Badanie oddziaływania białko-ligand metodą izotermicznego

Badanie oddziaływania białko-ligand metodą ITC na przykładzie białka
CRP.
Wstęp.
Pomiary kalorymetryczne są powszechnie wykorzystywane do pozyskiwania informacji
o termodynamicznych właściwościach makrocząsteczek. Techniki te opierają się na precyzyjnym
pomiarze ciepła towarzyszącego przemianom, które są wywołane najczęściej przez zmiany temperatury,
bądź postęp reakcji.
Jedną z głównych technik jest izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne (ang. Isothermal
Titration Calorimetry, ITC), będące doskonałym narzędziem służącym do badania oddziaływań
międzycząsteczkowych. Jako jedyna technika, umożliwia uzyskanie pełnego opisu termodynamicznego
badanego procesu w pojedynczym eksperymencie. Poprawnie zaprojektowane doświadczenie dostarcza
informacji o stechiometrii wiązania (n), stałej równowagi (K) a więc i entalpii swobodnej reakcji (G), a
także daje możliwość wyznaczenie molowej entalpii (H) i entropii wiązania (S). Dodatkowo
wykonując pomiary w różnych temperaturach uzyskać można wartość zmiany pojemności cieplnej
towarzyszącej procesowi wiązania liganda (Cp).
ITC posiada kilka ważnych zalet w porównaniu z innymi technikami. Przede wszystkim sygnał
cieplny jest uniwersalną własnością prawie wszystkich reakcji. Stąd możliwość zastosowania tej
techniki do badania większości reakcji. Istotna jest wspomniana już możliwość poznania wielu wielkości w jednym eksperymencie. Próbka nie ulega zniszczeniu w trakcie pomiaru, a substraty reakcji nie
są w żaden sposób modyfikowane. Zasadnicze wady metody, które jeszcze kilka lat temu poważnie
ograniczały jej stosowanie w biochemii, czyli wysoka materiałochłonność i niska czułość, obecnie nie
odgrywają takiej roli. Najnowsze aparaty pracują przy stężeniach białek rzędu ułamka mikromola, co
umożliwia badanie układów o szerokim zakresie stałej wiązania (102 - 109 M-1).
Dla silniejszych oddziaływań bezpośrednio wyznaczyć można jedynie stechiometrię wiązania
i standardową entalpię reakcji, natomiast stała równowagi wiązania wyznaczana jest w sposób pośredni.
Jednak w tym przypadku konieczne jest, aby jedna z badanych cząsteczek dodatkowo tworzyła
kompleks z innym substratem, dla którego możliwe jest wyznaczenie stałej równowagi. Wykonując
eksperyment miareczkowania kalorymetrycznego, gdzie jako titrant stosowany jest substrat o większym
powinowactwie, a titrantem jest kompleks o niższej stałej równowagi dochodzi do wypierania słabiej
związanego substratu, przez silniej wiązany. Dzięki znajomości stałej równowagi dla słabiej
oddziałującego kompleksu oraz molowej entalpii wiązania silniej oddziałującego liganda, eksperyment
pozwala określić stałe wiązania dochodzące do 1012 M-1.
Technika ITC często stosowana jest przy pomiarach oddziaływań: białko – ligand, białko –
białko, białko – DNA, czy też białko – lipid. Określenie wszystkich parametrów termodynamicznych
charakteryzujących oddziaływanie pozwala na głęboki wgląd w badany proces, umożliwiając określenie
rodzajów oddziaływań prowadzących do utworzenia kompleksu. Jeśli substraty oddziałują ze sobą w
bardziej skomplikowany sposób, to znaczy, gdy stechiometria różna jest od jedności, określony zostaje
schemat oddziaływania i wyznaczyć można parametry termodynamiczne opisując poszczególne klasy
miejsc wiążących. Pozwala to na zobrazowanie interakcji pomiędzy miejscami wiążącymi,
zidentyfikowanie kooperatywności, oraz określenia jej charakteru.
