docWpływ wybranych induktorów na proFil izoForm cytochromu P450 w
download 
Reklamacja Transkrypt
Wpływ wybranych induktorów na proFil izoForm cytochromu P450 w
&ARM0RZEGL.AUK 7PYWWYBRANYCHINDUKTORÌWNAPROFILIZOFORMCYTOCHROMU0 WWTROBIESZCZURAWRÌNYCHFAZACHYCIAPOZAPODOWEGO 4HEINFLUENCEOFTHESOMEINDUCTORSONTHECOMPOSITION OFTHECYTOCHROME0ISOFORMSINTHERATLIVER INTHEDIFFERENTPHASESOFTHELIFEAFTERBIRTH !NDRZEJ0LEWKA$ANUTA0LEWKA*ÌZEF7ALOSZEK*ACEK-ARCZYÊSKI :AKAD0ROTEOMIKIgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY3OSNOWIEC +ATEDRA-ORFOLOGII:AKAD(ISTOLOGIIgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY+ATOWICE Streszczenie Abstract Jedną z unikalnych właściwości mikrosomalnego układu metabolizmu leków i ksenobiotyków jest jego indukcyjność zachodząca pod wpływem różnych związków chemicznych. Celem badań było wykazanie jak zmienia się profil konstytucyjnych i indukowalnych izoform cytochromu P450 związanych z metabolizmem ksenobiotyków w funkcji wieku. Szczególnej uwadze poddano te izoformy, które pojawiają się w różnych fazach życia szczura po indukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonowej i deksametazonowej. Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Serie badawcze obejmowały 8 grup wiekowych, tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. W wyizolowanej z wątroby frakcji mikrosomalnej oceniano poziomy następujących białek: CYP3A1, CYP2C11, CYP2C6, CYP2A1, CYP1A1, CYP1A2 i CYP2B1/2. Wykazano, że w serii fenobarbitalowej z ocenianych izoform, trzy, tj. CYP2B1/2, CYP2C6 i CYP2A1 były obserwowane we wszystkich badanych przedziałach wiekowych. Najdynamiczniej przyrastała izoforma CYP2B1/2, która począwszy od 2 miesiąca życia szczura 7-krotnie przekraczała poziom ujawniony w najmłodszej z badanych grup. Poziom CYP2C6 i CYP2A1 w tym samym czasie osiągał wartości, co najwyżej 3-krotnie przewyższające poziom zwierząt najmłodszych. W serii β-naftoflawonowej izoforma CYP1A1 szybko zwiększała swoje stężenie i już u zwierząt 2 miesięcznych stwierdzono poziom sięgający 700% wartości grupy najmłodszej. W serii deksametazonowej bardzo dynamicznie narastał poziom izoformy CYP3A1. Już w 1 miesiącu życia stwierdzono ponad 300% indukcję, która w kolejnych fazach życia sięgała nawet 650% kontroli. Na podstawie badań można sądzić, że zmiany całkowitej zawartości cytochromu P450 nie wynikają z podobnych zmian, przynajmniej głównych indukowalnych izoform tej hemoproteiny. One of the unique features of the microsomal system of the medicines and xenobiotics metabolism is its induction happening under the influence of the different chemical compounds. The aim of the resarches was to demonstrate how the profile of the constitutional and inducible cytochrome P450 isoforms connected with the xenobiotic metabolism is changing in the function of the age of the rat. Especially, the attention was turned to these isoforms that appear in the different phases of the rat life after the phenobarbitale, β-naphthoflawone and dexametazone induction. The researches were done on male rats (breed of Wistar). The research series concerned 8 age groups of the rats: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- and 28 months old. There were evaluated the levels of the following proteins: CYP3A1, CYP2C11, CYP2C6, CYP2A1, CYP1A1, CYP1A2 and CYP2B1/2 in the isolated from the liver microsomal fraction. It was proved that the in phenobarbitale series three of the evaluated isoforms: CYP2B1/2, CYP2C6 and CYP2A1 were observed in all researched age brackets. The isoform CYP2B1/2 was growing the most dynamic, starting from the 2. month of the rat life it exceeded seven times the level revealed in the youngest of the researched groups. At the same time, the level of CYP2C6 and CYP2A1 reached values which at the most exceeded three times the level of the youngest animals. In the β-naphthoflawone series the concentration of the isoform CYP1A1 was increasing very fast and the level reaching 700 per cent of the value of the youngest group was already observed in the 2-month-old animals. In the dexametazone series the level of the isoform CYP3A1 was growing very dynamic. In the first month of life there was already founded over 300 per cent induction, which in the following phases of life reached even 650 per cent of the control. According to the researches it can be concluded that general changes of the cytochrome P450 content do not result from the synchronized changes of the main constitutional and inducible isoforms of this hemoproptein. Słowa kluczowe: szczur, wątroba, wiek, cytochrom P450, indukcja Key words: rat, liver, ageing, cytochrome P450, induction COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. Wstęp Jedną z unikalnych właściwości mikrosomalnego układu metabolizmu leków jest jego indukcyjność