pobierz plik - Wydział Biologii

Tytuł pracy:
Autor:
Promotor rozprawy:
Recenzenci:
Funkcje białek ELAC2 i SUV3 u ssaków i ryb Danio rerio.
Praca doktorska wykonana w Instytucie Genetyki i Biotechnologii,
Wydział Biologii UW
Lien Brzeźniak
Prof. dr hab. Piotr P. Stępień
Prof. dr hab. Artur Jarmołowski
Prof. dr hab. Jerzy Duszyński
Wprowadzenie
Referowana praca opisuje wyniki badań nad funkcją białek biorących udział w
metabolizmie mitochondrialnych RNA. Ludzkie białko SUV3 stanowi od dawna przedmiot badań
w Instytucie Genetyki i Biotechnologii. Z kolei białko ELAC2 stanowi nowy obiekt badań wybrany
jako kandydat przy poszukiwaniu genu odpowiedzialnego za aktywność tRNazy Z, niezbędnej dla
procesu wycinania tRNA z pierwotnych transkryptów mitochondrialnych. Zarówno helikaza SUV3,
jak potencjalna mitochondrialna tRNAza Z, są niezbędne dla prawidłowej ekspresji genomu
mitochondrialnego.
Ludzki genom mitochondrialny to kolista dwuniciowa cząsteczka DNA długości 16,57 kpz.
Zawarta w nim informacja jest niezbędna do syntezy 13 białek, 2 mt-rRNA oraz 22 mt-tRNA.
Mitochondrialny DNA jest transkrybowany z obu nici w postaci policistronowych cząsteczek o
długości prawie dorównującej wielkości genomu. Powstałe w wyniku transkrypcji cząsteczki
prekursorowego RNA muszą ulec odpowiedniej obróbce endonukleolitycznej, aby mogły powstać
dojrzałe mRNA, rRNA i tRNA (Rys. 1).
Rys. 1.5.1 Metabolizm RNA w mitochondriach. Czerwonym kolorem oznaczono ogony poli- i oligo-(A).
Zgodnie z tzw. modelem interpunkcji tRNA, cząsteczki mt-tRNA wyznaczają miejsca
działania specyficznych endonukleaz: tRNazy Z i Rnazy P. Do tej pory zidentyfikowano jedynie
białko odpowiedzialne za aktywność Rnazy P, odcinające cząsteczkę tRNA po stronie 5'. Natomiast
czynnik odpowiedzialny za cięcie po stronie 3' tRNA – mitochondrialna tRNaza Z – nie został
jeszcze scharakteryzowany. Potencjalnym kandydatem był produkt genu ELAC2.
Gen ELAC2 został pierwotnie scharakteryzowany jako czynnik związany z zapadalnością na
raka prostaty. Analiza sekwencji wskazywała na to, że ELAC2 może lokalizować się w
mitochondriach, jednakże według istniejących danych eksperymentalnych ELAC2 znajdował się w
jądrze komórkowym. Pokazano również, że w warunkach in vitro produkt genu ELAC2 ma
aktywność tRNazy Z – białka odpowiedzialnego za obróbkę endonukleolityczną końca 3' tRNA.
Do tej pory jednak nie wykazano in vivo, czy białko to bierze udział w obróbce transkryptów
mitochondrialnych.
Białko SUV3 jest helikazą RNA lokalizującą się w mitochondriach oraz jądrze
komórkowym. Badania przeprowadzone w Instytucie Genetyki i Biotechnologii wykazały, że
uczestniczy ono w procesie degradacji RNA w mitochondriach. SUV3 odgrywa podstawową rolę
przy usuwaniu nie tylko funkcjonalnego RNA (jak mt-mRNA i mt-rRNA), ale również jest
niezbędne do degradacji transkryptów niekodujących – ubocznych produktów ekspresji ludzkiego
genomu mitochondrialnego. Niewykluczone, że helikaza SUV3 jest również zaangażowana w inne
procesy związane z metabolizmem RNA w mitochondriach człowieka. Ponadto, szereg danych
wskazuje na to, że białko SUV3 pełni także funkcje niezwiązane z mitochondriami. W komórkach
rakowych HeLa stwierdzono między innymi, że białko SUV3 jest obecne nie tylko w
mitochondriach, ale także w jądrze komórkowym i ma działanie antyapoptotyczne. Dodatkowo,
jego partnerami są białka zaangażowane w procesy utrzymujące stabilność chromatyny w jądrze
komórkowym.