Zaznaczyć należy, że wyznaczona wartość H obrazuje nie tylko ciepło tworzenia wiązań
pomiędzy oddziałującymi cząsteczkami, ale także inne równowagowe procesy takie jak zmiany
konformacyjne w obrębie cząsteczek, zmiany w ich oddziaływaniu z rozpuszczalnikiem, czy też
jonizacje grup polarnych składników reakcji, lub buforu. Zmiana entalpii swobodnej mierzonych
procesów złożona jest z dwóch członów: entalpowego i entropowego. Techniką ITC bezpośrednio
obserwujemy pierwszy z nich. Tylko w przypadku reakcji o dużym udziale zmiany entropii i niewielkim
entalpii, nie można zaobserwować przebiegu procesu. Znajomość udziału obu członów w zmianach
entalpii swobodnej pozwala wnioskować o molekularnym mechanizmie wiązania reagentów: ilości
1
tworzonych i rozrywanych wiązań, zmianach stopni swobody łańcuchów polipeptydowych i grup
bocznych, zmianach uwodnienia i jonizacji czy ekspozycji powierzchni makrocząsteczek dostępnej dla
wody
Budowa i zasada działania kalorymetru.
ITC
opiera
się
na
pomiarze
wymienionego w toku reakcji ciepła, dla
różnych wartości stężeń reagentów. W
warunkach izotermiczno-izobarycznych, w
których to przeprowadzany jest eksperyment,
ciepło reakcji (Q) utożsamiane jest z entalpią
reakcji (H). Pomiar realizowany jest poprzez
dodawanie równych objętości jednego z
reagentów (titranta) do komory pomiarowej, w
której znajduje się drugi z reagentów (analit).
Ich stężenia dobrane są w ten sposób, aby
umożliwić uzyskanie wysokiego stopnia
wysycenia
miejsc
wiążących.
Podczas
1 Zależność kształtu krzywej miareczkowania od
pierwszych dodatków, gdy występuje znaczny Rys.
wartości parametru c.
nadmiar
analitu,
praktycznie
wszystkie
cząsteczki
titranta
utworzą
kompleks
z
cząsteczkami
analitu.
Jednakże
występująca równowaga termodynamiczna powodować będzie, że podczas kolejnych dodatków liczba
nowo powstających kompleksów będzie sukcesywnie spadać. Wartości wymienianego ciepła pozwalają
na pomiar molowej entalpii reakcji. Zmiana wielkości wymienianego ciepła dla kolejnych dodatków
titranta pozwala na wyznaczenie stałej równowagi reakcji, natomiast stosunki molowe reagentów, dla
których widoczny jest proces wysycania miejsc wiążących informują nas o stechiometrii reakcji.
Precyzyjne wyznaczenie stałej równowagi wymaga dobrego zobrazowania procesu stopniowego
wysycania miejsc wiążących. Uważa się, że sukcesywny spadek wartości mierzonego ciepła, obrazujący
ten proces, powinien obejmować, co najmniej kilka kolejnych dodatków titranta. Sytuacja taka ma
miejsce, jeśli wartość iloczynu stężenia miejsc wiążących i stałej równowagi, zwana parametrem „c”
mieści się w granicach od 1 do 1000, jednak estymowana wartość stałej równowago obarczona jest
najmniejszym błędem, jeśli „c” będzie w przedziale od 10 do 100 (patrz rysunek 1).
Zasadniczą częścią kalorymetru są dwie komory: pomiarowa i referencyjna (o pojemności ok.