zachodząca pod wpływem związków chemicznych w metabolizmie, których uczestniczy [1-5]. Liczbę tych związków szacuje się obecnie na ponad 250. Są to substancje różne tak pod względem natury chemicznej jak i działania biologicznego. Induktory dzieli się na kilka grup. Reprezentantem pierwszej z nich jest fenobarbital, drugiej 3-metylocholantren czy β-naftoflawon a trzeciej, 16α-karbonitryl pregnenolonu. Pierwsza grupa induktorów obejmuje związki przestrzenne i niepolarne, takie jak barbiturany czy wielochlorowcowe bifenyle. Do grupy drugiej należą związki o płaskich pierścieniach, między innymi policykliczne węglowodory aromatyczne, fenotiazyny, indole czy flawonoidy. Do trzeciej należą głównie hormony steroidowe i ich analogi. Kolejną z nich reprezentuje etanol [6-8]. Indukowana etanolem izoforma CYP2E1 odpowiada za wysoką aktywność oksydacyjną, conajmniej 3-krotny wzrost zużycia NADPH i jest ona zaangażowana w mikrosomalną peroksydację lipidów [9]. Ostatnią z omawianych grup reprezentuje klofibrat [10], który indukuje rodzinę 4 cytochromu P450. Izoenzymy te pojawiają się z równoczesną proliferacją peroksysomów [10] i zwiększają hydroksylację kwasów tłuszczowych. Fenobarbital indukuje akumulację mRNA dla cytochromów P450 2B1 i 2B2 z poziomów niemierzalnych w wątrobach szczurów kontrolnych do dominujących po indukcji już po kilku godzinach [11]. W wątrobach szczurów fenobarbital powoduje w ciągu 3-4 godzin 20-50 krotny wzrost tempa transkrypcji genu dla cytochromu P450 2B1 i 2B2, po czym następuje akumulacja specyficznego mRNA [12, 13]. Wzrost zawartości cytochromu P450 jest porównywalny do wzrostu transkrypcji. Maksymalną zawartość ogólną cytochromu P450 uzyskuje się w 3 dniu po podaniu induktora, jednak nie przekracza ona poziomu kontrolnego więcej niż 2-4-krotnie. Zwiększonej zawartości hemoproteiny towarzyszy także przyrost ogólnej masy wątroby, wzrost stężenia białka i fosfolipidów. Indukcji podlega aktywność reduktazy zależnej od NADPH, N-demetylaza 4-aminopiryny czy benzofetaminy, hydroksylazy aniliny, hydratazy epoksydowej itd. Z drugiej grupy induktorów najlepiej poznanym jest 3-metylocholantren, β-naftoflawon oraz benzo(a)piren. Ta grupa związków indukuje wyspecjalizowaną, ale też ograniczoną liczbę enzymów. Po podaniu induktora tej grupy, aktywność monooksygenazowa zaczyna narastać po 4 - i osiąga maksimum po 24 godzinach. Jest to spowodowane działaniem induktora na transkrypcję P4501A1-mRNA, który zwykle nie ulega ekspresji w wątrobie zwierząt kontrolnych. Stopień indukcji różni się w zależności od narządu [14, 15], ale z reguły jest wyższy od fenobarbitalowego. Indukowane poziomy aktywności enzymatycznej przekraczają często kilkadziesiąt razy wartość grup kontrolnych. Indukcji podlega między innymi aktywność hydroksylazy węglowodorów aromatycznych (AHH), transferazy kwasu UDP-glukuronowego, hydroksylazy acetanilidu itd. [16]. 16α-Karbonitryl pregnenolonu (PCN), główny induktor fizjologiczny wywołuje proliferację wątrobowej siateczki śródplazmatycznej i wzrost ogólnej zawartości cytochro- mu P450. Ksenobiotyk ten indukuje odmienne aktywności monooksygenazowe niż fenobarbital i 3-metylocholantren [17]. Wykazano, że PCN czy deksametazon podwyższają tempo syntezy cytochromu P450 oraz akumulację mRNA dla podrodziny CYP3A [18]. Sugeruje to, że etap transkrypcji jest fazą regulatorową w mechanizmie indukcyjnym [19, 20]. Zależnie od natury chemicznej ksenobiotyków zwykle są indukowane izoenzymy CYP należące do poszczególnych podrodzin. Na przykład, główne izoformy indukowane przez policykliczne węglowodory aromatyczne czy benzo(a)piren należą do podrodziny CYP1A. Chlordan, dieldrin, chlorowane węglowodory czy fenobarbital zwykle indukują izoformy CYP2B. Deksametazon i metyrapon przeważnie indukują białka podrodziny CYP3A. Osobny problem to zmieniająca się indukcyjności różnych form cytochromu P450 w poszczególnych przedziałach wieku. Niewiele jest prac, które określały rozwojowe różnice w składzie izoenzymów cytochromu P450 i aktywnościach enzymatycznych z nimi związanych. Zawartości izoform zazwyczaj korelowano z markerowymi aktywnościami poszczególnych form cytochromu. I tak, aktywność CYP 2B1/2 i 1A1/2 monitorowano odpowiednio przez ocenę N-demetylacji benzofetaminy i O-deetylację 7-etoksyrezorufiny [21]. Uzyskane wyniki sugerowały, że u szczura niska indukcyjność CYP1A1/2 w okresie okołoporodowym rosła w fazie starzenia. Przeciwnie, wysoka indukcyjność CYP2B1/2 po podaniu fenobarbitalu u zwierząt młodych obniżała się wraz z wiekiem. Zapewne, powodem słabej indukcyjności CYP1A1/2 noworodka, jest fakt, że izoenzym ten jest główną formą w tym okresie życia. Analogicznie, indukcyjność cytochromu P450 2B1/2 jest najniższa u dojrzałych zwierząt, u których enzym ten dominuje. Celem badań było wykazanie jak zmienia