NOVA Lite® Monkey Oesophagus IFA Kit/Slides

NOVA Lite® Monkey Oesophagus IFA Kit/Slides
(tylko przeciwciała skóry)
Do diagnostyki in vitro
Kod produktu:
704160, 704165
504160, 504160.10
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
Te skrawki przełyku małpy są przeznaczone do stosowania jako substrat do badań przesiewowych
autoprzeciwciał do wewnątrz-naskórkowych antygenów lub stref błony naskórkowej w surowicy ludzkiej, jako
pomoc w diagnozowaniu odpowiednio pęcherzycy lub pemfigoidu klasycznego. Skrawki mogą nie obejmować
tkanki śródmięśniowej i w związku z tym nie wolno ich używać do wykrywania przeciwciał śródmięśniowych.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Przeciwciała wewnątrz-naskórkowego IgG, które charakteryzują różne formy kliniczne pęcherzycy, reagują z
antygenami występującymi na powierzchni komórki keratynocytów naskórka. Pozytywne wyniki dają
charakterystyczny wzór „drutu drobiu”. Osadzanie się tkanki immuglobiny występuje prawie we wszystkich
przypadkach. Zalecane jest zawsze sprawdzenie surowicy pacjenta i tkanki za pomocą choroby pęcherzowej.
Przeciwciała strefy błony podstawowej klasyczne znajdują się w pemfigoidzie klasycznym. W przypadku tej
choroby bezpośrednia biopsja wykazuje liniowe osadzanie IgG oraz C3 wzdłuż skórno-naskórkowego
połączenia. Te autoprzeciwciała często, ale nie zawsze, występują w surowicy dotkniętych pacjentów. Jednak
stężenie przeciwciał nie koreluje ze stanem choroby, a w przypadku klinicznej reemisji przeciwciała nadal
występować w tkankach i surowicy.
Koniugat FITC anty-ludzki IgG (H i L) (małpy) znajduje się w zestawie w celu zademonstrowania obu tych
autoprzeciwciał.
Zasada badania
Niebezpośrednia technika immunofluorescencyjna1 jest używana, gdy próbki pacjenta oraz odpowiednie
kontrole są inkubowane z preparatami substratu. Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane i podawane są
odpowiednie koniugaty znakowane fluoresceiną. Niezwiązany koniugat jest wypłukiwany i preparaty są
oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pozytywne próbki wykazują jasnozielone zabarwienie
fluorescencyjne, które odpowiada obszarom skrawka, gdzie związało się autoprzeciwciało.
Odczynniki
1.
Skrawki przełyku małpy na próbkach 50- lub 10-dołkowych
Tylko zestawy
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Surowica kontroli pozytywnej (pochodząca z ludzkiej surowicy) wykazująca wzór „drutu drobiu”
na skrawkach przełyku małpy, zawierająca azydek sodu o stężeniu 0,09%. Wstępnie rozcieńczony,
gotowy do użycia.
Surowica kontroli pozytywnej (pochodząca z ludzkiej surowicy) zapewniająca wzór klasycznego
pemphigoidu błony podstawowej lub skrawki przełyku małpy, zawierające azydek sodowy. Wstępnie
rozcieńczony, gotowy do użycia.
Surowica kontroli negatywnej, uniwersalnie negatywne dla wszystkich autoprzeciwciał, zawierająca
azydek sodowy o stężeniu 0,09% Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia.
Bufor fosforanowy (PBS II), dostarczany jako 40-krotny koncentrat w formie płynnej.
Anty-ludzki koniugat fluoresceiny IgG (H i L) owcy oczyszczony na kolumnie powinowactwa.
Wstępnie rozcieńczony, gotowy do użycia.
Błękit Evansa 1% jako opcjonalny barwnik kontrastowy.
Bibułki.
Środek do osadzania preparatu, zawierający czynnik zapobiegający blaknięciu (DABCO, 1, 4
diazabicyklo [2.2.2] oktan).
szkiełek nakrywkowych.