1,4 mL). Obie umieszczone są w metalowych płaszczach zapewniających termostabilność z
dokładnością do kilku dziesięciotysięcznych części kelwina. Pomiędzy komorami a płaszczem
umieszczone są termostosy, mierzące różnicę temperatur, która jest następnie przeliczana na moc, z jaką
jest grzana lub chłodzona próbka. Roztwór liganda jest podawany przez strzykawkę, której tłokiem
kieruje precyzyjny silnik krokowy. Igła jest jednocześnie mieszadłem. Komorę referencyjną wypełnia
się cieczą o zbliżonej pojemności cieplnej do badanej próbki. W przypadku eksperymentów w buforach
wodnych stosuje się wodę. Wszystkie roztwory należy przed doświadczeniem starannie odgazować, aby
uniknąć błędów wywołanych pojawieniem się pęcherzyków gazu.
Pomiar jest realizowany poprzez kolejne, mikrolitrowe dodatki roztworu liganda (L) do próbki z
makromolekułą (M) z kilkuminutowymi odstępami. Sygnałem kalorymetru jest moc w funkcji czasu.
(rys. 2).
2
Rys. 2. Przykładowy rezultat eksperymentu ITC, zależność mocy od czasu.
Dla uzyskania wysokiej precyzji w pomiarach ciepła, podczas wykonywania eksperymentu komora
referencyjna jest ciągle podgrzewana strumieniem ciepła rzędu mikrowatów. Powstająca w wyniku tej
operacji różnica temperatur generuje linię bazową na wykresie. Wydzielane w wyniku reakcji ciepło
wpływa na tę różnicę, a jej zależność od czasu jest parametrem rejestrowanym podczas eksperymentu.
Całkując krzywą względem czasu dla poszczególnych dodatków otrzymuje się wykres zależności
efektów cieplnych (Q) od stosunku molowego stężeń reagentów ([T]/[A]).
Rys. 3. Przykładowy rezultat eksperymentu ITC, zależność ciepła
od stosunku molowego reagentów - entalpogram .
Budowa aparatu (rys. 4) powoduje, że rejestrowane
ciepło nie jest explicite ciepłem reakcji. Wynika to m.in. ze
zmiany całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej podczas
miareczkowania i powoduje, że konieczne jest
wprowadzenie szeregu poprawek. Komora pomiarowa,
skonstruowana jest w ten sposób, że rejestrowane przez
aparat wymieniane ciepło (ΔQ(i)), pochodzi wyłącznie z
określonej, stałej objętości (V), która przez cały czas
trwania eksperymentu wypełniona jest całkowicie cieczą.
3
Rys. 4 Budowa kalorymetru
Dlatego też zmiana objętości mieszaniny reakcyjnej wywołana dodatkiem titranta (dV) spowoduje
wydostanie się jej nadmiaru z części komory pomiarowej, dla której rejestrowane jest ciepło. Ponieważ
ciepło to rejestrowane jest także w czasie przeprowadzania iniekcji, gdy dokonuje się zmiana stężenia
reagentów, dodatkowo zarejestrowana jest także część ciepła reakcji pochodząca od wypływającej
cieczy. Zgodnie z ogólnie przyjętą metodą postępowania założone zostało, że kinetyka reakcji oraz
mieszanie reagentów są na tyle szybkie, że zarejestrowane jest dodatkowo 50 % efektu cieplnego
pochodzącego od wypływającej objętości mieszaniny reakcyjnej. Dlatego też użyto standardowej
poprawki związanej z tym efektem:
dV  Q(i )  Q(i  1) 
Q(i )  Q(i )  i 
  Q(i  1)
V 
2
gdzie: ΔQ(i) to ciepło zarejestrowane podczas i-tego dodatku, V to objętość czynnej części komory
pomiarowej, dVi to dodana objętość titranta, a Q(i-1) i Q(i) to skumulowane ciepła wymienione podczas
kolejnych dodatków liganda począwszy od pierwszego odpowiednio do i-1-go i i-tego.
Miareczkowanie w sposób oczywisty wpływa także na stężenie analitu, powodując jego rozcieńczenie.