się profil indukowalnych izoform cytochromu P450 związanych z metabolizmem ksenobiotyków w funkcji wieku. Szczególnie ważne było określenie zestawu tych izoform w różnych fazach życia szczura po indukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonowej i deksametazonowej. Materiały i metody Zwierzęta Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Zwierzęta pochodziły z hodowli Centralnej Zwierzętarni Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach-Ligocie. Serie badawcze obejmowały 8 grup wiekowych, tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. Zwierzęta grupy najmłodszej przebywały cały czas z matkami. Po usamodzielnieniu się, każde zwierzę przebywało osobno w klatkach plastikowych a hodowla była prowadzona w tym samym pomieszczeniu o ustalonej wilgotności powietrza (około 60%), temperaturze (20-22 0C) i rytmie 12-godzinowego oświetlenia (dzień-noc: 600-1800). Szczury karmiono paszą standardową (LSM), którą usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny dostęp do wody. Szczury zabijano przez dekapitację. Natychmiast pobierano wątroby i umieszczano je w lodowatym roztworze soli fizjologicznej. &ARM0RZEGL.AUK Badania uzyskały akceptację Komisji Etycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Traktowanie Szczurom pierwszej serii eksperymentalnej podawano dootrzewnowo dwukrotnie fenobarbital w dawkach po 75 mg/kg masy ciała na 3- i 2 dni przed dekapitacją. Wszystkie iniekcje wykonano o godzinie 900. Zwierzęta drugiej serii doświadczalnej otrzymywały trzykrotnie dootrzewnowo β-naftoflawon. Podawano go na 3-, 2- i 1 dzień przed dekapitacją w dawkach po 40 mg/kg masy ciała zawsze o godzinie 900. Wreszcie, zwierzęta trzeciej serii doświadczalnej otrzymywały dootrzewnowo deksametazon. Podawano go o godzinie 900 w postaci zawiesiny w oleju kukurydzianym również trzykrotnie na 3-, 2- i 1 dzień przed zabiciem w dawce po 20 mg/kg masy ciała. Stała godzina podawania induktora podyktowana była podatnością układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 na zmiany pod wpływem rytmu okołodobowego [22, 23] Izolacja frakcji mikrosomalnej Wątrobową frakcję mikrosomalną izolowano według metody Dallnera [24]. Po kilkukrotnym przepłukaniu w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę i czterech pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnym był 0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze Tris-HCl o pH=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm3 tego roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano w temperaturze 2-4 0C. Uzyskane czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym 20% o/o roztworze glicerolu, tak aby stężenie białka było nie mniejsze niż 5 mg/cm3. Próby te natychmiast zamrażano w temperaturze -20 0C. W badaniach pilotowych czystość frakcji mikrosomalnej oceniano poprzez wykonanie zdjęć w mikroskopii elektronowej, a niezależnie oceniano poziom aktywności enzymu markerowego frakcji mitochondrialnej (dehydrogenazy burszty- nianowej), jako ewentualnego zanieczyszczenia uzyskanych mikrosomów. Brak aktywności tej dehydrogenazy oznaczał brak obecności mitochondriów we frakcji mikrosomalnej. Rozdział elektroforetyczny i elektrobloting Podłożem roboczym używanym do rozdziału elektroforetycznego białek był żel poliakrylamidowy o grubości 1 mm i długości 15 cm a sam rozdział odbywał się w układzie opisanym przez Laemmliego [25]. W swoim początkowym odcinku złoże było 4% żelem (tzw. stacking gel) w 0,125 milimolowym Tris-HCl (pH 6,8) zawierającym 0,1% SDS. Część robocza złoża to 10% żel (tzw. running gel) w 0,375 milimolowym Tris-HCl (pH 8,8) zawierającym także 0,1% SDS. W przestrzeniach wokółelektrodowych stosowano 0,1% roztwór SDS, zawierający w 1 dm3 6 g Trisu i 28,8 g glicyny. W miarę potrzeby pH tego roztworu ustawiano na 8,5. Po zakończeniu elektroforezy białka z żelu zostały przeniesione na błonę nitrocelulozową, stosując elektrobloting mokry. Transfer trwał 1 godzinę przy napięciu 100 V w buforze o pH 8,3 o składzie: 25 milimolowy Tris-HCl, 192 milimolowa glicyna i 20% o/o metanol. Wykrywanie antygenów Nitroceluloza po transferze była inkubowana przez 30 minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym (1% buforowana kazeina), a następnie z odpowiednim przeciwciałem pierwotnym przez całą noc w temperaturze 4 0C. Przeciwciała odnosiły się do następujących białek: CYP3A1, CYP2C11, CYP2C6, CYP2A1, CYP1A1, CYP1A2 i CYP2B1/2. Po usunięciu przeciwciała, błona nitrocelulozowa była 3-krotnie płukana w roztworze kazeiny, a następnie inkubowana przez 30 minut z odpowiednim biotynylowanym przeciwciałem wtórnym. W kolejnym etapie błona została umieszczona w roztworze ABC na 10 minut (ABC - kompleks awidyna-biotynylowana-peroksydaza). Po usunięciu tego roztworu i wypłukaniu, nitrocelulozę równoważono przez 5 minut 0,1 molowym buforem Tris-HCl o pH 9,5, a następnie dodano roztwór substratu (BCIP/NBT). Całość Ryc. 1. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażonych w nanomolach/mg białka mikrosomalnego u szczurów w różnym wieku po indukcji fenobarbitalowej. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. Ryc. 2. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażonych w nanomolach/mg białka mikrosomalnego u szczurów w różnym wieku po indukcji β-naftoflawonowej. była inkubowana przez 30 minut w ciemności, płukana w buforze PBS i suszona. Wybarwione bloty poddano ilościowej analizie densytometrycznej. Wyniki Seria fenobarbitalowa W serii fenobarbitalowej stwierdzono obecność izoform 2B1/2, 2C6 i 2A1 we wszystkich ocenianych grupach wiekowych. Izoforma 2B1/2 ulegała silnej indukcji i jej poziomy rosły w kolejnych grupach wiekowych (Ryc. 1). Już po 1 miesiącu życia pozapłodowego, poziom tej izoformy stanowił 240% wartości stwierdzonej w grupie 0,5 miesięcznej, przyjętej jako grupa odniesienia. W kolejnych miesiącach rósł on jeszcze dynamiczniej, przekraczając conajmniej 7-krotnie poziom stwierdzony w grupie najmłodszej. Po 1 roku życia indukcyjność była słabsza, ale w dalszym ciągu sięgała poziomu 500-600% wartości grupy odniesienia. Izoforma 2C6 również zwiększała swój poziom w funkcji wieku szczura (Ryc. 1). Począwszy od 1 miesiąca życia pozapłodowego jej poziom wynosił 250-300% wartości grupy najmłodszej, a stan trwał do 1 roku życia. W tym przedziale wieku nastąpił wyraźny spadek stężenia tej izoformy (około 125% wartości grupy 0,5 miesięcznej), ale w miarę starzenia się zwierząt poziom ten ponownie narastał, tak że w grupie najstarszej stwierdzono poziom rzędu 250% wartości grupy odniesienia. Trzecia z ocenianych izoform, tj. CYP2A1 zachowywała się podobnie do 2C6. Stwierdzone przyrosty poziomu tej izoformy były jednak nieco wyższe i przekraczały nawet 450% wartości grupy najmłodszej (Ryc. 1). I tym razem ujawniono spadek poziomu tego białka w 1 roku życia i delikatny wzrost w kolejnych fazach życia, gdzie poziom ten przekraczał 300% wartości grupy odniesienia. Seria β-naftoflawonowa W tej serii doświadczalnej we wszystkich grupach wiekowych stwierdzono obecność izoform 1A1, 1A2 i 2A1. Poziom pierwszej z nich narastał po 2 tygodniach życia pozapłodowego. Jeśli przyjąć wartość z tej grupy wiekowej za punkt odniesienia, to już w 1 miesiącu życia szczura obserwowano 2-krotny wzrost stężenia 1A1 (Ryc. 2). Po kolejnym miesiącu życia wartość ta ponownie podwajała się, przekraczając poziom 450%. Przez kilka kolejnych miesięcy ujawnił się niższy, ale stabilny, około 300% poziom tej izoformy. Po 1 roku życia następował stały, stabilny spadek poziomu, aż do około 150% w grupie najstarszej. Izoforma 1A2 najwyższy poziom osiągała w najmłodszej z badanych grup (Ryc. 2). Od tej chwili obniżała swój poziom do około 75% wartości grupy najmłodszej, który utrzymywał się co najmniej do 1 roku życia. U zwierząt starszych następował dalszy spadek, tak że w ostatniej grupie wiekowej był on 2-krotnie niższy w porównaniu do zwierząt najmłodszych. Trzecia z ujawnionych izoform, tj. CYP2A1 zwiększała swoje poziomy najbardziej dynamicznie. Już po 1 miesiącu życia pozapłodowego został stwierdzony prawie 4-krotny wzrost stężenia tego białka w porównaniu do grupy najmłodszej (Ryc. 2). W kolejnych miesiącach poziom ten dalej narastał, przekraczając wartość 800% grupy odniesienia. Dopiero w dwóch ostatnich grupach wiekowych nastąpił wyraźny spadek poziomu izoformy 2A1, ale i tak stanowił on 350% wartości grupy najmłodszej. Seria deksametazonowa W tej serii doświadczalnej we wszystkich grupach wiekowych stwierdzono obecność izoform 3A1, 2C11 i 2C6. Poziom izoformy 3A1 ulegał silnej indukcji we wszystkich badanych grupach wiekowych (Ryc. 3). Już po 1 miesiącu życia pozapłodowego, poziom tej izoformy stanowił 540% wartości stwierdzonej w grupie 0,5 miesięcznej, przyjętej jako grupa odniesienia. W kolejnych miesiącach wzrost ten nie był tak dynamiczny, ale przekraczał conajmniej 3-krotnie poziom stwierdzony w grupie najmłodszej. Bardzo silny przyrost poziomu izoformy stwierdzono u zwierząt najstarszych, gdzie sięgał poziomu 650% wartości grupy odniesienia. &ARM0RZEGL.AUK Ryc. 3. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażonych w nanomolach/mg białka mikrosomalnego u szczurów w różnym wieku po indukcji deksametazonowej. Ryc. 4. Zawartość niektórych wątrobowych izoform cytochromu P450 wyrażona jako procent kontroli u szczurów w różnym wieku po indukcji deksametazonowej. Izoforma 2C11 również zwiększała swój poziom w funkcji wieku szczura (Ryc. 3). Począwszy od 1 miesiąca życia pozapłodowego jej poziom wynosił 450% wartości grupy najmłodszej. Od 4 miesiąca życia przyrost poziomu tej izoformy był słabszy, tak że w 1 roku życia obserwowano powrót do poziomu grupy najmłodszej. W kolejnych przedziałach wieku nastąpił ponowny stężenia tej izoformy (do około 200% wartości grupy 0,5 miesięcznej). Trzecia z ocenianych izoform zmieniała się bardzo dynamicznie w funkcji wieku. Już w 1 i 2 miesiącu życia poziom CYP2C6 był praktycznie 4-krotnie wyższy w porównaniu do szczurów najmłodszych (Ryc. 3). Poziom tej izoformy w kolejnych grupach wiekowych był nadal wysoki i oscylował na poziomie 300% w porównaniu do grupy najmłodszej a stan ten trwał aż do końca życia zwierząt. W serii deksametazonowej stwierdziliśmy obecność takich samych izoform cytochromu P450 we wszystkich grupach wiekowych, jak w serii kontrolnej [26]. Pozwoliło to na szerszą charakterystykę obserwowanych zmian profilu tych izoform. I tak, CYP3A1 podlegał silnej indukcji już u zwierząt najmłodszych, gdzie ujawniliśmy wzrost poziomu tej izoformy do ponad 300% kontroli (Ryc. 4). W kolejnych fazach życia szczura indukcyjność ta sięgała conajmniej 600%. Dopiero od 8 miesiąca życia indukcyjność tej izoformy spadała. Od około 400% w 8 miesiącu do niecałych 150% w 20 miesiącu życia. W najstarszej z badanych grup ujawniliśmy efekt inhibitorowy, bowiem poziom CYP3A1 stanowił tylko 60% wartości grupy kontrolnej. Porównując uzyskane wyniki z odpowiednimi wartościami grup kontrolnych stwierdzono, że CYP2C11 u zwierząt najmłodszych 1,5-krotnie zwiększa swój poziom po traktowaniu deksametazonem (Ryc. 4). W kolejnej grupie wiekowej indukcja osiągała poziom 350% kontroli, ale w kolejnych fazach wieku deksametazon wyraźnie obniżał poziom CYP2C11. U 2 miesięcznych zwierząt inhibicja pro- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. wadziła do spadku zawartości tego białka do poziomu 35% kontroli. W kolejnych grupach wiekowych hamowanie było słabsze (od 60 do 70% kontroli). U szczurów najstarszych obserwowano wartości charakterystyczne dla kontroli. CYP2C6 u zwierząt niedojrzałych płciowo podlegał inhibicji pod wpływem deksametazonu. Prowadziła ona do spadku sięgającego 40% kontroli u zwierząt 0,5 miesięcznych, ale w trzech kolejnych grupach wiekowych była słabsza i oscylowała na poziomie 80% kontroli (Ryc. 4). Począwszy od 8 miesiąca obserwowano nawet 2-krotną indukcję tej izoformy, ale zwierzęta najstarsze zareagowały na deksametazon ponowną inhibicją CYP2C6. Dyskusja Podanie fenobarbitalu w zasadzie nie zmieniało profilu zmian poziomu cytochromu P450 w funkcji wieku w porównaniu do kontroli [27-29]. Należy zauważyć, że we wszystkich grupach wiekowych fenobarbital pełnił funkcję induktorową, chociaż w zróżnicowanym stopniu. Szczególnie wysoką indukcyjność obserwowano w grupach zwierząt młodych i dojrzałych płciowo (2-8 miesięcy), gdzie omawiany związek co najmniej podwajał stężenie hemoproteiny w mikrosomach, co obserwowano również w innych laboratoriach [30, 31], jakkolwiek spotyka się wyższą indukcję [32]. U szczurów traktowanych fenobarbitalem w mikrosomach akumuluje się prawdopodobnie kilkanaście różnych izoenzymów P450, w tym izoformy CYP3A1, CYP3A2, CYP2C6, CYP2C7 i CYP2A1 a zwłaszcza izoformy 2B1 i 2B2 [11, 3335]. Mechanizm, poprzez który fenobarbital stymuluje ekspresję tych białek jest już dość dobrze poznany [11, 33, 36]. Dotyczy on modulacji czynników transkrypcyjnych działających na cis-elementy właściwego genu CYP [37]. Istotna w tym mechanizmie jest sekwencja promotorów dla CYP, posiadających relatywnie mało sekwencji wiążących dla tzw. wątrobowych wzmacniających czynników transkrypcyjnych, co może być odpowiedzialne za niską konstytutywną ekspresję CYP2B1/2 [38], głównych form cytochromu P450 indukowanych przez fenobarbital [39]. Przykładowo mRNA dla wątrobowego CYP2B1 i 2B2 nie zmienia swojego stężenia w funkcji wieku [40-42], jednak po indukcji fenobarbitalowej rośnie ono, szczególnie u szczurów młodych [40, 43]. Wykazano również, że na przykład hormon wzrostu jest antagonistą dla indukcji fenobarbitalowej [44, 45]. Jest prawdopodobne, że hormon ten może regulować ekspresję genów P450 wpływając na łączenie transkryptów, transport i stabilizowanie RNA, translację mRNA, stabilność i aktywność enzymu [45]. Ponieważ fenobarbitalowa indukcja CYP 2B1/2 wymaga syntezy nowego białka, to należy brać pod uwagę i takie dodatkowe czynniki regulujące jak, inhibicyjne działanie cAMP [47] oraz transdukcyjne sygnały kinazy białkowej C [48]. Okazało się ponadto, że fenobarbital podwyższa syntezę hemu, syntezę apocytochromu P450 i inkorporację hemu do tego apobiałka dzięki czemu nie dochodzi do kumulacji hemu w hepatocytach. Wchodzenie w okres starzenia się zwierząt obniża indukcyjność cytochromu P450 pod wpływem fenobarbitalu i co istotne, jest ona utrzymana praktycznie na niezmiennym poziomie, aż do końca życia. Jest to o tyle ciekawe, że w tej fazie życia następował stopniowy spadek