Cel pracy
Celem pracy było zbadanie funkcji dwóch białek: SUV3 i ELAC2, z zastosowaniem
różnych modeli komórkowych oraz dwóch organizmów modelowych: myszy Mus musculus i ryby
Danio rerio.
Postanowiono:
1. Ustalić lokalizację wewnątrzkomórkową produktu genu ELAC2.
2. Wykazać udział białka ELAC2 jako tRNazy Z w procesie wycinania tRNA z prekursorów
mt-RNA.
3. Określić udział białka SUV3 w obróbce ludzkich mt-tRNA.
4. Opisać fenotypy związane z brakiem aktywności białka SUV3 u myszy i ryby Danio rerio.
Wyniki
1. Białko ELAC2 ma podwójną, jądrowo – mitochondrialną lokalizację wewnątrzkomórkową.
Wykorzystując techniki mikroskopii fluorescencyjnej, wykazano, że w ludzkich komórkach
białko ELAC2 lokalizuje się w mitochondriach i w jądrze komórkowym. Eksperyment
przeprowadzono z użyciem kilku różnych linii komórkowych i dla wszystkich otrzymano podobne
wyniki.
2. Produkt genu ELAC2 jest tRNAzą Z biorącą udział w wycinaniu tRNA z mitochondrialnych
pierwotnych transkryptów.
Aby ustalić, czy produkt genu ELAC2 pełni funkcję ludzkiej mitochondrialnej tRNazy Z, zbadano
wpływ białka ELAC2 na proces wycinania sekwencji tRNA z pierwotnych transkryptów
mitochondrialnych. W tym celu przeanalizowano efektywność obróbki prekursorów mt-RNA w
komórkach traktowanych siRNA przeciwko ELAC2.
Ustalono że w komórkach z wyciszoną ekspresją genu ELAC2 zahamowane jest cięcie
prekursorów mt-tRNA po stronie 3'. Stanowi to dowód, że istotnie ELAC2 pełni w ludzkich
mitochondriach funkcję tRNazy Z odpowiedzialnej za wycinanie mt-tRNA. Poczynione w tej pracy
obserwacje dotyczą obróbki wielu mt-tRNA, kodowanych na różnych obszarach genomu
mitochondrialnego. Poza standardowymi substratami dla tRNAzy Z zbadano również inne
potencjalne miejsca cięcia i stwierdzono, że białko ELAC2 nie uczestniczy w obróbce
antysensownych transkryptów mitochondrialnych ani transkryptów nie zawierających struktury
tRNA. Przeprowadzono również eksperyment, w którym dodatkowo, poza ELAC2, wyciszono
ekspresję genu MRPP1, kodującego podjednostkę mtRNAzy P, odpowiedzialnej za wycinanie
tRNA po stronie 5'. Na podstawie tych badań ustalono, że niedawno odkryty enzym - mtRNaza P
pozbawiona składnika RNA, podobnie jak jądrowa rybonukleoproteinowa RNaza P, jako pierwsza
przecina cząsteczki mitochondrialnego prekursorowego RNA, a produkt ELAC2 działa w następnej
kolejności.
3. Zaburzenie funkcji SUV3 powoduje spadek poziomu dojrzałych mitochondrialnych tRNA.
Stwierdzono, że w komórkach, w których funkcja białka SUV3 została zaburzona poprzez
nadekspresję zmutowanej, nieaktywnej formy genu SUV3, poziom mt-tRNA ulega znacznemu
obniżeniu. Dalsza analiza pozwoliła ustalić, że obniżenie to nie jest związane ze zwiększoną
degradacją
mt-tRNA.
Nie zaobserwowano
również
zwiększonej
akumulacji
cząsteczek
prekursorowych związanych z zaburzeniem procesu wycinania mt-tRNA.
4.
Białko SUV3 jest niezbędne dla prawidłowego przebiegu rozwoju zarodkowego u myszy i u
ryby Danio rerio.
Wpływ białka SUV3 na działanie całego organizmu zbadano poprzez scharakteryzowanie
skutków obniżonej bądź wadliwej ekspresji genu SUV3 u dwóch gatunków modelowych: Myszy
domowej oraz Danio pręgowanego.