Dodawanie nie zaniedbywalnie małych objętości, powoduje, że stężenie to zmienia się także w trakcie
iniekcji i jest ono równe stężeniu aktualnie wypływającemu z objętości czynnej komory pomiarowej. W
przypadku szybkiego mieszania, średnie stężenie analitu, jest średnią ze stężeń występujących na
0
początku ( CT ) i końcu iniekcji (CT). Dlatego też, korzystając z prawa zachowania mas otrzymujemy
poprawkę na końcowe stężenie analitu (CT) po dodatku o objętości dV:
dV
V
2
CT  CT0 
dV
V
2
Identyczny efekt zmusza do zastosowania poprawki na stężenie titranta, która to wyprowadzona
została dzięki analogicznemu rozumowaniu.
 dV 
Ct  Ct0  1 

 2V 
gdzie: Ct to stężenie titranta po dokonaniu iniekcji, V i dV to odpowiednio objętość czynnej części
komory pomiarowej i objętość dodatku. Ct0 jest natomiast hipotetycznym stężeniem titranta, w przypadku gdyby dodany titrant w całości pozostał w objętości V.
Podczas miareczkowania istotny wkład do rejestrowanego ciepła wnoszą także procesy
rozcieńczania składników reakcji (qdil), w szczególności ciepło rozcieńczania titranta, a także efekty
cielne ewentualnych, dodatkowych procesów towarzyszących prowadzonemu eksperymentowi, np.
ciepło protonacji/deprotonacji buforu. Wówczas zmierzona entalpia Hobs będzie równa:
,
gdzie n oznacza wypadkową liczbę moli wymienionych protonów, Hbuf entalpię jonizacji
zastosowanego buforu, a H0 entalpię procesu mierzoną w obecności buforu o zerowej entalpii
jonizacji.
Dlatego też analizę wyników powinno przeprowadzać się po uwzględnieniu tych efektów.
Rozważając najprostszy przypadek, gdy analit (A) tworzy z titrantem (B) bimolekularny
kompleks (AB) oddziaływanie opisać można schematem:
A  B  AB
W stanie równowagi termodynamicznej, wartości stężeń poszczególnych składników reakcji
spełniają równanie:
[ AB]

K

[ A]  [ B] (1  )  [ B]
4
Gdzie: K to stała równowagi reakcji, [A], [B] i [AB] to odpowiednio stężenia titranta, analitu
i powstałego kompleksu, natomiast  jest frakcją miejsc wiążących analitu obsadzonych przez titrant.
W tym przypadku ciepło wydzielone podczas tworzenia kompleksu, gdy układ dochodzi do stanu równowagi, zależeć będzie od molowej entalpii wiązania (H) i od ilości moli utworzonego kompleksu, a to
z kolei zależeć będzie od stężenia substratu znajdującego się w komorze pomiarowej ([A]), stopnia
wysycenia jego miejsc wiążących (), oraz objętości komory pomiarowej (V) zgodnie z zależnością:
Q  [ Atot ]  V    H
W przypadku białek często mamy do czynienia z większą ilością miejsc wiążących ligand dla
jednej makromolekuły. Do analizy tych sytuacji służą dwa kolejne modele.
Pierwszy z nich wyróżnia dwie klasy miejsc wiążących, niezależnych od siebie. Używając
symboliki analogicznej dla poprzedniego modelu, możemy go przedstawić w formie dwóch równań:
2
1
i
.
K2 
K1 
(1  1 )  [ B]
(1   2 )  [ B]
Wówczas ilość wydzielonego ciepła w każdym dodatku będzie opisana równością:
Q  [ Atot ]  V (n11H1  n2  2 H 2 ) .
Model sekwencyjnego wiązania ligandów zakłada następcze reakcje wiązania ligandów:
K3
Kn
K1
K2
A  B 
AB 
AB2 
 
ABn
W tym modelu brak rozróżnienia, które miejsca są wysycane, informacja dotyczy tylko całkowitej
liczby miejsc wysyconych. W efekcie rozróżnia się makroskopowe (K) i mikroskopowe stałe wiązania
(k). Obserwowane stałe wiązania zdefiniowane podanymi powyżej wzorami to makroskopowe stałe.