1
Ostrzeżenia/środki ostrożności
Wszyscy dawcy dostarczonej ludzkiej surowicy (tylko zestawy) zostali przebadani na surowicę i stwierdzono,
że są negatywni na antygen powierzchniowy zapalenia wątroby typu B i wirusa zapalenia wątroby typu C oraz
wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV 1 i 2). Jednak te badania nie mogą zagwarantować
nieobecności czynników infekcyjnych. Należy ustalić odpowiednie metody obsługi i utylizacji wszystkich
potencjalnie infekcyjnych materiałów badanych przy użyciu tego produktu. Jedynie personel odpowiednio
przeszkolony w zakresie tych metod powinien być upoważniony do wykonywania tych badań. Błękit Evansa
oraz kontrole zestawu zawierają azydek sodu 0,09%, pełniący funkcję konserwantu i należy obchodzić się
z nim ostrożnie — nie połykać i nie dopuszczać do kontaktu ze skórą lub błonami śluzowymi. W razie
kontaktu przepłukać dane miejsce dużą ilością wody i zwrócić się o pomoc medyczną. Wybuchowe azydki
metalu mogą tworzyć się w przypadku kontaktu z ołowianymi lub miedzianymi elementami instalacji
kanalizacyjnej. W przypadku utylizacji odczynnika należy przepłukać instalację dużą ilością wody, aby nie
dopuścić do gromadzenia się azydku. Ten produkt powinien być używany wyłącznie przez przeszkolone
osoby oraz zgodnie z przeznaczeniem. Zalecane jest przestrzeganie podanej procedury.
Warunki przechowywania
Nieotwarte zestawy powinny być przechowywane w temperaturze 2–8°C i mogą być używane w trakcie
podanego terminu ważności. NIE ZAMRAŻAĆ. Gdy preparaty zostaną wyjęte z torebki foliowej, należy ich
natychmiast użyć. Rozcieńczony bufor PBS II może być przechowywany maksymalnie przez jeden miesiąc
w temperaturze 2–8°C. Wszystkie inne odczynniki powinny być przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Próbki krwi powinny być pobierane poprzez wkłucie dożylne, powinny w naturalny sposób skrzepnąć,
a surowica powinna zostać jak najszybciej oddzielona, aby nie dopuścić do hemolizy. Surowica przed analizą
może być przechowywana w temperaturze 2–8°C do 7 dni lub dłużej, jeśli zostanie podzielona i będzie
przechowywana w temperaturze -20°C lub niższej.4. NIE zamrażać i rozmrażać surowicy więcej niż jeden raz.
Unikać surowicy lipemicznej, hemolizowanej lub skażonej bakteryjnie, ponieważ może dojść do obniżenia
stężenia lub może wystąpić niewyraźne wybarwienie.
Badanie
Dostarczone materiały (zestawy)
704160
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
10 x przełyk małpy (skóra) – 5-dołkowy preparat
1 x 1 ml kontroli pozytywnej – pęcherzyca (wstępnie rozcieńczona)
1 x 1 ml kontroli pozytywnej pemfigoidu (wstępnie rozcieńczona)
1 x 1 ml systemu kontroli negatywnej IFA (wstępnie rozcieńczona)
1 x 7 ml FITC IgG (H i L), koniugat małpy
1 x 3 ml barwnika kontrastowego – błękit Evansa 1%
2 x 25 ml koncentratu PBS II (x40)
1 x 3 ml środka do osadzania preparatu
20 bibułek
10 szkiełek nakrywkowych
1 broszura z instrukcjami
2
704165
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
25 x przełyk małpy (skóra) – 10-dołkowy preparat
1 x 1 ml kontroli pozytywnej – pęcherzyca (wstępnie rozcieńczona)
1 x 1 ml kontroli pozytywnej pemfigoidu (wstępnie rozcieńczona)
1 x 1 ml systemu kontroli negatywnej IFA (wstępnie rozcieńczona)
1 x 15 ml FITC IgG (H i L), koniugat małpy
1 x 3 ml barwnika kontrastowego – błękit Evansa 1%
2 x 25 ml koncentratu PBS II (x40)
1 x 10 ml środka do osadzania preparatu
50 bibułek
25 szkiełek nakrywkowych
1 broszura z instrukcjami
Dostarczone materiały (preparaty)
504160
504160.10
1 x preparat przełyku małpy (skóra) (5 dołków)
10 x preparat przełyku małpy (skóra) (5 dołków)
Wymagane materialy nie dolaczone do zestawu
Woda destylowana do rozcieńczania koncentratu PBS II
Naczynie do buforu PBS II
Mikropipety i jednorazowe końcówki do przenoszenia próbek pobranych od pacjentów
Komora wilgotna do czynności związanych z inkubacją
Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm
Plastikowa gruszka laboratoryjna do wstępnego płukania w buforze PBS II
Dodatkowe elementy można zakupić w firmie INOVA Diagnostics: PBS II (508998), system kontroli
negatywnej IFA (508186), kontrola pozytywna pęcherzycy (504051), kontrola pozytywna pemfigoidu (504055),
FITC (H+L) koniugat małpy (504011, 504071), błękit Evansa 1% (504049) i środek do osadzania preparatu
(508001, 508005, 508006).
3
Procedura badania
Kontrola jakości
Przy każdym badaniu próbek powinna być stosowana kontrola pozytywna i negatywna.
