Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM 2010/2011

Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
ELEKTROFOREZA BIAŁEK SUROWICY
Frakcja
%
Białka
Albuminy
60-71
Albumina
Alfa 1
1.4-2.9
1antytrypsyna, kw. 1glikoproteid,
1mikroglobulina, 1 chymotrypsyna
Alfa 2
7-11
haptoglobina, a2 makroglobulina
Beta
8-13
Transferyna, ceruloplazmina, hemopeksyna,
 lipoproteina, C3 ukł. dopełniacza
Gamma
9-16
Immunoglobuliny, białko C-reaktywne
Obraz elektroforetyczny charakterystyczny dla gammapatii monoklonalnych (szpiczak mnogi):



Białko monoklonalne zlokalizowane jest we frakcji gamma (najczęściej immunoglobuliny IgG
oraz IgM) lub we frakcji beta (najczęściej immunoglobulina klasy IgA).
We frakcji gamma brak fizjologicznie występującej poliklonalnej frakcji immunoglobulinowej
– prawidłowe plazmocyty i ich produkt- poliklonalna immunoglobulina zostały „wyparte”
przez patologiczny klon plazmocytów oraz białko monoklonalne.
Niska albumina i podwyższona frakcja alfa2 mogą sugerowad towarzyszące szpiczakowi
uszkodzenie nerek.
Obraz elektroforetyczny charakterystyczny dla zespołu nefrotycznego (nerczycowego):




Obniżona frakcja albuminowa wskazuje na utratę albuminy z moczem (uszkodzenie nerek).
Wzrost frakcji alfa2 z powodu wzrostu stężenia białka alfa2 makroglobuliny (alfa2
makroglobulina o masie cząsteczkowe 725 kDa nie przechodzi przez uszkodzoną błonę
podstawną kłębuszków nerkowych, stąd względny (w stosunku do pozostałych białek
osocza) wzrost stężenia tego białka. W zespole nefrotycznym, z przyczyn idiopatycznych,
wzrasta również bezwzględne stężenie alfa2 makroglobuliny.
Wzrost frakcji beta może byd spowodowany wzrostem stężeo białek ostrej fazy na skutek
reakcji zapalnej obejmującej kłębuszki nerkowe.
Możliwa widoczna hipoproteinemia (obniżenie stężenia białka całkowitego)
Obraz elektroforetyczny charakterystyczne dla chorób wątroby



Obniżona frakcja albuminowa (spadek produkcji albuminy)
Podwyższona frakcja gamma – chorobom wątroby często towarzyszą przewlekłe procesy
zapalne.
Widoczny także charakterystyczny dla chorób wątroby tzw. ”mostek beta-gamma”.
Obraz charakterystyczny dla przewlekłego procesu zapalnego oraz chorób autoimmunologicznych:


Wzrost frakcji gamma (hipergammaglobulinemia) – wzrost produkcji poliklonalnych
immunoglobulin jako reakcja na stan zapalny lub na tle odpowiedzi autoimmunologicznej.
Możliwy wzrost frakcji a1 oraz a2 spowodowany wzrostem stężeo białek ostrej fazy.
1
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
Obraz charakterystyczny dla ostrego stanu zapalnego:
 Wzrost frakcji a1 oraz a2 (wzrost orozomukoidu,  1 antytrypsyny i haptoglobiny).
 Brak charakterystycznego wzrostu frakcji gamma.
________________________________________________________________________
IMMUNOFIKSACJA BIAŁEK SUROWICY
Jest badaniem wykonywanym w diagnostyce gammapatii monoklonalnej:
 Metoda bardziej czuła niż tradycyjna elektroforeza na żelu agarozowym
 Pozwala ocenid klasę oraz typ immunoglobuliny monoklonalnej
Zasada metody:

Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym (warunki standardowe)

Reakcja antygen – przeciwciało

Usunięcie niezwiązanego przeciwciała

Utrwalenie białka na żelu (kwas TCA)

