Badanie aktywności katalitycznej immobilizowanych drożdży w

POLITECHNIKA ŚLĄSKA
WYDZIAŁ CHEMICZNY
KATEDRA FIZYKOCHEMII I TECHNOLOGII POLIMERÓW
IMMOBILIZACJA DROŻDŻY ORAZ BADANIE ICH
AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ W PROCESIE FERMENTACJI
Prowadzący:
Agnieszka Śniechota
Miejsce ćwiczenia:
Zakład Chemii Fizycznej, sala 96
LABORATORIUM Z KATALIZY HOMOGENICZNEJ I
HETEROGENICZNEJ
1
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
IMMOBILIZACJA DROŻDŻY ORAZ BADANIE ICH AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ W PROCESIE FERMENTACJI
CEL ĆWICZENIA
I.
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z wybranymi metodami immobilizacji całokomórkowej
w hydrożelach oraz porównanie aktywności enzymów immobilizowanych i nieimmobilizowanych
na przykładzie reakcji fermentacj alkoholowej.
.
II.
WSTĘP, PODSTAWY TEORETYCZNE
Jednym z najprostszych sposobów immobilizacji czynników aktywnych, w tym również
czynników biologicznych jest ich uwięzienie w strukturze nosnika polimerowego, zwane inaczej
pułapkowaniem (ang. Entrapment). Unieruchomiony w ten sposób czynnik aktywny nie tworzy z
polimerem trwałych wiązań chemicznych i utrzymywany jest w nim jedynie ze wzgledu na brak lub
ograniczenie mozliwości wydostania się spomiedzy otaczających go splątanych lub połączonych ze
sobą łańcuchów polimeru do otaczającego środowiska. Ze wzgledów użytkowych takim
połączeniom polimer-czynik aktywny nadaje sie najczęściej postać małych kulek (perełek), rzadziej
postac folii. Czynnikami aktywnymi mającymi zastosowanie w proceach biotechnologiczych są
zwykle enzymy. Zamiast wyodrębnionych enzymów, często stosuje się zdolne do produkcji tych
enzymów całe żywe komórki lub ich aglomeraty, niekiedy również martwe komórki lub ich części
(organele). Immobilizacja fizyczna całych komórek (immobilizacja całokomórkowa) lub ich części
pozwala zwykle ominąć probem stopniowej ucieczki enzymu z polimeru w wyniku powolnej
dyfuzji do otoczenia. Większość procesów biotechnologiczych odbywa się z udziałem fazy wodnej,
w której rozpuszczone są substraty i zwykle również produkty reakcji. W związku z tym knieczna
dyfuzja wody i rozpuszczonych w niej substancji do czynnika biologicznego znajdującego się w
polimerze zachodzi najłatwiej w polimerach hydrofilowych, które ulegają spęcznieniu w wodzie.
Sens immobilizacji wymaga jednak, aby polimery te nie rozpuszczały się w wodzie. Takimi
polimerami sa hydrożele, które w kontakcie z wodą silnie w niej pęcznieją, nie ulegając
rozpuszczeniu i zachowują w przybliżeniu wyjściowy kulisty kształt. Hydrożelami moga być
zarówno polimery syntetyczne jak i pochodzenia naturalnego.
Pęcznienie hydrożeli w wodzie wynika z hydrofilowego charakteru łańcuchów
polimerowych, natomiast ich nierozpuszczalność jest efektem istnienia sił łączących ze sobą te
łańcuchy, co uniemożliwia wniknięcie pomiędzy nie cząsteczek rozpuszczalnika i całkowite
rozdzielenie łańcuchów. Polimery, których łąńcuchy połączone są ze sobą tworząc jedną sieć
nazywane są polimerami usieciowanymi. Hydrożele usieciowane chemicznie można otrzymać m.in.
poprzez usieciowanie istniejącego polimeru hydrofilowego (polymer approach) lub poprzez
1
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
IMMOBILIZACJA DROŻDŻY ORAZ BADANIE ICH AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ W PROCESIE FERMENTACJI
polimeryzację monomerów hydrofilowych z równoczesnymsieciowaniem powstającego polimeru
(monomer aproach). Przykładem pierwszego sposobu otrzymywania hydrożeli jest sieciowanie
rozpuszczonej w wodzie soli sodowej polikwasu karboksylowego kationami wielowartościowymi.