1.
Środek do osadzania preparatu: Wyjąć środek do osadzania preparatu z chłodziarki, aby przed
użyciem osiągnął temperaturę pokojową (18–28°C).
2.
Rozcieńczyć koncentrat PBS II. Rozcieńczyć koncentrat PBS II wodą destylowaną lub
dejonizowana (1 część koncentratu PBS II + 39 części wody destylowanej lub dejonizowana) i
wymieszać. Uwaga: przygotować całą zawartość PBS II zestawu, jeśli cały zestaw zostanie zużyty w
ciągu jednego miesiąca. Bufor PBS II jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako
bufor do płukania.
3.
Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta. Rozcieńczyć próbki pochodzące od pacjenta w stosunku
1/10, dodając 20 µl surowicy do 180 µl buforu PBS II.
4.
Preparaty substratu. Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć temperaturę
pokojową (18–28°C). Odpowiednio oznaczyć preparaty, umieścić w komorze wilgotnej i dodać jedną
kroplę kontroli pozytywnej oraz negatywnej do odpowiednich dołków. Do pozostałych dołków dodać
50 µl rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjenta.
5.
Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 30 minut w komorze wilgotnej w temperaturze
pokojowej (18–28°C). (Zmoczone ręczniki papierowe na dnie komory utrzymają wilgoć.)
6.
Płukanie PBS II. Wyjąć preparaty z komory wilgotnej i krótko przepłukać PBS II posługując się
gruszką laboratoryjną. Nie kierować strumienia bezpośrednio na dołki. Umieścić preparaty w statywie,
zanurzyć w buforze PBS II i wstrząsać lub mieszać przez 5–10 minut.
7.
Dodanie fluorescencyjnego koniugatu.Strząsnąć nadmiar buforu PBS II i osuszyć przestrzeń wokół
dołków za pomocą dostarczonych bibułek. Umieścić preparaty ponownie w komorze wilgotnej
i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą odpowiednio rozcieńczonego fluorescencyjnego koniugatu.
NIE POZOSTAWIAĆ ODKRYTYCH DOŁKÓW NA CZAS DŁUŻSZY NIŻ 15 SEKUND.
8.
Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 30 minut w komorze wilgotnej w temperaturze
pokojowej (18–28°C).
9.
Płukanie PBS II. Wykonać ponownie płukanie, zgodnie z punktem 6.
10.
Opcjonalne barwienie kontrastowe. Przed zanurzeniem preparatu dodać 2–3 krople błękitu Evansa
1% na 100 ml buforu PBS II.
11.
Osadzanie ze szkiełkiem nakrywkowym. Wyjąć po kolei preparaty z płukanki PBS II. Osuszyć
szybko obszar wokół dołków i do każdego dołka dodać kroplę środka do osadzania preparatu.
Opuścić ostrożnie preparat na szkiełko nakrywkowe. Należy starać się nie dopuścić do powstania
pęcherzyków powietrza, ale jeśli występują, nie należy ich usuwać. Zetrzeć nadmiar środka do
osadzania wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego.
12.
Obejrzeć preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym.Preparaty mogą być przechowywane do
3 dni w temperaturze 2–8°C, w ciemności, bez istotnej utraty fluorescencji.
Kontrola jakości
Kontrola pozytywna pęcherzycy powinna wykazać jasnozielone zabarwienie w kostniwie międzykomórkowym
nabłonka („wzór siatki drucianej”). Kontrola pozytywna pemfigoidu powinna wykazać jasnozielone zabarwienie
błony podstawowej. Kontrola negatywna powinna wykazać zgniłozielone zabarwienie we wszystkich
tkankach, bez dostrzegalnej fluorescencji.
Jeśli powyżej opisane kontrole nie zostaną uzyskane, badanie jest nieprawidłowe i należy je powtórzyć.
4
Interpretacja wyników
Kolorowy przykład fotograficzny tego wzoru można znaleźć w punkcie ref. 2. Wyniki są raportowane jako
pozytywne lub negatywne.
Pozytywne przeciwciało pęcherzycy
Zabarwienie kostniwa międzykomórkowego nabłonka wielowarstwowego.
Pozytywne przeciwciało pemfigoidu
Zabarwienie strefy błony podstawowej wzdłuż połączenia skórno-naskórkowego.