stężenia białka mi- krosomalnego. Tak więc zmniejszenie indukcyjnego działania fenobarbitalu w stosunku do cytochromu P450 w omawianym okresie życia, ma prawdopodobnie różne przyczyny [49, 50], ale jedna z nich zapewne wynika z ograniczonych możliwości biosyntetycznych hepatocytów. Ze względu na brak wyraźnych oznak pobudzenia syntezy białka de novo, należy sądzić, że induktor w tej fazie życia szczura stabilizuje cytochrom P450 drogą wydłużonego czasu półtrwania. β-Naftoflawon przejawiał efekt indukcyjny we wszystkich grupach wiekowych [51]. W tej serii badawczej znamiennym dla cytochromu P450 jest to, że po indukcji β-naftoflawonem przebieg zmian poziomu tego białka w funkcji wieku jest zbieżny z grupami kontrolnymi. Jest to nowe spostrzeżenie, bowiem w literaturze istnieją sugestie o braku zmian ogólnego stężenia omawianego cytochromu bez względu na wiek zwierząt [14, 28, 31]. Porównując dynamikę narastania zawartości cytochromu P450 w grupach kontrolnych i grupach omawianej serii induktorowej, zauważono wręcz takie same tendencje w przedziale wieku 12-28 miesięcy. Przyjmując, że β-naftoflawon indukuje tę samą rodzinę izoform cytochromu P450 [52], znaczy to, że począwszy od 12 miesiąca życia zwierząt nie zmiana się skład jakościowy tych izoform. Z drugiej strony biorąc pod uwagę fakt, że w omawianym przedziale wieku następuje spadek zawartości białka mikrosomalnego w serii β-naftoflawonowej, to biorąc pod uwagę stabilną indukcyjność, należy przyjąć, że o ile zawartość właściwa cytochromu P450 faktycznie rosła, to jego zawartość bezwzględna zachowuje status quo. Szczególnej uwagi wymaga grupa 15-dniowa. O ile w pozostałych grupach wiekowych indukcyjność cytochromu P450 po fenobarbitalu była wyższa niż po β-naftoflawonie, o tyle w grupie 15-dniowej obserwowano tendencję odwrotną. Wyniki tej pracy potwierdzają, że w kilka dni po urodzeniu izoformy P450 indukowane przez induktory typu I są wyraźnie zdominowane przez hemoproteiny stymulowane induktorami typu II. Dopiero wraz z wiekiem relacje te ulegają odwróceniu i stan ten zostaje zachowany do końca życia. Wpływ deksametazonu na zawartość cytochromu P450 miał zupełnie inny charakter niż działanie obu powyżej omówionych induktorów [53-55]. W tym przypadku efekt induktorowy obserwowano w przedziale od 4 do 20 miesiąca życia. Podobne efekty wpływu deksametazonu na układ monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 odnotowano w innych laboratoriach [56-58], jednak przy wyższych dawkach deksametazonu, sięgających 100 mg/kg, stosowanych nawet przez kilka dni. W skrajnych grupach wiekowych, tj. w grupach niedojrzałych płciowo oraz u zwierząt bardzo starych, związek ten był inhibitorem omawianego cytochromu [59]. Konstatacja ta dotyczy wyłącznie zawartości właściwej cytochromu P450. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że w grupach zwierząt młodych serii deksametazonowej stężenie białka było wysokie a ogólny poziom cytochromu P450 nie zmieniał się, to można przyjąć, że deksametazon u młodych zwierząt stymuluje syntezę tej hemoproteiny w takim stopniu, że jej stężenie absolutne narasta. W grupie najstarszej, przy spadku ogólnego stężenia białka i praktycznie niezmiennym poziomie zawartości właściwej cytochromu P450 przez cały okres życia zwierząt, absolutne stężenie omawianej hemoproteiny w tej serii badawczej również rosło. &ARM0RZEGL.AUK Wnioski 1. Spośród badanych białek, w każdej serii induktorowej ujawniono co najmniej trzy izoformy CYP, które występowały we wszystkich grupach wiekowych. 2. W każdej serii induktorowej jedna z badanych izoform cechowała się wyraźnie wyższym poziomem. 3. Szczególnie wysokie poziomy badanych izoform obserwowano u zwierząt dojrzałych płciowo, które jednak nie ukończyły 1-roku życia. Piśmiennictwo 1. Pavek P, Dvorak Z. Xenobiotic-induced transcriptional regulation of xenobiotic metabolizing enzymes of the cytochrome P450 superfamily in human extrahepatic tissues. Curr Drug Metab 2008; 9: 129-143. 2. Czekaj P. Phenobarbital-induced expression of cytochrome P450 genes. Acta Biochim Pol 2000; 47: 1093-1105. 3. Bièche I i wsp. Reverse transcriptase-PCR quantification of mRNA levels from cytochrome (CYP)1, CYP2 and CYP3 families in 22 different human tissues. Pharmacogenet Genomics 2007; 17: 731-742. 4. Wogan GN i wsp. Environmental and chemical carcinogenesis. Semin Cancer Biol 2004; 14: 473-486. 5. Moon YJ, Wang X, Morris ME. Dietary flavonoids: effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicol In Vitro 2006; 20: 187-210. 6. Cederbaum AI. Cytochrome P450 2E1-dependent oxidant stress and upregulation of anti-oxidant defense in liver cells. J Gastroenterol Hepatol 2006; 21 (Suppl 3): 22-25. 7. Jimenez-Lopez JM, Cederbaum AI. CYP2E1-dependent oxidative stress and toxicity: role in ethanol-induced liver injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2005; 1: 671-685. 