Naturalnymi polimerami tego typu sa alginiany będące polisacharydami zbudowanymi z merów
kwasu β-D-mannurowego i kwasu α-L-guluronowego połączonych w położeniu 1,4. Częściowa
wymiana kationów jednowartościowych na wielowartościowe, np. wapniowe, powoduje, że
fragmenty łąńcuchówpolimeru zostaja ze soba połączone, tworzą agregaty i obserwuje się
początkowo wzrost lepkości a przy dalszym zwiększaniu stężenia jonów wapniowych zanik
rozpuszczalności – żelowanie i wytrącanie polimeru. Proces jest szybki, na powierzchni kropli
roztworu alginianu wpadającej do roztworu chlorku wapnia natychmiast tworzy się warstwa
polimeru
zżelowanego
uniemożliwiająca
sklejenie
się
poszczególnych
kropel.
Dalsze
pozostawienie w roztworze chlorku wapnia powoduje, że żelowanie postępuje wgłąb kropli.
Umieszczenie materiału biologicznego w roztworze alginianu powoduje, że po wkropleniu i
usieciowaniu polimeru pozostaje on w powstałej kulce żelu. Ze względu na łagodne warunki
metoda ta nadaje się szczególnie do immobilizacji zywych komórek.
Przykładem otrzymywania hydrożelu na drodze polimeryzacji monomerów z równoczesnym sieciowaniem jest
kopolimeryzacja akryloamidu z monomerem difunkcyjnym –
N,N’-metylenobisakryloamidem. Poprzez zmianę gęstości usieciowania można kontrolować
równowagową zawartość wody w otrzymanym hydrożelu. W wyniku polimeryzacji zachodzącej w
roztworze wodnym otrzymuje się blok hydrożelu. Zdyspergowanie wodnego roztworu monomerów
i inicjatora w niepolarnym rozpuszczalniku organicznym pozwala otrzymać zawiesinę kulistych
cząstek hydrożelu.
Fermentacja
alkoholowa
to
proces
rozkładu
węglowodanów pod wpływem enzymów wytwarzanych
przez drożdże z wytworzeniem alkoholu etylowego i
dwutlenku węgla. Istota fermentacji alkoholowej polega na
przemianie, pod wpływem drożdży, cukru na alkohol i
dwutlenek węgla:
C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2
W wyniku tego procesu powstaje również szereg produktów
ubocznych, między innymi: gliceryna, kwas bursztynowy i
kwas octowy, wyższe alkohole i estry. Miarą aktywności
drożdży w procesie fermentacji może być pomiar objętości wydzielonego CO2.
2
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
IMMOBILIZACJA DROŻDŻY ORAZ BADANIE ICH AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ W PROCESIE FERMENTACJI
III.
WYKONANIE ĆWICZENIA
Aparatura
• Zlewki: 600 cm3, 250 cm3,
• Kolba okrągłodenna 250 cm3,
• Mieszadło magnetyczne,
• Wkraplacz,
• Biureta,
• Parownica,
• Naczyńka wagowe,
• Bagietka szklana,
• Cylider miarowy,
• Zestaw do sączenia,
Odczynniki
• Drożdże,
• Cukier (sacharoza),
• Kwaśny fosforan amonu,
• Chlorek wapnia,
• Alginian sodu
Wykonanie ćwiczenia
Immobilizacja drożdży w alginianie wapnia
W zlewce o pojemności 600 ml sporządzić 200 ml 0.25 M roztworu CaCl2 (r-r A). W
drugiej zlewce o poj. 250 ml sporządzić 100 ml 2 % roztworu alginianu sodu (r-r B). Po
całkowitym rozpuszczeniu sie alginianu do r-ru B dodać 5.1 g drożdży i dokładnie je zdyspergować
(r-r C). Zlewkę z r-r A umieścić na mieszadle magnetycznym. Następnie włączyć mieszadło i do
mieszającego się roztworu powoli wkroplić r-r C. Po zakończeniu wkraplania całość mieszać
jeszcze przez 20 minut. Otrzymane granulki odsączyć i 3-krotnie przemyć wodą destylowaną.
