozkładających mocznik na podłożu Christensena
·
·
·
·
dla oznaczenia NPL posłużyć się systemem posiewów: 3 x 10 ml (1g), 3 x 1 ml (0,1g), 3 x 0,1 ml
(0,01g) z zawiesiny wyjściowego (rozcieńczenie 10-1) na podłożu Christensena (zawiera mocznik jako
jedyne źródło azotu oraz czerwię fenolową jako indykator);
probówki inkubować w temperaturze 27oC przez 7 dni;
obecność amoniaku w hodowlach stwierdzamy po wzroście pH podłoża, co obserwujemy po
zmianie zabarwienia pożywki - z barwy żółtej w barwę czerwono-fioletową;
NPL bakterii mocznikowych odczytać z odpowiednich tabel i podać wynik w przeliczeniu na 1 g gleby.
VII. Sprawdzanie wykorzystania aminokwasów na przykładzie argininy
·
·
·
za pomocą ezy posiać badany materiał z trzech rozcieńczeń (10-2, 10-3, 10-4) na podłoże z argininą;
podłoża inkubować w temperaturze 27oC przez 7 dni;
podłoże z argininą zawiera ten aminokwas jako jedyne źródło azotu oraz czerwień fenolową jako
indykator. Barwa wyjściowa podłoża-łososiowa. Amoniak uwalniany podczas wzrostu bakterii silnie
alkalizuje pożywkę, co prowadzi do zmiany barwy na malinową (wynik dodatni).