1 Katedra Mikrobiologii UŚ Biotechnologia I rok

„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜsze i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
Katedra Mikrobiologii UŚ
Biotechnologia I rok
METODY OCENY POTENCJAŁU BIODEGRADACYJNEGO MIKROORGANIZMÓW
ĆWICZENIE II
Temat: Izolacja DNA genomowego i plazmidowego ze szczepów zdolnych do rozkładu
jedno- i wielopierścieniowych związków aromatycznych
Wszystkie czynności wykonujemy w rękawiczkach lateksowych!
Odczynniki, wykorzystywane na ćwiczeniach mogą działać draŜniąco na oczy i skórę, część z
nich moŜe powodować uczulenie w następstwie naraŜenia na drogą oddechową oraz wywołać
powaŜne poparzenia. Zachować szczególne środki ostroŜności.
Izolacja genomowego DNA z wykorzystaniem zestawu do izolacji Genomic Mini
1. Do probówki typu eppendorf o pojemności 2 ml pobrać 1,5 ml hodowli wybranego
szczepu i odwirować 12 000 obr/min przez 1 min., supernatant wylać, a do osadu dodać
ponownie 1,5 ml hodowli i odwirować.
2. Osad zawiesić w 100 µl buforu TRIS i dobrze wymieszać przez rozpipetowanie.
3. Dodać niewielką ilość lizozymu.
4. Dodać 200 µl buforu lizującego LT i 20 µl roztworu Proteinazy K (przechowywać w
temp. 4 oC – po uŜyciu schować do lodówki)
5. Całość wymieszać poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki i inkubować w temp 75oC
przez 5 min. w bloku grzejnym. (Po inkubacji do bloku grzejnego włoŜyć eppendorfy z
wodą – zostanie wykorzystana później).
6. Następnie próbkę intensywnie zworteksować przez 20 sekund i zwirować 11 000 obr/min
przez 3 min.
7. Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do oczyszczania genomowego DNA,
następnie zwirować 11 000 obr/min przez 1 min.
8. Do kolumny dodać 500 µl roztworu płuczącego A1, zwirować 11 000 obr/min przez 1
min.
1
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜsze i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
9. Przenieść minikolumnę do nowej probówki (w zestawie) i dodać 400 µl roztworu
płuczącego A1, zwirować 11 000 obr/min przez 2 min.
10. Osuszoną minikolumnę przenieść do nowych probówek typu eppendorf (1,5 ml) i dodać
50 µl wody uprzednio ogrzanej do 75oC.
UWAGA! Dodanie wody centralnie na powierzchnię membrany zapewnia uzyskanie
maksymalnej wydajności odzysku DNA. NaleŜy unikać dotykania ścianek minikolumn
mikropipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
11. Próby inkubować 5 min w temp. pokojowej, po czym zwirować 11 000 obr/min przez 1
min.
12. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajduje się w probówce, przechowywać je w
lodowce do dalszych analiz.
Izolacja plazmidowego DNA z wykorzystaniem zestawu do izolacji Plasmid Mini AX
1. Do probówki typu eppendorf o pojemności 2 ml pobrać 2 ml hodowli wybranego szczepu
i odwirować 12 000 obr/min przez 1 min., supernatant wylać, a do osadu dodać ponownie
2 ml hodowli i odwirować. Czynności powtarzać, aŜ uzyska się osad z 10 ml hodowli.
2. Uzyskany osad zawiesić w 0,6 ml roztworu L1.
3. Dodać 0,6 ml roztworu L2 i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki,
pozostawić w temp. pokojowej przez 3 min.
4. Dodać 0,6 ml roztworu L3T i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki,
następnie zwirować 12 000 obr/min przez 5 min.
W trakcie wirowania próbek, przygotować kolumny do oczyszczania plazmidowego
DNA. W tym celu umieścić w statywie probówki odbierające i włoŜyć do nich kolumny.
Następnie kolumny zrównowaŜyć poprzez dodanie 1 ml roztworu K1 i poczekać aŜ
roztwór wypłynie z kolumny – kolumna pracuje grawitacyjnie.
5. Po odwirowaniu próbek pobrać supernatant i nanieść na kolumny, poczekać aŜ lizat
przejdzie przez kolumny.
6. Do kolumny dodać 4 ml roztworu płuczącego K2 i poczekać, aŜ roztwór wypłynie z
kolumny.
7. Dodać do kolumny 0,3 ml roztworu elucyjnego K3 i poczekać aŜ wypłynie z kolumny.
2
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyŜsze i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
8. Przenieść kolumnę do 2 ml probówki do precypitacji i eluować DNA poprzez dodanie do
kolumny 1 ml roztworu elucyjnego K3.
9. Do eluatu zawierającego DNA dodać 0,8 ml mieszaniny precypitacyjnej PM, całość
wymieszać i wirować 5 min. przy 10 000 obr/min.
10. Po odwirowaniu zlać supernatant, jasnoniebieski osad DNA powinien być widoczny na
dnie probówki. Do osadu dodać 0,5 ml 70 % etanolu. Próbkę wymieszać i wirować 3
min. 10 000 obr/min.
11. Zlać supernatant i trzymając probówkę w pozycji odwróconej celem kapilarnego
usunięcia alkoholu. Następnie osuszyć odwrócona do góry dnem probówkę w temp.
pokojowej przez 5 min. lub dłuŜej jeśli na ściankach znajdują się jeszcze resztki
alkoholu.
12. Osad zawiesić w jałowej wodzie destylowanej o objętości 50 µl.
W celu sprawdzenia poprawności przeprowadzonych procedur izolacji DNA wykonać 1 %
Ŝel agarozowy:
1. Do kolbki odwaŜyć 1 g agarozy i zalać 100 ml buforu do elektroforezy TAE. Agarozę
wymieszać i rozpuścić poprzez zagotowanie w kuchence mikrofalowej.
2. Schłodzić Ŝel do temperatury około 60 oC i dodać 2,5 µl bromku etydyny.
UWAGA! Bromek etydyny jest silnym kancerogenem. Pracować w rękawiczkach
lateksowych. Unikać kontaktu ze skórą. Korzystać tylko z pipety przeznaczonej do
bromku etydyny i tylko w miejscu specjalnie w tym celu wyznaczonym.
3. Przygotować sanki do wylewania Ŝelu, umieścić w nich grzebień i wylać rozpuszczoną
agarozę.
1. Po związaniu się Ŝelu (około 20-30 min) wyjąć grzebień i umieścić Ŝel w aparacie do
elektroforezy, zalać buforem TAE.
2. Przygotować opis Ŝelu oraz marker wielkości DNA i próbki do nałoŜenia:
- Marker: 4,5 µl wody, 0,5 µl markera Lambda/HindIII i 1 µl barwnika Loading Dye
- dla kaŜdej próbki: 20 µl próbki i 4 µl barwnika Loading Dye
3. Rozwijać elektroforezę przez około 60 minut przy napięciu 80 V.
4. Obejrzeć Ŝel w świetle UV. Wykonać dokumentację Ŝelu.
3