3
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
IMMOBILIZACJA DROŻDŻY ORAZ BADANIE ICH AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ W PROCESIE FERMENTACJI
Badanie aktywności drożdży
W zlewce o poj. 250 cm3 rozpuścić 2 g drożdży w 100 cm3 wody destylowanej. W drugiej
zlewce o poj. 250 cm3 rozpuścić 8 g cukru i 0.4 g fosforanu amonu w 100 cm3 wody destylowanej.
Oba przygotowane roztwory wlać do kolby okrągłodennej z zestawu do mierzenia objętości
wydzielonego CO2. W przypadku badania aktywności drożdży immobilizowanych zamiast
zawiesiny drożdży zmieszać z r-rem cukru 40 g granulek alginianu wapnia. Po 10 minutach od
umieszczeniu drożdży w kolbie i zmontowaniu reszty zestawu do pomiaru objętości wydzielonego
CO2 (okres inkubacji) rozpocząć pomiary wydzielonego gazu. Pomiary wykonywać co 10 minut
przez okres 120 min. W wypadku dużej ilości wydzielonego gazu, większej niż pojemność biurety,
bezpośrednio po odczycie zamknąć dopływ CO2 z kolby, wypuścić zebrany gaz z biurety i
kontynuować dalej pomiar.
IV.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Wyniki pomiarów zebrać w tabeli 1.
Tabela 1. Wyniki eksperymentów i obliczeń
Lp
Czas [min]
Objętość CO2 [cm3] Lp
Czas [min]
Objętość CO2 [cm3]
Na podstawie uzyskanych wyników wykonać wykres objętości wydzielonego CO2 w funkcji czasu
reakcji dla drożdży nieimmobilizowanych oraz immobilizowanych w alginianie wapnia na
załączonym w instrukcji szablonie. W zależności od ilości wydzielonego gazu odpowiednio
wyskalować i opisać osie wykresu. Na podstawie sporządzonych wykresów wyznaczyć wartość
stałej Michaelisa dla badanych reakcji enzymatycznych.
V.
ZAGADNIENIA TEORETYCZNE
•
Immobilizacja czynników aktywnych
•
Hydrożele
•
Kinetyka reakcji enzymatycznych (równanie Michaelisa-Mentena, stała Michaelisa,
wykresy: Lineweavera-Burka, Hanesa-Woolfa, Eadie-Hofstee’a)
•
Fermentacja alkoholowa
4
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
IMMOBILIZACJA DROŻDŻY ORAZ BADANIE ICH AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ W PROCESIE FERMENTACJI
VI.
LITERATURA
1. Kafarski P., Lejczak B., Chemia Bioorganiczna, PWN, Warszawa 1994.
2. D. Voet, J. G. Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons 1999
3. Leskovac, V. Comprehensive enzyme kinetics. Kluwer. 2004.
4. Marangoni, A. G. Enzyme kinetics: a modern approach, Wiley-Intersc. 2003.
5. Chmiel, A. Biotechnologia; podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN. 1998.
6. W. P. Jencks, Catalysis in chemistry and enzymology, Dover Publications. 1987
5
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
IMMOBILIZACJA DROŻDŻY ORAZ BADANIE ICH AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ W PROCESIE FERMENTACJI
Objętość wydzielonego CO2 [cm3]
Wykres aktywności drożdży w procesie fermentacji alkoholowej
Czas [min]
6
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com