Stałe mikroskopowe opisują równowagę, która byłby mierzona dla pojedynczego miejsca wiązania.
Relację pomiędzy nimi określa równość:
n  i 1
Ki 
ki ,
i
gdzie n – całkowita liczba miejsc wiążących, i – kolejne obsadzone miejsce. Opisane rozróżnienie
stałych równowagi jest rezultatem czynników statystycznych. Wiązane jako pierwsze cząsteczki liganda
mogą obsadzać większą liczbę miejsc wiążących niż kolejne.
W przypadku białek często związanie pierwszej cząsteczki liganda wpływa na powinowactwo
wiązania kolejnej, co określamy kooperatywnością. Kooperatywność dodatnia występuje, gdy kolejny
ligand wiąże się z wyższą stałą wiązania, natomiast w przeciwnym wypadku mówimy o
kooperatywności ujemnej. Ilościowo kooperatywność określamy parametrem α, będącym stosunkiem
dwóch kolejnych stałych mikroskopowych.
Ilość ciepła wydzielonego podczas pojedynczego dodatku w tym modelu określa równanie:
Q  [ Atot ]  V ( F1H1  F2 [H1  H 2 ]    Fn [H1    H n ]) ,
gdzie Fn 
K1 K 2 K 3  K n [ B] n
.
1  K1 [ B]  K1 K 2 [ B] 2  K1 K 2  K n [ B] n
Podczas miareczkowania istotny wkład do rejestrowanego ciepła wnoszą także procesy
rozcieńczania składników reakcji, w szczególności ciepło rozcieńczania titranta. Dlatego też analizę
wyników przeprowadza się po uwzględnieniu tego efektu. Wykorzystanie równań (2) i (3) do opisu
eksperymentalnej zależności wymienionego ciepła od stężeń reagentów, pozwala na obliczenie stałej
równowagi reakcji i molowej entalpii reakcji. Natomiast molowa entropia reakcji wyliczona zostaje z
podstawowej zależności termodynamicznej opisującą entalpię swobodną reakcji:
G  H  T  S  RT ln K
Aby natomiast uzyskać wartość zmiany pojemności cieplnej wykonujemy kilka doświadczeń w
różnych temperaturach korzystając z zależności:
5
C p 
 (H )
.
T
Cel ćwiczenia.
Celem ćwiczenia jest analiza oddziaływania cAMP z białkiem bakteryjnym CRP.
Wykonanie.
1. Zaplanować parametry eksperymentu (stężenia białka i liganda).
2. Sporządzić próbki o stężeniach określonych podczas planowania eksperymentu w ilości: 2
ml dla białka i 0,5 ml dla ligandu.
3. Wykonać eksperyment miareczkowania CRP przez cAMP z zużyciem mikrokalorymetru
VP-ITC.
4. Dokonać analizy otrzymanego rezultatu z wykorzystaniem oprogramowania firmy Microcal.
Sprawozdanie.
1. Opisać szczegółowo wykonanie ćwiczenia.
2. Na podstawie uzyskanych parametrów analizy poszczególnych modeli wybrać właściwy,
uzasadniając wybór.
3. W oparciu o uzyskane wyniki przedyskutować parametry termodynamiczne badanego układu.
Zagadnienia do przygotowania:
Podstawy termodynamiki. Funkcje termodynamiczne. Równowaga reakcji. Entalpia swobodna i
jej związek z równowagą reakcji. Entalpia van`t Hoffa. Rodzaje wiązań niekowalencyjnych. Energetyka
wiązań kowalencyjnych i niekowalencyjnych. Termodynamika oddziaływania białko-ligand (udział
entalpii, entropii).
6