Uwaga: Każde laboratorium powinno ustalić, na którym etapie wynik pozytywny jest traktowany jako klinicznie
istotny.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Źródło światła, filtry i przyrządy optyczne różnych producentów mikroskopów fluorescencyjnych
wpływają na wrażliwość badania. Działanie mikroskopu jest w dużym stopniu uzależnione od
prawidłowej obsługi/serwisowania. Szczególnie dotyczy to wycentrowania lampy rtęciowej oraz jej
wymiany, zgodnie z zaleceniami serwisowymi
Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA), przeciwmitochondrialne (AMA), przeciw-mięśnia gładkiego
(ASMA) oraz mięśnia szkieletowego mogą reagować z substratem przełyku. Obecność tych
autoprzeciwciał powinna być potwierdzona na odpowiednim substracie.
Test ten, gdy przeprowadza się go jako jedyny, nie powinien być rozpatrywany jako diagnostyczny.
Muszą zostać uwzględnione wszystkie inne czynniki, w tym historia kliniczna pacjentów oraz inne
wyniki serologiczne lub wyniki badań biopsyjnych.
Na skutek małej odległości pomiędzy dołkami na preparacie 10-dołkowym, może wystąpić krzyżowe
zanieczyszczenie próbek i kontroli. Należy zachować ostrożność, szczególnie na etapie płukania, aby
do tego nie dopuścić.
Przydatność do stosowania z odczynnikami IFA innych producentów nie została sprawdzona, ale
stosowanie z takimi odczynnikami nie koniecznie musi być wykluczone.
Może wystąpić reaktywność krzyżowa na skutek obecności przeciwciał grupy krwi anty-A i anty-B,
ponieważ śluzówka przełyku może zawierać określone substancje grupy krwi.3 U niektórych
pacjentów wzór zabarwienia może przypominać przeciwciała pęcherzycy, pomimo tego, że
przeciwciała grupy krwi również będą barwić kapilary umięśnienia przełyku.
Preparaty sprzedawane oddzielnie są sklasyfikowane jako „Odczynniki analityczne”. Nie ustalono ich
właściwości analitycznych i wynikowych z wyjątkiem uwzględnienia jako składniku zestawu.
Spodziewane wartości
Preparaty przełyku małpy (skóra) zostały użyte do badania pacjentów z chorobami skóry: pęcherzycy
i pemfigoidu jak również do badania 20 losowo wybranych dawców krwi. Wyniki:
Grupa
pacjentów
Pęcherzyca
Pemfigoid
Normalne
Numer
12
11
20
Liczba dodatnia
Międzykomórkowe
Strefa błony
podstawowej
12
0
0
9
0
0
5
Specyficzna charakterystyka wyników
Badanie porównawcze zostało przeprowadzone na 25 próbkach surowicy (17 klinicznych, 8 normalnych) przy
użyciu tego zestawu oraz komercyjnie dostępnej metody referencyjnej do pozytywnych próbek pęcherzycy i
pemfigoidu. Ogólnie pomiędzy zestawami występowała dobra zgodność. W przypadku pęcherzycy 10 z 13
próbek wykazało wyniki pozytywny w obu zestawach. Dwie z niezgodnych próbek były na granicy wyniku
pozytywnego w zestawie, ale negatywne w zestawie referencyjnym. W przypadku pemfigoidu wszystkie cztery
pozytywne próbki wykazały zgodność, pomimo tego, że zabarwienie było nieco słabsze w zestawie
konkurującym. Osiem normalnych przetestowanych próbek dało wynik negatywny w obu zestawach.
Podsumowanie badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Rozcieńczyć bufor PBS II wodą destylowaną lub dejonizowana.
Rozcieńczyć surowicę pacjenta buforem PBS II w stosunku 1/10.
Doprowadzić preparaty substratu do temperatury pokojowej (18–28°C).
Do odpowiednich dołków wlać 50 µl grupy kontrolnej pozytywnej i negatywnej oraz rozcieńczoną
surowicę pacjenta.
Inkubować w komorze wilgotnej przez 30 minut.
Płukać przez 5–10 minut w buforze PBS II.
Osuszyć obszar wokół każdego dołka i natychmiast pokryć każdy dołek kroplą koniugatu.
Inkubować zgodnie z punktem 5.
Przepłukać zgodnie z punktem 6.
Osadzić.
Obejrzeć preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym.
6
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
Weller, T. H; Coons, A.H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes
Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
Bradwell A. R. et al (1997): Atlas of autoantibody patterns on tissues. Pub: The Binding Site Ltd.,
Birmingham UK.
Szulman AE. (1962): The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp.
Med. 115 977
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ.
PRU Publications, Sheffield. 14.
NOVA Lite I INOVA Diagnostics, Inc. jest zastrzeżonym znakiem handlowym Copyright 2013. Wszelkie prawa
zastrzeżone©
7
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady):
877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych):
1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
624160POL Listopad 2013
Wersja 2
8