8. Cederbaum AI. CYP2E1 - biochemical and toxicological aspects and role in alcohol-induced liver injury. Mt Sinai J Med 2006; 73: 657-672. 9. Yeldandi AV, Rao MS, Reddy JK. Hydrogen peroxide generation in peroxisome proliferator-induced oncogenesis. Mutat Res 2000; 448: 159-177. 10. Amacher DE i wsp. Hepatic microsomal enzyme induction, beta-oxidation, and cell proliferation following administration of clofibrate, gemfibrozil, or bezafibrate in the CD rat. Toxicol Appl Pharmacol 1997; 142: 143-150. 11. Sueyoshi T, Negishi M. Phenobarbital response elements of cytochrome P450 genes and nuclear receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001; 41: 123-143. 12. Zelko I, Negishi M. Phenobarbital-elicited activation of nuclear receptor CAR in induction of cytochrome P450 genes. Biochem Biophys Res Commun 2000; 277: 1-6. 13. Kemper B. Regulation of cytochrome P450 gene transcription by phenobarbital. Prog Nucl Acid Res Mol Biol 1998; 61: 25-64. 14. Matsuda T i wsp. Induction of CYP isoenzymes in various organs of rats by 3-methylcholanthrene or β-naphthoflavone. Cancer Lett 1995; 97: 137-143. 15. Lupp A i wsp. Transplantation of fetal liver tissue suspension into the spleens of adult syngenic rats: inducibility of cytochrome P450 dependent monooxygenase functions by beta-naphthoflavone, phenobarbital and dexamethasone. Exp Toxicol Pathol 1999; 51: 65-74. 16. Muller D, Gloockner R, Rost M. Monooxygenation, cytochrome P4501A1 and P4501A1-mRNA in rat liver slices exposed to beta-naphthoflavone and dexamethasone in vitro. Exp Toxic Pathol 1996; 48: 433-438. 17. Hulla JE, Juchau MR. Developmental aspects of P450IIIA: prenatal activity and inducibility. Drug Metab Rev 1989; 20: 765-779. 18. LeCluyse EL. Pregnane X receptor: molecular basis for species differences in CYP3A induction by xenobiotics. Chem Biol Interact 2001; 134: 283-289. 19. Agrawal AK, Shapiro BH. Differential expression of gender-dependent hepatic isoforms of cytochrome P-450 by pulse signals in the circulating masculine episodic growth hormone profile of the rat. J Pharmacol Exp Ther 2000; 292: 228-237. 20. Jones SA i wsp. The pregnane X receptor: a promiscuous xenobiotic receptor that has diverged during evolution. Mol Endocrinol 2000; 14: 27-39. 21. Achmer DE, Schomaker SJ. Ethylomorphine Ndemethylase activity as a marker for cytochrome P450 CYP3A activity in rat hepatic microsomes. Toxicol Lett 1998; 94: 115-125. 22. Plewka A i wsp. Circadian changes of cytochrome P-450 -dependent monooxygenase system in the rat liver. Pol J Pharmacol Pharm 1992; 44: 655-661. 23. Czekaj P i wsp. Daily and circadian rhythms in the activity of mixed function oxidases system in rats of different age. Biol Rhythm Res 1994; 25: 67-75. 24. Dallner G. Isolation of rough and smooth microsomes general. Methods Enzymol 1974; 32: 191-215. 25. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-685. 26. Plewka A i wsp. Wiek jako czynnik modyfikujący profil izoform cytochromu P450 w wątrobie szczura. Farm Przegl Nauk 2009; 12: 15-20. 27. Plewka A, Kamiński M. Wpływ wieku i fenobarbitalu na aktywność wątrobowego układu oksydaz o funkcji mieszanej u szczurów. Folia Med Cracov 1992; 33: 141-154. 28. Plewka A, Plewka D, Kamiński M. Induktorowe modyfikacje poziomu wątrobowego cytochromu P-450 w funkcji wieku szczura. Post Hig Med Dośw 1994; 48: 457-470. 29. Plewka A, Bienioszek M, Plewka D. Changes in the male rat hepatic cytochrome P-450 level, heme oxygenase and δ-aminolevulinic acid synthase activities at various stages of life. Mech Ageing Develop 1994; 74: 79-88. 30. Asoh M i wsp. Induction of hepatic CYP2B in foetal and neonatal rats after maternal administration of phenobarbital. Pharmacol Toxicol 1999; 84: 18-23. 31. Bani M-H i wsp. Modulation of snake hepatic cytochrome P450 by 3-methylcholanthrene and phenobarbital. Comp Biochem Physiol 1998; 119C: 143-148. 32. Hood A, Liu J, Klaassen CD. Effects of phenobarbital, pregnenolone-16alpha-carbonitrile, and propylthiouracil on thyroid follicular cell proliferation. Toxicol Sci 1999; 50: 45-53. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 33. Agrawal AK, Shapiro BE. Phenobarbital induction of hepatic CYP2B1 and CYP2B2: pretranscriptional and post-transcriptional effects of gender, adult age, and phenobarbital dose. Mol Pharmacol 1996; 49: 523-531. 34. Brown SES i wsp. Critical role of extracellular matrix on induction by phenobarbital of cytochrome P450 2B1/2 in primary cultures of adult rat hepatocytes. Lab Invest 1995; 73: 818-827. 35. Mäkinen J i wsp. Modulation of mouse and human phenobarbital-responsive enhancer module by nuclear receptors. Mol Pharmacol 2002; 62: 366-378. 