Nr kat. IR151

FLEX
Przeciwciało Monoclonal Rabbit
Anti-Human
Estrogen Receptor α
Clone SP1
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR151
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone SP1, Ready-to-Use (Link), jest
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciała te moŜna uŜywać w
immunohistochemii w półilościowej detekcji ludzkiego receptora estrogenowego w skrawkach tkankowych ludzkiego
raka sutka. Informacje uzyskane po przeprowadzeniu testu, o którym mowa w niniejszym dokumencie, mogą ułatwić
ocenę prawdopodobieństwa odpowiedzi na leczenie oraz rokowania i leczenia pacjentów z rakiem sutka.
Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z
wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z
uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
ER α
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Receptory steroidowe wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla ligandów. Ludzki receptor estrogenowy (ER)
jest białkiem dimerycznym o masie 65 kDa, zlokalizowanym najczęściej w jądrze komórkowym. NaleŜy do klasy
białek o działaniu trans – pobudzających transkrypcję przez wiązanie z określonymi elementami DNA, określanymi
równieŜ jako elementy odpowiedzi hormonalnej. PoniewaŜ po związaniu białka następuje indukcja receptora ER i
stymulacja transkrypcji, receptor estrogenowy określa się mianem indukowalnego czynnika pobudzającego (1, 2).
W badaniach z ubiegłych lat wykazano korelację stanu receptora estrogenowego ER z wynikami przypadków
nieleczonych (np. prognozowanie dobrze zróŜnicowanego inwazyjnego raka sutka) i odpowiedzią na leczenie
antyhormonalne, np. leczenie tamoksifenem. Stwierdzono, Ŝe estrogeny przede wszystkim koncentrowały się w
narządach docelowych estrogenu zwierząt i ludzkim raku sutka oraz udokumentowano w stopniu dobrym mitogenny
wpływ estrogenu za pośrednictwem receptora estrogenowego ER. Na podstawie badań mechanizmu biologicznego
wzrostu raka sutka stwierdzono, Ŝe szybkość wzrostu zaleŜy od obecności estrogenu lub progesteronu oddzielnie
lub razem w większości wystąpień raka sutka (2). Tak więc stan receptora estrogenowego w przypadku raka sutka
jest uwaŜany za potwierdzony czynnik prognostyczny podczas postępowania z pacjentami w leczeniu
antyhormonalnym (2, 3).
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia monoklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: SP1.
Immunogen
Syntetyczny peptyd otrzymany z końca C ludzkiego receptora estrogenowego α.
Swoistość
W testach Western blot lizatu komórek MCF-7 przeciwciało znakuje duŜe pasmo 67 kDa odpowiadające oczekiwanej
masie cząsteczkowej ER α (4).
Środki ostroŜności
1.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
2.
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3) w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł‚ biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
Przechowywanie
(118850-003)
4.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem
z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
307723PL_004 p. 1/4
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
W przypadku stosowania Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101) wymagane jest przeprowadzenie obróbki wstępnej
poprzez cieplne odmaskowanie antygenu (HIER). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu
PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX
Target Retrieval Solution, High pH (50x), (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatopione w parafinie: W przypadku utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych zalecane jest przygotowanie próbek metodą 3-in-1 dla Dako PT Link. Postępuj według procedury
obróbki wstępnej zamieszczonej w ulotce dołączonej do opakowania roztworu EnVision FLEX Target Retrieval
Solution, High pH (50x), (nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po barwieniu, skrawki naleŜy poddać odwodnieniu,
oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Skrawki odparafinowane: Obróbka wstępna odparafinowanych, utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie
skrawków tkankowych jest zalecana z uŜyciem Dako PT Link i według tej samej procedury, która została opisana dla
skrawków zatopionych w parafinie. Po barwieniu szkiełka naleŜy nakryć za pomocą środka wodnego lub do trwałego
zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym system wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH, (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer Link
wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecane objętości dozowania odczynnika to 1 x 200 µL
lub 2 x 150 µL na szkiełko. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników
przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym
systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury
inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat.
K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować
natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn
opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to
Control, Rabbit, (Link) (nr kat. IR600).
i ujemne próby
szyjkę macicy,
reakcji taki jak
FLEX Negative
Interpretacja
wybarwienia
Dodatni wynik badania definiuje się jako odczyn jądrowy w ≥1% komórek nowotworowych (5).
Charakterystyka
działania
Precyzja: Do badań zgromadzono seryjne skrawki z kaŜdego z trzech róŜnych, utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie bloków raka sutka. Badanie przeprowadzono w następujący sposób:
Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Występujące niekiedy barwienie cytoplazmy uwaŜa się za nieswoisty odczyn tła.
Precyzja w obrębie serii: Zgodnie ze standardowym protokołem EnVisionTM FLEX, High pH, za pomocą Monoclonal
Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1 wykonano barwienie trzech preparatów z kaŜdego bloku tkankowego.