Barwienie (kwaśny fiolet)
2
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
METODY OZNACZANIA BIAŁEK
wartości referencyjne białka całkowitego w surowicy: 60-80 g/L
1. Metoda biuretowa
o
o
o
o
o
o
o
o
Skład odczynnika : CuSO4, winian sodowo – potasowy, NaOH, KJ (winian sodowo-potasowy stabilizator, KJ zapobiega redukcji alkalicznego kompleksu miedzi)
Pomiar absorbancji – 540 nm
Zakres liniowości metody: 2 - 15 g/L
Stosunkowo mało substancji interferujących (sole amonowe, jony magnezu, biuret)
Intensywnośd barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu aminokwasowego
oznaczanego białka (dla różnych białek podobny współczynnik absorbcji molowej)
możliwośd przystosowania do suchej chemii
Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w surowicy (analizator Hitachi – Roche Diagnostics)
Metoda użyteczna również do oznaczania peptydów
2. Metoda Lowry’ego (Folin-Ciocalteu)
o
Skład odczynników:
A) CuSO4 ,winian sodowo – potasowy, NaOH, Na2CO3
B) Odczynnik Folin-Ciocalteu (mieszanina kwasu fosfowolframowego
fosfomolibdenowego)
i kwasu
Ponieważ odczynnik Folin-Ciocalteu nie jest stabilny w środowisku alkalicznym, musi byd prowadzona
jako reakcja dwuetapowa
o
Pomiar absorbancji - 750 nm
o
o
Zakres liniowości metody: 10mg/L – 1 g/L
Wiele substancji interferujących (np. Tris, HEPES, EDTA, SDS i inne detergenty, mocznik, DTT,
merkaptoetanol, związki tiolowe, redukujące cukry)
reakcja wymaga ścisłej kontroli pH
Trudna do automatyzacji
Natężenie powstałej barwy różna dla różnych białek (zależy od zawartości aminokwasów:
tyrozyny, tryptofanu, cysteiny – problemy z otrzymaniem uniwersalnej krzywej kalibracyjnej)
o
o
o
3. Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA)
o
o
Skład odczynnika: Na2CO3, NaOH , winian sodowy - Na2C4H4O6 , CuSO4, BCA
Pomiar absorbancji – 562 nm
o
o
o
o
Zakres liniowości metody: 0,1–1 g/L (mikrometoda) lub 0,5 – 10 mg/L (makrometoda)
Niewielkie różnice współczynnika absorpcji dla różnych białek
Reakcja jednoetapowa - kompleks jest stabilny w środowisku alkaicznym
Znacznie większa tolerancja metody na większośd czynników interferujących z metoda
Lowry’ego (przede wszystkim detergenty)
Możliwośd automatyzacji metody
Reakcję przeprowadza się w temperaturze pokojowej 37 °C
o
o
3
Analityka ogólna, dwiczenia dla studentów III OAM
Wydział Farmaceutyczny UJCM, Zakład Diagnostyki Medycznej
2010/2011
4. Metoda Bradforda
o
o
Skład odczynnika: Coommassie Brillant Blue G- 250, 95% etanol, 85% kwas fosforowy
Pomiar absorbancji – 595 nm
o
o
o
o
o
Wysoce specyficzna dla białek
Zakres liniowości metody: 1-10 µg (mikrometoda) 10-100 µg (makrometoda)
Test kompatybilny z większością substancji interferujących w metodach Lowrego i BCA
Nieliniowa krzywa kalibracyjna
Współczynnik absorpcji ściśle zależy od rodzaju mierzonego białka (przede wszystkim od
zawartości takich aminokwasów jak lizyna i arginina w białku), bardzo ważny dobór
odpowiedniej krzywej kalibracyjnej
Ważny czas prowadzenia reakcji – kompleks barwnik – białko jest stabilny przez około 1
godzinę
o
5. Absorbancja w nadfiolecie
o
o
o
o
Pomiar absorbancji roztworu białka przy długości fali 280 nm
Używana do oszacowania stężenia białka, lub do detekcji np. przez detektor HPLC
Światło absorbowane jest przede wszystkim przez aromatyczne aminokwasy obecne w białku
(tyrozyna, tryptofan)
Znaczna ilośd substancji interferujących (np. kwasy nukleinowe)
6. Metoda nefelometryczna
o
o
Zasada metody: pomiarze natężenia światła rozproszonego pod kątem różnym od 180 stopni
w stosunku do kąta padania światła (najczęściej pod kątem 90 lub 45 stopni).
BEHRING Nephelometer II (immunonefelometria):
 Szeroki panel oznaczanych białek:
(albumina, prealbumina, CRP (hs CRP), transferyna, immunoglobuliny, transferyna,
ceruloplazmina, haptoglobina, składniki dopełniacza, SAA, cystatyna C,beta2 mikroglobulina,
alfa1 maktoglobulina, łaocuchy lekkie immunoglobulin – kappa, lambda)
 Wykorzystywany materiał : surowica/ osocze, mocz, PMR
 Nie nadaje się do oznaczeo w roztworach wstępnie mętnych (lipemia)
7. Metoda turbidymetryczna
o
o
o
Metoda zmętnieniowa: z użyciem kwasu TCA (trichlorooctowego), kwasu sulfosalicylowego,
chlorku benzetonium (w środowisku NaOH)
Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w moczu, PMR (analizator Hitachi – Roche
Diagnostics)
Zakres liniowości metody: 2 – 200 mg/dl
4