Charakterystyka myszy SUV3(-/-)
Dzięki współpracy z J. Klysikiem (Brown University, Providence,USA) Instytut Genetyki i
Biotechnologii dysponuje skonstruowanym szczepem myszy C57BL/6, w których gen SUV3 został
zmutowany.
Mutacja
w
formie
homozygotycznej
okazała
się
letalna
na
wczesnym
postimplantacyjnym etapie rozwoju zarodkowego: po ok. 7 dniach od zapłodnienia (E 7.5). Za
pomocą techniki RT-PCR ustalono, że w części zarodków rzeczywiście nie następuje ekspresja
pełnej długości mRNA genu SUV3.
Analiza morfologiczna i histologiczna pozwoliła ustalić, że około 7 dni po zapłodnieniu
rozwój zarodków SUV3(-/-) ulega znacznemu spowolnieniu, które kończy się śmiercią zarodka.
Jednocześnie analiza markerów molekularnych pozwoliła stwierdzić, że gastrulacja w zarodkach
homozygotycznych przebiega normalnie, jedynie z opóźnieniem odpowiadającym ocenie
histologicznej.
Charakterystyka larw Danio rerio z wyciszoną ekspresją genu SUV3.
Przejściowe obniżenie ekspresji drSUV3 (ortologa ludzkiego hSUV3 u Danio rerio)
uzyskano z pomocą Morpholino – technologii opartej na analogu kwasu rybonukleinowego o
sekwencji antysensownej do mRNA wyciszanego genu. Zaobserwowany fenotyp charakteryzował
się zmniejszoną ruchliwością, zatrzymaniem lub spowolnieniem krążenia krwi u 72h larw,
obrzękiem serca oraz dysmorfią trzewioczaszki u 3 dniowych larw w porównaniu do larw
kontrolnych traktowanych wodą (95% spośród 74 jaj traktowanych morpholino). Analiza ekspresji
różnych genów - markerów rozwojowych Danio rerio wykazała, że opóźnienie i pierwsze zmiany
morfologiczne pojawiają się na etapie gastrulacji.
Podsumowanie
Wyniki przedstawione w niniejszej pracy stanowią pierwszy bezpośredni dowód na to, że za
wycinanie mitochondrialnych tRNA po stronie 3' odpowiada u człowieka białko kodowane przez
gen ELAC2. Nigdy wcześniej nie przedstawiono także danych o jednoczesnej, podwójnej jądrowomitochondrialnej lokalizacji białka ELAC2 w komórce ludzkiej.
W badaniach nad funkcją białka SUV3 wykorzystano model komórkowy, a także dwa
modele zwierzęce: transgeniczny szczep myszy oraz organizm modelowy w badaniach rozwoju
zarodkowego – ryby Danio rerio. Na podstawie otrzymanych badań można stwierdzić, że SUV3
jest niezbędny do życia już na etapie wczesnego rozwoju zarodkowego, co jest związane
najprawdopodobniej z wyższym zapotrzebowaniem energetycznym podczas gastrulacji. Wyniki
przeprowadzonych eksperymentów świadczą o tym, że szczególnie wrażliwe na zaburzenia
poziomu SUV3 są komórki i tkanki podlegające aktywnemu procesowi różnicowania, w
szczególności komórki prekursorowe dla tkanki mięśniowej, nerwowej oraz skóry. Otrzymane
obserwacje są zgodne z istniejącymi danymi literaturowymi i wydają się potwierdzać
antyapoptotyczną rolę białka SUV3.
Część wyników przedstawionych w pracy doktorskiej weszło w skład następujących publikacji:
1. Szczesny RJ, Borowski LS, Brzezniak LK, Dmochowska A, Gewartowski K, Bartnik E, Stepien
PP. Human mitochondrial RNA turnover caught in flagranti: involvement of hSuv3p helicase in
RNA surveillance. 2010 Nucleic Acids Res 38(1):279-98.
2. Brzezniak LK, Bijata M, Szczesny RJ,Stepien PP. Involvement of human ELAC2 gene product
in 3' end processing of mitochondrial tRNAs. 2011 RNA Biology (zaakceptowane do druku)