Jednocześnie, jeden preparat z kaŜdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną.
Precyzja między seriami: Przeprowadzając barwienie jednego preparatu z kaŜdego bloku tkankowego, powyŜszą
procedurę powtarzano przez dodatkowe dwa dni. Jednocześnie, jeden preparat z kaŜdego bloku został poddany
barwieniu kontrolą ujemną.
Eksperymenty określające precyzję przy stosowaniu przeciwciał Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1
dały wyniki spójne z uzyskanymi w badaniach określających precyzję w serii i pomiędzy seriami. W trakcie badania
utrzymywano identyczne wyniki testu a pomiędzy seriami testów odczynniki przechowywano w temperaturze 2–8 °C.
Odtwarzalność między laboratoriami: Badania i ocenę odtwarzalności między laboratoriami przeprowadzono w
trzech, róŜnych lokalizacjach. Piętnaście próbek raka sutka (5 ujemnych (0% odczynu jądrowego w komórkach
nowotworowych), 1 słabo dodatnia (1-9% odczynu jądrowego w komórkach nowotworowych) i 9 dodatnich (>10%
odczynu jądrowego w komórkach nowotworowych)) zostało wybarwionych przeciwciałami Monoclonal Rabbit AntiHuman ER α, Clone SP1 i ocenionych w trzech lokalizacjach. Ocenę przeprowadzono z uŜyciem metody opisanej
przez Diaz et al. Pomiędzy parą porównawczą kaŜdej lokalizacji uzyskano całkowitą zgodność równą 100% (95%
C.I.: 78,2 – 100%).
Tkanki prawidłowe: Tabela 1 zawiera podsumowanie immunoreaktywności ER α w zalecanym panelu tkanek
prawidłowych. Wszystkie tkanki były utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie oraz wybarwione przeciwciałami
Anti-Human Estrogen Receptor α (ER α), Clone SP1 zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w ulotce dołączonej
do opakowania.
Tabela 1: Podsumowanie immunoreaktywności ER α tkanek prawidłowych (6)
(118850-003)
Rodzaj tkanki
(liczba testowanych przypadków)
Składniki komórkowe dające dodatni odczyn
Nadnercza (3)
(0/3)
Szpik kostny (3)
(0/3)
307723PL_004 p. 2/4
Gruczoły sutkowe (2)
(2/2) Nabłonek przewodowy
Mózg/móŜdŜek (2)
(0/2)
Mózg/mózgowie (3)
(0/3)
Szyjka macicy (2)
(1/2) Błona śluzowa (nabłonek płaski) i zrąb
Szyjka macicy (2)
(1/2) Warstwa podśluzówkowa
Jelito grube (2)
(0/2)
Przełyk (3)
(0/3)
Serce (3)
(0/3)
Nerki (3)
(0/3)
Wątroba (3)
(0/3)
Płuca (3)
(0/3)
Komórki międzybłonka (2)
(0/2)
Nerwy obwodowe (2)
(0/2)
Jajniki (2)
(1/2) Zrąb
Trzustka (3)
(0/3)
Przytarczyce (3)
(0/3)
Przysadka mózgowa (3)
(0/3)
Gruczoł krokowy (2)
(0/2)
Ślinianki (3)
(0/3)
Mięśnie szkieletowe (3)
(0/3)
Skóra (3)
(0/3)
Jelito cienkie (3)
(0/3)
Śledziona (3)
(0/3)
śołądek (3)
(0/3)
Jądra (3)
(0/3)
Grasica (3)
(0/3)
Tarczyca (2)
(0/2)
Migdałki (3)
(0/3)
Macica (2)
(2/2) Nabłonek gruczołowy śluzówki macicy, zrąb
i mięśniówka macicy
Tkanki nieprawidłowe: Badania utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków tkankowych raka sutka
wykazały, Ŝe przeciwciała anty-ER α, Clone SP1, są uŜyteczne w prezentacji statusu ER α. Do określenia
dodatniego/ujemnego statusu ER przyjęto punkt odcięcia na poziomie ≥1% komórek dodatnich (8). Bezpośrednie
badania porównawcze przeciwciał anty-ER α, Clone SP1 i anty-ER, Clone 1D5 przeprowadzono na utrwalonych w
formalinie, zatopionych w formalinie mikromacierzach tkankowych, zawierających 272 próbki raka sutka oraz 119
raków sutka. W badaniu mikromacierzy tkankowej, odsetek wyników dodatnich dla SP1 wyniósł 78,68% w
porównaniu do 69,85% dla 1D5. W całym badaniu próbek raka sutka uzyskano odsetek wyników dodatnich równy
84,03% dla SP1 i 78,15% dla 1D5 (7). Istnieją doniesienia wskazujące, Ŝe uŜycie przeciwciał anty-ER α, Clone SP1
pozwala na uzyskanie informacji prognostycznych odnośnie odpowiedzi na terapię hormonalną (8).