36. Meredith C i wsp. Studies on the induction of rat hepatic CYP1A, CYP2B, CYP3A and CYP4A subfamily form mRNAs in vivo and in vitro using precision-cut rat liver slices. Xenobiotica 2003; 33: 511-527. 37. Sueyoshi T, Negishi M. Phenobarbital response elements of cytochrome P450 genes and nuclear receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001; 41: 123-143. 38. Kawamoto T i wsp. Phenobarbital-responsive nuclear translocation of the receptor CAR in induction of the CYP2B gene. Mol Cell Biol 1999; 19: 6318-6322. 39. Waxman DJ, Azaroff L. Phenobarbital induction of cytochrome P-450 gene expression. Biochem J 1992; 281: 577-592. 40. Ejiri N, Katayama K, Doi K. Induction of cytochrome P450 isozymes by phenobarbital in pregnant rat and fetal livers and placenta. Exp Mol Pathol 2005; 78: 150-155. 41. Ejiri N i wsp. Microarray analysis on CYPs expression in pregnant rats after treatment with pregnenolone-16alpha-carbonitrile and phenobarbital. Exp Mol Pathol 2005; 78: 71-77. 42. Schilter B i wsp. Activation of cytochrome P450 gene expression in the rat brain by phenobarbital-like inducers. J Pharmacol Exp Ther 2000; 294: 916-922. 43. Klinger W i wsp. Cytochrome P450 (P450) isoforms expression, P450 concentration, monooxygenase activities, reactive oxygen species format ion, lipid peroxidation, and glutathione content in wild catch carp and tench liver-influence of a two weeks exposure to phenobarbital. Exp Toxicol Pathol 2001; 52: 513-522. 44. Shapiro BH i wsp. Growth hormone-dependent and -independent sexually dimorphic regulation of phenobarbital-induced hepatic cytochromes P450 2B1 and 2B2. Archiv Biochem Biophys 1994; 312: 234-239. 45. Ganem LG i wsp. Phenobarbital induction of CYP2B1/2 in primary hepatocytes: endocrine regulation and evidence for a single pathway for multiple inducers. Toxicol Appl Pharmacol 1999; 155: 32-42. 46. Aubrecht J i wsp. Differential induction of mRNA expeession of cytochromes P450 (CYP2B1 and CYP1A1/2) by metyrapone in primary rat hepatocyte cultures. Res Commun Mol Pathol Pharm 1996; 94: 47-61. 47. Marc N i wsp. Regulation of phenobarbital induction of the cytochrome P450 2b9/10 genes in primary mouse hepatocyte culture. Involvement of calcium- and cAMP-dependent pathways. Eur J Biochem 2000; 267: 963-970. 48. Sidhu JS, Omiecinski CJ. cAMP-associated inhibition of phenobarbital-inducible cytochrome P450 gene expression in primary rat hepatocyte cultures. J Biol Chem 1995; 270: 12762-1273. 49. Johnson TN, Tanner MS, Tucker GT. A comparison of the ontogeny of enterocytic and hepatic cytochromes P450 3A in the rat. Biochem Pharmacol 2000; 60: 1601-1610. 50. Johnson TN, Tanner MS, Tucker GT. Developmental changes in the expression of enterocytic and hepatic cytochromes P4501A in rat. Xenobiotica 2002; 32: 595-604. 51. Plewka A, Plewka D. Evaluation of activity of cytochrome P-450-dependent monooxygenase system induced by β-naphthoflavone or dexamethasone in rats at different ages. Age 1995; 18: 159-165. 52. Kawajiri K, Fujii-Kuriyama Y. Cytochrome P450 gene regulation and physiological functions mediated by the aryl hydrocarbon receptor. Arch Biochem Biophys 2007; 464: 207-212. 53. Kocarek TA, Reddy AB. Negative regulation by dexamethasone of fluvastatin-inducible CYP2B expression in primary cultures of rat hepatocytes: role of CYP3A. Biochem Pharmacol 1998; 55: 1435-1443. 54. Pereira TM, Lechner MC. Differential regulation of the cytochrome P450 3A1 gene transcription by dexamethasone in immature and adult rat liver. Eur J Biochem 1995; 229: 171-177. 55. Kim H i wsp. Differential induction of rat hepatic cytochromes P450 3A1, 3A2, 2B1, 2B2, and 2E1 in response to pyridine treatment. Drug Metab Dispos 2001; 29: 353-360. 56. Ushio F i wsp. Differential induction of cytochrome P-450 isozymes by rifampicin in the Chinese hamster, Cricetus griseus. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol 1995; 112: 163-168. 57. Lupp A i wsp. Transplantation of fetal liver tissue suspension into the spleens of adult syngenic rats: effects of beta-naphthoflavone, phenobarbital and dexamethasone on cytochrome P450 isoforms expression and on glycogen storage. Exp Toxicol Pathol 1998; 50: 173183. 58. Akhtar MK, Kelly SL, Kaderbhai MA. Cytochrome b5 modulation of 17-α hydroxylase and 17-20 lyase (CYP17) activities in steroidogenesis. J Endocrinol 2005; 187: 267-274. 59. Fernández-Pérez L i wsp. Steroid binding sites in liver membranes: interplay between glucocorticoids, sex steroids, and pituitary hormones. J Steroid Biochem Mol Biol 2008; 109: 336-343. data otrzymania pracy: 29.01.2010 r. data akceptacji do druku: 24.02.2010 r. Adres do korespondencji: dr hab. Andrzej Plewka adres: Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny, 41-200 Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30 tel.: +48 32 364 14 30 e-mail: [email protected]