Porównanie metod: Badanie przeprowadzono w dwóch lokalizacjach. Badanie ER α, SP1 przeprowadzono przy
uŜyciu EnVisionTM FLEX i oceniono z wykorzystaniem metody opisanej przez Diaz et al, a badanie ER 1D5/2-123
przeprowadzono przy uŜyciu ER/PR pharmDx™ Kit i oceniono na podstawie wytycznych dotyczących
przeprowadzania oceny Allred, zamieszczonych w ulotce dołączonej do opakowania. Dane uzyskane w wyniku
porównania metod przedstawiono w Tabelach 2 i 3.
Tabela 2: Zgodność w lokalizacji badania 1
Składnik ER ER/PR pharmDx
Dodatni
ER Clone SP1
Ujemny
Razem
Dodatni
69
6
75
Ujemny
0
34
34
Razem
69
40
109
Współczynnik zgodności wyników dodatnich = (69)/(69+0) = 69/69 = 1,0, przy przedziale ufności 95%, w zakresie
0,9479 - 1,0.
Współczynnik zgodności wyników ujemnych = (34)/(6+34) = 34/40 = 0,85, przy przedziale ufności 95%, w zakresie
0,7016 - 0,9429.
Całkowity współczynnik zgodności = (69+34)/(69+6+0+34) = 103/109 = 0,9449, przy przedziale ufności 95%,
w zakresie 0,8840 - 0,9795.
(118850-003)
307723PL_004 p. 3/4
Tabela 3: Zgodność w lokalizacji badania 2
Składnik ER ER/PR pharmDx
ER Clone SP1
Dodatni
Ujemny
Razem
Dodatni
27
1
28
Ujemny
7
84
91
Razem
34
85
119
Współczynnik zgodności wyników dodatnich = (27)/(27+7) = 27/34 = 0,7941, przy przedziale ufności 95%,
w zakresie 0,6210 - 0,9130.
Współczynnik zgodności wyników ujemnych = (84)/(1+84) = 84/85 = 0,9882, przy przedziale ufności 95%, w zakresie
0,9362 - 0,9997.
Całkowity współczynnik zgodności = (27+84)/(27+1+7+84) = 111/119 = 0,9328, przy przedziale ufności 95%,
w zakresie 0,8718 - 0,9705.
Parametry kliniczne: Do określenia parametrów klinicznych działania przeciwciał Dako Monoclonal Rabbit AntiHuman Estrogen Receptor α (ER α), Clone SP1 wykorzystano badanie opublikowane w Journal of Clinical Oncology.
Status receptora estrogenowego oceniono na podstawie pobranych od pacjentów, utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie 4150 próbek raka sutka, z uŜyciem przeciwciał anty-ER α, Clone SP1 i anty-ER α, Clone
1D5. Do określenia dodatniego/ujemnego statusu ER przyjęto punkt odcięcia na poziomie ≥1% komórek dodatnich.
Współczynnik wyników dodatnich dla SP1 wyniósł 69,5% w porównaniu do 63,1% dla 1D5. Średnia waŜona
współczynnika dziesięcioletniego przeŜycia raka sutka (BCSS) w przypadku odsetka barwienia jądrowego komórek
nowotworowych na poziomie nie mniej niŜ 1% jest równa 76,5% (95% C.I.: 73,9- 79,0%) a w przypadku odsetka
barwienia jądrowego komórek nowotworowych na poziomie poniŜej 1% jest równa 65% (95% C.I.: 62-68%) (8).
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen
receptor. Cell 1987;51:941-51.
Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. In: Diseases of the Breast. Harris JR
et al. eds. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 2000:471-85.
Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer:
College of American Pathologists consensus statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966-78.
Huang Z, Zhu W, Szekeres G, Xia H. Development of new rabbit monoclonal antibody to estrogen receptor:
Immunohistochemical assessment on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Appl Immunohistochem
Mol Morphol 2005;13:91-5
Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing
accuracy. [review] Adv Anat Pathol. 2005;12:10-19.
M3634 IHC003-149 Report on file.
Treaba DO, Hing AW, Goldstein LC, Barry TS, Kandalaft P, Gilks CB, et al. Significantly improved sensitivity for
ER detection in breast cancer using a new rabbit monoclonal anti-ER antibody (SP1). Modern Pathology 2005;
18, suppl.1, p. 53A.
Cheang MCU, Treaba DO, Speers CH, Olivotto IA, Bajdik CD, et al. Immunohistochemical detection using the
new rabbit monoclonal antibody SP1 of estrogen receptor in breast cancer is superior to mouse monoclonal
antibody 1D5 in predicting survival. J Clin Oncol 2006;24:5637-44.
Wydanie 03/12
(118850-003)
307723PL_004 p. 4/4